Name: in vitro model of coronary angiogenesis
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Coronary Angiogenesis at JoVE.com

Författarna tackar medlemmarna i Sharma laboratorium för att ge en stödjande forskningsmiljö. Vi vill framföra särskilt tack till Diane (Dee) R. Hoffman som underhåller och bryr sig om vår muskoloni. Vi vill också tacka Drs. Philip J. Smaldino och Carolyn Vann för grundligt korrekturläsning manuskriptet och ge användbara kommentarer. Detta arbete stöddes av medel från Ball State University Provost Office och Institutionen för biologi till BS, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant medel till BS, och NIH (RO1-HL128503) och The New York Stem Cell Foundation medel till KR

Användning av alla djur i detta protokoll följde Ball State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) riktlinjer.
1. Upprätta nde av musuppfödare och upptäcka vaginala pluggar för tidstidsförda graviditeter
<ol><li>Ställ in en musavelsbur med vilda djur- och honmöss. Se till att uppfödningsmössens ålder är mellan 6-8 veckor. Ställ upp antingen ett par (1 hane och 1 hona) eller som en trio (1 hane och 2 hona) för avel.</li>
	<li>Kontrollera om det finns en ...

<ol>
	<li>Red-Horse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis.">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li><li>Volz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+progenitors+for+coronary+artery+smooth+muscle.">Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+and+aortic+cardiomyocytes+guide+coronary+artery+stem+development.">VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).</li><li>Chang, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DACH1+stimulates+shear+stress-guided+endothelial+cell+migration+and+coronary+artery+growth+through+the+CXCL12-CXCR4+signaling+axis.">DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis.</a> Genes and Development. , (2017).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+Cells+Form+the+Coronary+Arteries+by+Angiogenesis+through+Myocardial-Endocardial+VEGF+Signaling.">Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Katz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+compartments+of+the+proepicardial+organ+give+rise+to+coronary+vascular+endothelial+cells.">Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).</li><li>Das, S., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cellular plasticity in cardiovascular development and disease.</a> Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).</li><li>Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+Development:+Progenitor+Cells+and+Differentiation+Pathways.">Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways.</a> Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).</li><li>Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+developmental+program+of+coronary+angiogenesis.">Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis.</a> Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia.">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).</li><li>Ruhrberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+patterning+cues+provided+by+heparin-binding+VEGF-A+control+blood+vessel+branching+morphogenesis.">Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis.</a> Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).</li><li>Kikuchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antiangiogenic+isoform+of+VEGF-A+contributes+to+impaired+vascularization+in+peripheral+artery+disease.">An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).</li><li>Folkman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+tumor+factor+responsible+for+angiogenesis.">Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).</li><li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+VEGF+in+the+regulation+of+physiological+and+pathological+angiogenesis.">The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis.</a> Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).</li><li>Ferrara, N., Bunting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor,+a+specific+regulator+of+angiogenesis.">Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).</li><li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Progenitor+Cells+Compensate+to+Rebuild+the+Coronary+Vasculature+in+Elabela-+and+Apj-Deficient+Hearts.">Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts.</a> Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).</li><li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+deletion+of+Ino80+disrupts+coronary+angiogenesis+and+causes+congenital+heart+disease.">Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease.</a> Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).</li></ol>

Några av de mest kritiska stegen för att framgångsrikt odla kranskärl från SV- och Endo-stamtonet är: 1) Korrekt identifiera och isolera SV-vävnaden för SV-kultur; 2) Användning av ventriklar från embryon i åldern e11−11.5 för exakt Endo-kultur; 3) upprätthålla sterila förhållanden under hela dissekeringsperioden och hålla vävnaderna kalla hela tiden; och 4) hålla explantorna fästa vid ECM-belagda membranet för att undvika att vävnaden flyter i mediet.
För det första ...

Blodkärl i hjärtat kallas vanligen kranskärl. Dessa fartyg består av artärer, åder och kapillärer. Under utvecklingen, mycket grenade kapillärer upprättas först, som sedan omforma till kranskärl och vener1,2,3,4,5. Dessa inledande kapillärer är byggda av endotelstamceller som finns i proepikardium, sinus venosus (SV) och endokarium (Endo) vävnader1,6,7,8. SV är inflödesorganet i embryonala hjärta och Endo är hjärtats innerslemhinna. Endotelstamceller som finns i SV och Endo bygger majoriteten av koronarvaskulatur, medan proepikardium bidrar till en relativt liten del av det2. Den process genom vilken kapillärnätverket av kranskärl växer i hjärtat från sina befintliga prekursorceller kallas koronar angiogenes. Kranskärlssjukdom är en av de vanligaste dödsorsakerna i världen och ändå saknas en effektiv behandling för denna sjukdom. Förstå detaljerade cellulära och molekylära mekanismer av koronar angiogenes kan vara användbart för att utforma nya och effektiva terapier för att reparera och regenerera skadade kranskärl.
På senare tid har en ökning av vår förståelse av hur koronarfartyg utvecklas delvis uppnåtts genom utveckling av nya verktyg och tekniker. I synnerhet har in vivo härstamningsmärkning och avancerad bildteknik varit mycket användbar för att upptäcka cellulära ursprung och differentieringsvägar för kranskärl9,10,11,12. Trots fördelarna med dessa in vivo-verktyg finns det begränsningar när det gäller snabbhet, flexibilitet och tillgänglighet. Därför kan robusta in vitro-modellsystem komplettera in vivo-system för att belysa de cellulära och molekylära mekanismerna för koronar angiogenes på ett höggenomströmningssätt.
Här beskriver vi en in vitro-modell av koronar angiogenes. Vi har utvecklat ett in vitro-odlingsodlingssystem för att odla födanskärl från två stamtorvävnader, SV och Endo. Med denna modell visar vi att in vitro-vävnaden explant kulturer växa koronar kärl groddar när stimuleras av tillväxtmedium. Dessutom växer explanta kulturer snabbt jämfört med kontroll när stimuleras av vaskulär endotel tillväxtfaktor A (VEGF-A), en mycket potent angiogenic protein. Dessutom fann vi att angiogengroddar från SV-kulturen genomgår venös dedifferentiering (förlust av COUP-TFII uttryck), en mekanism som liknar SV angiogenes in vivo1. Dessa uppgifter tyder på att in vitro explant kultursystemet troget återinför angiogenic händelser som invivo. Kollektivt, in vitro modeller av angiogenes som beskrivs här är idealiska för sondering cellulära och molekylära mekanismer för koronar angiogenes på ett hög genomströmning och tillgängligt sätt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 x 20 MM Tissue Culture Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>877222</td>
			<td>Referred in the protocol as Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.0 uM PET membrane culture inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MCEP24H48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rat 488</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled Metal Probe</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10088-15</td>
			<td>Angled 45 degree, used for detecting deep plugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- ERG 1/2/3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab92513</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- VE-Cadherin antibody</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB550548</td>
			<td>Primary antibody, manufacturer BD BioSciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas tank</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13998223</td>
			<td>For 37 &#176;C, 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereomicrosope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Leica S9i Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial cell growth basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Commercially known as Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Singlequots Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td>Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003IR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiJi</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>Image processing software (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads" target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Used for embryo dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Straight-Blade operating scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-808-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH-302-5601LR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>various models available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Vectashield with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy/Fisher</td>
			<td>50-980-494</td>
			<td>This is available at 32%; needs to be diluted to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td>Useful in removing embryo/tissues from a solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine VEGF-A 165</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps, Dumont #5</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Mouse/Rat chamber</td>
			<td>Easysysteminc</td>
			<td>EZ-1785</td>
			<td>Euthanasia chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of coronary angiogenesis

Här beskriver vi en in vitro kultur analys för att studera koronar angiogenes. Födans kärl mata hjärtmuskeln och är av klinisk betydelse. Defekter i dessa fartyg utgör allvarliga hälsorisker såsom åderförkalkning, vilket kan leda till hjärtinfarkt och hjärtsvikt hos patienter. Följaktligen är kranskärlssjukdom en av de vanligaste dödsorsakerna i världen. Trots sin kliniska betydelse, relativt lite framsteg har gjorts om hur man regenerera skadade kranskärl. Icke desto mindre har de senaste framstegen gjorts när det gäller att förstå de cellulära ursprung och differentieringsvägarna för utvecklingen av koronarfartyg. Tillkomsten av verktyg och teknik som gör det möjligt för forskare att fluorescerande märka stamceller, följa deras öde, och visualisera stamceller in vivo har varit avgörande för att förstå koronar fartyg utveckling. In vivo-studier är värdefulla, men har begränsningar när det gäller hastighet, tillgänglighet och flexibilitet i experimentell design. Alternativt kan exakta in vitro-modeller av koronar angiogenes kringgå dessa begränsningar och göra det möjligt för forskare att förhöra viktiga biologiska frågor med snabbhet och flexibilitet. Bristen på lämpliga in vitro-modellsystem kan ha hindrat utvecklingen av att förstå de cellulära och molekylära mekanismerna för kranskärlstillväxt. Här beskriver vi ett in vitro-odlingssystem för att odla kranskärl från sinus venosus (SV) och endokarium (Endo), de två stamtoniska vävnader som många av koronarkärlen uppstår. Vi bekräftade också att kulturerna korrekt sammanfattar några av de kända in vivo-mekanismerna. Till exempel visar vi att angiogengroddar i kultur från SV downregulate COUP-TFII uttryck liknar vad som observeras in vivo. Dessutom visar vi att VEGF-A, en välkänd angiogenic faktor in vivo, stimulerar robust angiogenes från både SV- och Endo-kulturerna. Tillsammans har vi utarbetat en korrekt in vitro kultur modell för att studera koronar angiogenes.

En av de mest slående funktionerna i SV angiogenes in vivo är att det följer en specifik väg och innebär celldedifferentiering och redifferentiering händelser som inträffar vid stereotypa tider och positioner1. När de första SV-cellerna växer på hjärtventrikeln slutar de producera venösa markörer som COUP-TFII (figur 7). Därefter, koronar groddar ta två migration vägar, antingen över ytan av hjärtat eller djupt inne ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Coronary Angiogenesis at JoVE.com

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

In vitro modeller av koronar angiogenes kan utnyttjas för upptäckten av cellulära och molekylära mekanismer av koronar angiogenes. In vitro explant kulturer av sinus venosus och endokarium vävnader visar robust tillväxt som svar på VEGF-A och visa ett liknande mönster av COUP-TFII uttryck som in vivo.

In Vitro Modell av födans Angiogenes

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Vårt protokoll är betydande eftersom det tillåter forskare att undersöka den molekylära mekanismen för koronar angiogenes utanför en organism. Den största fördelen med denna teknik är att det exakt modeller processen för koronar angiogenes inuti en organism, underlätta studiet av mekanismerna för koronar angiogenes. Börja med att spraya en gravid mus som bär embryonala dag 11,5 embryon med 70%etanol.Lyfta huden över magen med tlyckor, använd sax för att göra en buk hud och peritoneal snitt i sidled och främre upp till membranet att exponera livmoderhornet. Greppa livmodern, skär vävnaden fri och dra ut livmoderhornet. Placera strängen av embryon i iskallt steril PBS under ett stereomikroskop, och skala av livmodermuskeln, gulesäcken och amnionskyddet från varje embryo.Eftersom varje embryo är isolerat, använd en perforerad sked för att överföra vävnaderna till en ny petriskål som innehåller steril PBS på is. För att skörda den embryonala hjärtvävnaden, överför det första embryot som dissekeras till en ny petriskål under mikroskopet, och placera embryot i ventrala sidan upp. Använd fina tlyck för att göra ett litet snitt i bröstet, något ovanför membranet, och sätt in de slutna tlyckorna i snittet för att förstora snittet.Använda tlyktorna för att hålla bröstväggen öppen för att exponera hjärta och lungor, använd ett andra par tlyckor för att försiktigt flytta hjärtat anteriorly 90 grader för att exponera dorsala aorta och ven. Sedan, gripa dessa fartyg vid basen av hjärtat, försiktigt dra ut hjärtat och lungorna anteriorly och skölj vävnaderna med kalla PBS. När alla hjärtvävnaden har skördats, placera hjärtproverna under mikroskopet och ta bort lungloberna från varje hjärta.Orientera det första hjärtat på sin ryggsida, och hålla hjärtat vid dess bas, använd fina tuppar för att skrapa vänster och höger atria i den intilliggande vävnaden som omger SV från hjärtat. För att isolera SV, orientera hjärtat dorsala sidan upp. Ta försiktigt bort SV från hjärtat och använd en steril överföringspipett för att placera den isolerade vävnaden i en ny sex centimeter petriskål som innehåller iskallt steril PBS på is.För att isolera hela ventriklarna, ta bort utflödestrakten och använd en ny steril överföringspipett för att placera ventriklarna i en separat sex centimeter Petri-rätt som innehåller iskallt steril PBS på is. För att ställa in SV och hela ventrikelkulturer, först päls membranen i en åtta mikrometer pore PET kultur insats per brunn av en 24 väl kultur tallrik, med 100 mikroliter av nyutspädda extracellulära matris per kultur i minst 30 minuter vid 37 grader Celsius. När matrisen har stelnat, använd en överföringspipett för att överföra en explant på varje skär, och flytta plattan under mikroskopet.Med hjälp av rena tyfningar, placera explants i mitten av varje insats för att säkerställa att de inte är fästa vid sidoväggarna, och försiktigt ta bort eventuella extra PBS. Därefter överför plattan med locket stängt under en laminär flöde vävnad kultur huva, och tillsätt 100 mikroliter av förvda komplett medium till varje insats, och 200 mikroliter till väl under varje insats. Tillsätt sedan 300 mikroliter PBS till alla oanvända brunnar, och placera plattan i cellkulturinkubatorn i fem dagar.För VEGF-A behandling på dag två av kultur, ta bort mediet från båda kamrarna i varje kultur och lägga till 100 mikroliter PBS till varje skär, och 200 mikroliter pbs till varje brunn. Efter virvlande plattan några gånger, ersätta PBS med 300 mikroliter av basalt medium kompletteras med 1%fetala nötkreatur serum för att starta kulturerna, och returnera plattan till inkubatorn. På dag tre efter svält, tillsätt 300 mikroliter av färska basala medium plus serum till kontroll brunnar och basala medium plus 50 nanogram per milliliter av VEGF-A till behandlingsväldarna, och returnera plattan till cellkulturen inkubatorn.På den sjätte dagen av kultur, tvätta kamrarna med PBS som visats, och fixera kulturerna med 200 mikroliter av 4%paraformaldehyd i varje brunn, och 100 mikroliter av fixativ i varje insats. Efter 20 minuter vid 4 grader Celsius med gungning, tvätta kulturerna med 300 mikroliter PBS i 10 minuter per tvätt med gungande i rumstemperatur. Efter den sista tvätten, tillsätt 300 mikroliter av primär antikroppslösning till brunnarna och skär för en övernattningskultur vid fyra grader Celsius med gungning.Nästa morgon, tvätta kulturerna 10 gånger i icke-joniska ytaktiva i PBS med gunga, ändra tvättlösningen var 10 minuter innan märkning av kulturerna med 300 mikroliter av en lämplig fluorophore konjugerad sekundär antikropp vid fyra grader Celsius över natten med gungande. Nästa dag, tvätta kulturerna 10 gånger i färska PBS med icke-joniska tensid som visat. Efter den sista tvätten, använd fina tuppar för att försiktigt skala membranet från varje insats och placera membranen på enskilda glasmikroskop diabilder, explant sida upp.Täck proverna med DAPI kompletterat monteringsmedium i en täcksli, och försegla täcklockets kanter glider med klart nagellack. När nagellacket har torkat, bild bilderna genom confocal mikroskopi. När de första SV-cellerna växer upp på hjärtkammaren slutar de att producera venösa markörer som Coup-TF2.Efter fem dagar av kultur, SV endotelceller gro och migrera på membranet. Liksom i det embryonala hjärtat minskas Coup-TF2-uttrycket när kärlen vandrar bort från SV. Kulturer stimuleras med VEGF-A uppvisar en ökad tillväxt av angiogenic groddar både i densitet och längd. Ytterligare SV kulturer stimuleras av VEGF-A visar en nästan trefaldig ökning av groddar längd jämfört med kontroller, vilket tyder på att endotel groddar från SV och endokardium svara på VEGF-A.Det är viktigt att inte förlora SV vävnaden samtidigt dra ut hjärta och lungor, ta bort atria, och rengöring av intilliggande vävnad som omger SV. Live imaging experiment kan utföras för att visualisera koronar angiogenes och att fånga detaljerna i cellulär och molekylär dynamik under processen. Denna teknik är ytterst användbar för att bedöma potentiella molekylära mekanismer för koronar angiogenes och som ett modellsystem för att studera angiogenes i allmänhet.

Research

JoVE Journal

Medicine

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Koronar Ligation och Intramyocardial Injektion i en murin modell för infarkt

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

En musmodell av hornhinnan Pocket-analys för Angiogenes Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Multi-modal Imaging av angiogenes i en Naken råtta modell av bröstcancer skelettmetastaser med magnetkamera, Volumetric datortomografi och ultraljud

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

Angiogenes i Ischemisk råttlunga

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Näthinneavlossning modell i gnagare genom subretinal Injektion av natriumhyaluronat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Ultraljud Baserat Bedömning av kranskärls Flow och Coronary Flow Reserve Använda tryckÖverbelastnings Model hos möss

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Surgical Angiogenesis in Porcine Tibial Allotransplantation: A New Large Animal Bone Vascularized Composite Allotransplantation Model

Kirurgiska angiogenes i svin Tibial Allotransplantation: ett nytt stort djurs ben vaskulariserad sammansatta Allotransplantation modell

Segmental bone loss resulting from trauma, infection malignancy and congenital anomaly remains a major reconstructive challenge. Current therapeutic ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

Intravital mikroskopi av monocyt Homing och tumör-relaterade angiogenes i en murin modell av perifer arteriell sjukdom

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet mätning av mus mesenterica artär med Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Bedömning av terapeutisk angiogenes i en murin modell av Hindlimb ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...