Name: in vitro model of coronary angiogenesis
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00
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Los autores agradecen a los miembros del laboratorio de Sharma por proporcionar un entorno de investigación de apoyo. Nos gusta dar las gracias especiales a Diane (Dee) R. Hoffman, que mantiene y cuida de nuestra colonia de ratones. También nos gustaría dar las gracias a los doctores Philip J. Smaldino y Carolyn Vann por revisar a fondo el manuscrito y proporcionar comentarios útiles. Este trabajo fue apoyado por fondos de Ball State University Provost Office y Department of Biology a B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant fondos a B.S, y NIH (RO1-HL128503) y The New York Stem Cell Foundation fondos a K.R.

El uso de todos los animales en este protocolo siguió las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Ball (IACUC).
1. Establecimiento de criadores de ratón y detección de tapones vaginales para embarazos cronometrados
<ol><li>Establecer una jaula de cría de ratones con ratones machos y hembras de tipo salvaje. Asegúrese de que la edad de los ratones reproductores es entre 6-8 semanas. Preparar un par (1 macho y 1 hembra) o como un tr?...

<ol>
	<li>Red-Horse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis.">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li><li>Volz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+progenitors+for+coronary+artery+smooth+muscle.">Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+and+aortic+cardiomyocytes+guide+coronary+artery+stem+development.">VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).</li><li>Chang, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DACH1+stimulates+shear+stress-guided+endothelial+cell+migration+and+coronary+artery+growth+through+the+CXCL12-CXCR4+signaling+axis.">DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis.</a> Genes and Development. , (2017).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+Cells+Form+the+Coronary+Arteries+by+Angiogenesis+through+Myocardial-Endocardial+VEGF+Signaling.">Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Katz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+compartments+of+the+proepicardial+organ+give+rise+to+coronary+vascular+endothelial+cells.">Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).</li><li>Das, S., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cellular plasticity in cardiovascular development and disease.</a> Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).</li><li>Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+Development:+Progenitor+Cells+and+Differentiation+Pathways.">Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways.</a> Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).</li><li>Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+developmental+program+of+coronary+angiogenesis.">Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis.</a> Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia.">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).</li><li>Ruhrberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+patterning+cues+provided+by+heparin-binding+VEGF-A+control+blood+vessel+branching+morphogenesis.">Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis.</a> Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).</li><li>Kikuchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antiangiogenic+isoform+of+VEGF-A+contributes+to+impaired+vascularization+in+peripheral+artery+disease.">An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).</li><li>Folkman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+tumor+factor+responsible+for+angiogenesis.">Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).</li><li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+VEGF+in+the+regulation+of+physiological+and+pathological+angiogenesis.">The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis.</a> Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).</li><li>Ferrara, N., Bunting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor,+a+specific+regulator+of+angiogenesis.">Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).</li><li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Progenitor+Cells+Compensate+to+Rebuild+the+Coronary+Vasculature+in+Elabela-+and+Apj-Deficient+Hearts.">Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts.</a> Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).</li><li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+deletion+of+Ino80+disrupts+coronary+angiogenesis+and+causes+congenital+heart+disease.">Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease.</a> Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).</li></ol>

Algunos de los pasos más críticos para el crecimiento con éxito de los vasos coronarios de los tejidos progenitores SV y Endo son: 1) Identificar y aislar correctamente el tejido SV para el cultivo de SV; 2) el uso de ventrículos de embriones entre las edades de e11-11,5 para un cultivo preciso de Endo; 3) mantener condiciones estériles durante todo el período de disección y mantener los tejidos fríos en todo momento; y 4) mantener los explantes unidos a la membrana recubierta de ECM para evitar que el tejido flo...

Los vasos sanguíneos del corazón se denominan comúnmente vasos coronarios. Estos vasos se componen de arterias, venas y capilares. Durante el desarrollo, los capilares altamente ramificados se establecen primero, que luego se remodelan en arterias coronarias y venas1,2,3,4,5. Estos capilares iniciales se construyen a partir de células progenitoras endoteliales que se encuentran en los tejidos proepicardium, sinus venosus (SV) y endocardio (Endo)1,6,7,8. SV es el órgano de entrada del corazón embrionario y Endo es el revestimiento interno del lumen del corazón. Las células progenitoras endoteliales que se encuentran en el SV y Endo construyen la mayoría de la vasculatura coronaria, mientras que el propicaredium contribuye a una porción relativamente pequeña de ella2. El proceso por el cual la red capilar de los vasos coronarios crece en el corazón a partir de sus células precursoras preexistentes se llama angiogénesis coronaria. La enfermedad de las arterias coronarias es una de las principales causas de muerte en todo el mundo y, sin embargo, falta un tratamiento eficaz para esta enfermedad. Comprender los mecanismos celulares y moleculares detallados de la angiogénesis coronaria puede ser útil para diseñar terapias novedosas y eficaces para reparar y regenerar las arterias coronarias dañadas.
Recientemente, un aumento en nuestra comprensión de cómo se desarrollan los vasos coronarios se ha logrado en parte a través del desarrollo de nuevas herramientas y tecnologías. En particular, el etiquetado del linaje in vivo y las tecnologías avanzadas de imagen han sido muy útiles para descubrir las vías de origen celular y diferenciación de los vasos coronarios9,10,11,12. A pesar de las ventajas de estas herramientas in vivo, existen limitaciones en términos de velocidad, flexibilidad y accesibilidad. Por lo tanto, los sólidos sistemas de modelos in vitro pueden complementar los sistemas in vivo para dilucidar los mecanismos celulares y moleculares de la angiogénesis coronaria de una manera de alto rendimiento.
Aquí, describimos un modelo in vitro de angiogénesis coronaria. Hemos desarrollado un sistema de cultivo explanta in vitro para cultivar vasos coronarios a partir de dos tejidos progenitores, SV y Endo. Con este modelo, mostramos que los cultivos explantadores de tejido in vitro crecen brotes de vasos coronarios cuando son estimulados por medio de crecimiento. Además, los cultivos explantadores crecen rápidamente en comparación con el control cuando son estimulados por el factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A), una proteína angiogénica muy potente. Además, encontramos que los brotes angiogénicos del cultivo SV sufren desdiferencia venosa (pérdida de la expresión COUP-TFII), un mecanismo similar a la angiogénesis SV in vivo1. Estos datos sugieren que el sistema de cultivo explanta in vitro restablece fielmente los eventos angiogénicos que se producen in vivo. Colectivamente, los modelos in vitro de angiogénesis que se describen aquí son ideales para sondear los mecanismos celulares y moleculares de la angiogénesis coronaria de una manera accesible y de alto rendimiento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 x 20 MM Tissue Culture Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>877222</td>
			<td>Referred in the protocol as Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.0 uM PET membrane culture inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MCEP24H48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rat 488</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled Metal Probe</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10088-15</td>
			<td>Angled 45 degree, used for detecting deep plugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- ERG 1/2/3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab92513</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- VE-Cadherin antibody</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB550548</td>
			<td>Primary antibody, manufacturer BD BioSciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas tank</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13998223</td>
			<td>For 37 &#176;C, 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereomicrosope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Leica S9i Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial cell growth basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Commercially known as Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Singlequots Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td>Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003IR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiJi</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>Image processing software (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads" target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Used for embryo dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Straight-Blade operating scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-808-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH-302-5601LR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>various models available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Vectashield with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy/Fisher</td>
			<td>50-980-494</td>
			<td>This is available at 32%; needs to be diluted to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td>Useful in removing embryo/tissues from a solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine VEGF-A 165</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps, Dumont #5</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Mouse/Rat chamber</td>
			<td>Easysysteminc</td>
			<td>EZ-1785</td>
			<td>Euthanasia chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of coronary angiogenesis

Aquí, describimos un ensayo de cultivo in vitro para estudiar la angiogénesis coronaria. Los vasos coronarios alimentan el músculo cardíaco y son de importancia clínica. Los defectos en estos vasos representan riesgos graves para la salud, como en la aterosclerosis, que puede provocar infartos de miocardio e insuficiencias cardíacas en los pacientes. En consecuencia, la enfermedad de las arterias coronarias es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. A pesar de su importancia clínica, se ha avanzado relativamente poco en cómo regenerar las arterias coronarias dañadas. Sin embargo, se han realizado progresos recientes en la comprensión del origen celular y las vías de diferenciación del desarrollo de los vasos coronarios. El advenimiento de herramientas y tecnologías que permiten a los investigadores etiquetar fluorescentemente las células progenitoras, seguir su destino y visualizar progenies in vivo han sido fundamentales para entender el desarrollo de los vasos coronarios. Los estudios in vivo son valiosos, pero tienen limitaciones en términos de velocidad, accesibilidad y flexibilidad en el diseño experimental. Alternativamente, los modelos in vitro precisos de la angiogénesis coronaria pueden eludir estas limitaciones y permitir a los investigadores interrogar cuestiones biológicas importantes con rapidez y flexibilidad. La falta de sistemas modelo in vitro adecuados puede haber obstaculizado el progreso en la comprensión de los mecanismos celulares y moleculares del crecimiento de los vasos coronarios. Aquí, describimos un sistema de cultivo in vitro para cultivar vasos coronarios a partir del sinusuvenosus (SV) y el endocardio (Endo), los dos tejidos progenitores de los que surgen muchos de los vasos coronarios. También confirmamos que las culturas recapitulan con precisión algunos de los mecanismos in vivo conocidos. Por ejemplo, mostramos que los brotes angiogénicos en cultivo a partir de SV downregulate EXPRESIÓN COUP-TFII similar a lo que se observa in vivo. Además, demostramos que el VEGF-A, un conocido factor angiogénico in vivo, estimula de forma robusta la angiogénesis de las culturas SV y Endo. Colectivamente, hemos ideado un modelo de cultivo in vitro preciso para estudiar la angiogénesis coronaria.

Una de las características más llamativas de la angiogénesis SV in vivo es que sigue una vía específica e implica eventos de desdiferencia celular y rediferenciación que ocurren en momentos estereotipados y posiciones1. A medida que las células SV iniciales crecen sobre el ventrículo cardíaco, dejan de producir marcadores venosos como COUP-TFII(Figura 7). Posteriormente, los brotes coronarios toman dos caminos de migración, y...

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In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

Los modelos in vitro de angiogénesis coronaria se pueden utilizar para el descubrimiento de los mecanismos celulares y moleculares de la angiogénesis coronaria. Cultivos explantados in vitro de tejidos sinusales venosos y endocardio muestran un crecimiento robusto en respuesta al VEGF-A y muestran un patrón similar de expresión COUP-TFII como in vivo.

Modelo In Vitro de Angiogénesis Coronaria

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Nuestro protocolo es significativo porque permite a los investigadores investigar el mecanismo molecular de la angiogénesis coronaria fuera de un organismo. La principal ventaja de esta técnica es que modela con precisión el proceso de angiogénesis coronaria dentro de un organismo, facilitando el estudio de los mecanismos de la angiogénesis coronaria. Comience por rociar un ratón embarazada llevando embriones embrionarios del día 11,5 con 70%etanol.Levantar la piel sobre el vientre con fórceps, utilizar tijeras para hacer una piel abdominal y la incisión peritoneal lateralmente y antes hasta el diafragma para exponer el cuerno uterino. Agarrar el útero, cortar el tejido libre y sacar el cuerno uterino. Coloque la cadena de embriones en PBS estéril frío bajo un microscopio estéreo y despegue el músculo uterino, el saco de yema y la cubierta de amnion de cada embrión.A medida que cada embrión está aislado, utilice una cuchara perforada para transferir los tejidos a un nuevo plato de Petri que contenga PBS estéril en hielo. Para cosechar el tejido cardíaco embrionario, transfiera el primer embrión que se diseccione a una nueva placa Petri bajo el microscopio, y coloque el embrión en el lado ventral hacia arriba. Utilice fórceps finos para hacer una pequeña incisión en el pecho, ligeramente por encima del diafragma, e inserte los fórceps cerrados en la incisión para agrandar la incisión.Usando los fórceps para mantener la pared torácica abierta para exponer el corazón y los pulmones, usa un segundo par de fórceps para mover suavemente el corazón antes de 90 grados para exponer la aorta dorsal y la vena. Luego, agarrando estos vasos en la base del corazón, saca cuidadosamente el corazón y los pulmones antes y enjuaga los tejidos con PBS frío. Cuando se haya cosechado todo el tejido cardíaco, coloque las muestras del corazón bajo el microscopio y retire los lóbulos pulmonares de cada corazón.Orientar el primer corazón en su lado dorsal, y sosteniendo el corazón en su base, utilizar fórceps finos para raspar las aurículas izquierda y derecha en el tejido adyacente que rodea el SV desde el corazón. Para aislar el SV, oriente el lado dorsal del corazón hacia arriba. Retire cuidadosamente el SV del corazón y utilice una pipeta de transferencia estéril para colocar el tejido aislado en una nueva placa Petri de seis centímetros que contenga PBS estéril con hielo.Para aislar todo el ventrículo, retire el tracto de salida y utilice una nueva pipeta de transferencia estéril para colocar los ventrículos en un plato separado de seis centímetros de Petri que contenga PBS estéril de hielo estéril en hielo. Para configurar cultivos de SV y ventrículos enteros, primero recubre las membranas de un inserto de cultivo PET de poro de ocho micrómetros por pozo de una placa de cultivo de 24 pozos, con 100 microlitros de matriz extracelular recién diluida por cultivo durante al menos 30 minutos a 37 grados Centígrados. Cuando la matriz se haya solidificado, utilice una pipeta de transferencia para transferir una plantación a cada plaquita y mueva la placa debajo del microscopio.Usando fórceps limpios, coloque los explantes en el centro de cada plaquita para asegurarse de que no estén unidos a las paredes laterales, y retire cuidadosamente cualquier PBS adicional. A continuación, transfiera la placa con la tapa cerrada bajo una campana de cultivo de tejido de flujo laminar, y agregue 100 microlitros de medio completo precalentó a cada inserción, y 200 microlitros al pozo por debajo de cada plaquita. Luego agregue 300 microlitros de PBS a cualquier pozo no utilizado, y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante cinco días.Para el tratamiento con VEGF-A en el segundo día de cultivo, retire el medio de ambas cámaras de cada cultivo y agregue 100 microlitros de PBS a cada inserción, y 200 microlitros de PBS a cada pozo. Después de agitar la placa un par de veces, reemplace el PBS con 300 microlitros de medio basal complementados con 1%suero bovino fetal para iniciar los cultivos, y devuelva la placa a la incubadora. En el tercer día después de la inanición, añadir 300 microlitros de medio basal fresco más suero a los pozos de control y medio basal más 50 nanogramos por mililitro de VEGF-A a los pozos de tratamiento, y devolver la placa a la incubadora de cultivo celular.En el sexto día de cultivo, lave las cámaras con PBS como se ha demostrado, y fije los cultivos con 200 microlitros de 4%paraformaldehído en cada pozo, y 100 microlitros de fijador en cada plaquita. Después de 20 minutos a 4 grados centígrados con balanceo, lave los cultivos con 300 microlitros de PBS durante 10 minutos por lavado con balanceo a temperatura ambiente. Después del último lavado, añadir 300 microlitros de solución de anticuerpos primarios a los pozos e inserciones para un cultivo nocturno a cuatro grados centígrados con balanceo.A la mañana siguiente, lave los cultivos 10 veces en tensioactivo no iónico en PBS con balanceo, cambiando la solución de lavado cada 10 minutos antes de etiquetar los cultivos con 300 microlitros de un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado a cuatro grados Celsius durante la noche con balanceo. Al día siguiente, lave los cultivos 10 veces en PBS fresco con tensioactivo no iónico como se demuestra. Después del último lavado, utilice fórceps finos para pelar cuidadosamente la membrana de cada plaquita y colocar las membranas en diapositivas individuales del microscopio de vidrio, explanar hacia arriba.Cubra las muestras con un medio de montaje complementado con DAPI en un resbalón de cubierta, y selle los bordes de los resbalones de la cubierta con esmalte de uñas transparente. Cuando el esmalte de uñas se haya secado, imagine las diapositivas por microscopía confocal. A medida que las células SV iniciales crecen sobre el ventrículo cardíaco, dejan de producir marcadores venosos como Coup-TF2.Después de cinco días de cultivo, las células endoteliales SV brotan y migran a la membrana. Al igual que en el corazón embrionario, la expresión de Coup-TF2 se reduce a medida que los vasos migran lejos del SV. Cultivos estimulados con VEGF-A exhiben un mayor crecimiento de brotes angiogénicos tanto en densidad como en longitud. Otros cultivos de SV estimulados por VEGF-A demuestran un aumento casi tres veces en la longitud del brote en comparación con los controles, lo que sugiere que los brotes endoteliales de SV y endocardio responden al VEGF-A.Es importante no perder el tejido SV mientras saca el corazón y los pulmones, extirpa las aurículas y limpia el tejido adyacente que rodea la SV. Se pueden realizar experimentos de imágenes en vivo para visualizar la angiogénesis coronaria y capturar los detalles de la dinámica celular y molecular durante el proceso. Esta técnica es extremadamente útil para evaluar los mecanismos moleculares potenciales de la angiogénesis coronaria y como un sistema modelo para el estudio de la angiogénesis en general.

Research

JoVE Journal

Medicine

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Ligadura de las arterias coronarias y la inyección intramiocárdica en un modelo murino de infarto

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Investigación

Medicina

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

Un modelo de ratón de la Prueba de bolsillo para el Estudio de la angiogénesis de córnea

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Multimodal de imágenes de la angiogénesis en un modelo de rata desnuda de las metástasis óseas del cáncer de pecho utilizando imágenes de resonancia magnética, tomografía computarizada y la ecografía volumétrica

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

La angiogénesis en el pulmón de rata isquémico

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Desprendimiento de Retina modelo en roedores por inyección subretiniana de Hialuronato de Sodio

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Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

Microscopia intravital de monocito autoguiado hacia el blanco y la angiogénesis tumorales en un modelo murino de la enfermedad Arterial periférica

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Evaluación de la angiogénesis terapéutica en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...