Name: in vitro model of coronary angiogenesis
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Coronary Angiogenesis at JoVE.com

Yazarlar destekleyici bir araştırma ortamı sağlamak için Sharma laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Fare kolonimizi koruyan ve önemseyen Diane (Dee) R. Hoffman'a özel teşekkürlerimizi sunmayı seviyoruz. Ayrıca Dr. Philip J. Smaldino ve Carolyn Vann'a el yazmasının iyice kanıtlanması ve yararlı yorumlar da sunulması için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ball State Üniversitesi Provost Office ve Biyoloji Bölümü B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant fonları B.S ve NIH (RO1-HL128503) ve New York Kök Hücre Vakfı fonlarından K.R.'ye kadar desteklenmiştir.

Bu protokoldeki tüm hayvanların kullanımı Ball State University Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergelerine uymaktadır.
1. Fare Yetiştiricileri Kurulması ve Zamanlanmış Gebelikler için Vajinal Fişler Tespit
<ol><li>Yabani tip erkek ve dişi fareler ile bir fare üreme kafesi kurmak. Üreme farelerinin yaşının 6-8 hafta arasında olduğundan emin olun. Üremeiçin bir çift (1 erkek ve 1 kadın) veya üçlü (1 erkek ve 2 kadın) ayarlayın.</li>
	<li>Ert...

<ol>
	<li>Red-Horse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis.">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li><li>Volz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+progenitors+for+coronary+artery+smooth+muscle.">Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+and+aortic+cardiomyocytes+guide+coronary+artery+stem+development.">VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).</li><li>Chang, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DACH1+stimulates+shear+stress-guided+endothelial+cell+migration+and+coronary+artery+growth+through+the+CXCL12-CXCR4+signaling+axis.">DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis.</a> Genes and Development. , (2017).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+Cells+Form+the+Coronary+Arteries+by+Angiogenesis+through+Myocardial-Endocardial+VEGF+Signaling.">Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Katz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+compartments+of+the+proepicardial+organ+give+rise+to+coronary+vascular+endothelial+cells.">Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).</li><li>Das, S., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cellular plasticity in cardiovascular development and disease.</a> Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).</li><li>Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+Development:+Progenitor+Cells+and+Differentiation+Pathways.">Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways.</a> Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).</li><li>Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+developmental+program+of+coronary+angiogenesis.">Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis.</a> Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia.">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).</li><li>Ruhrberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+patterning+cues+provided+by+heparin-binding+VEGF-A+control+blood+vessel+branching+morphogenesis.">Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis.</a> Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).</li><li>Kikuchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antiangiogenic+isoform+of+VEGF-A+contributes+to+impaired+vascularization+in+peripheral+artery+disease.">An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).</li><li>Folkman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+tumor+factor+responsible+for+angiogenesis.">Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).</li><li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+VEGF+in+the+regulation+of+physiological+and+pathological+angiogenesis.">The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis.</a> Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).</li><li>Ferrara, N., Bunting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor,+a+specific+regulator+of+angiogenesis.">Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).</li><li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Progenitor+Cells+Compensate+to+Rebuild+the+Coronary+Vasculature+in+Elabela-+and+Apj-Deficient+Hearts.">Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts.</a> Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).</li><li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+deletion+of+Ino80+disrupts+coronary+angiogenesis+and+causes+congenital+heart+disease.">Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease.</a> Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).</li></ol>

SV ve Endo ata dokularından başarılı bir şekilde büyüyen koroner damarlar için en kritik adımlardan bazıları şunlardır: 1) SV kültürü için SV dokusunun doğru tanımlanması ve izole edilmesi; 2) doğru Endo kültürü için e11−11.5 yaşları arasında embriyolardan ventriküller kullanarak; 3) diseksiyon süresi boyunca steril koşulları korumak ve dokuları her zaman soğuk tutmak; ve 4) ortamda yüzen doku önlemek için ECM kaplı membran bağlı eksplants tutmak.
İlk...

Kalbin kan damarları genellikle koroner damarlar denir. Bu damarlar arterler oluşur, damarlar, ve kılcal damarlar. Geliştirme sırasında, yüksek dallı kılcal damarlar ilk kurulur, daha sonra koroner arterler ve damarlar içine remodel1,2,3,4,5. Bu ilk kılcal damarlar proepicardium bulunan endotel progenitor hücreleri inşa edilmiştir, sinüs venöz (SV), ve endokardiyum (Endo) dokular1,6,7,8. SV embriyonik kalbin giriş organı dır ve Endo kalp lümen iç astar olduğunu. SV ve Endo bulunan endotel progenitor hücreleri koroner vaskülatür çoğunluğu oluşturmak, proepikardiyum bunun nispeten küçük bir kısmına katkıda ise2. Koroner damarların kılcal ağ önceden varolan öncü hücrelerinden kalpte büyümek hangi süreci koroner anjiyogenez denir. Koroner arter hastalığı dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir ve henüz bu hastalık için etkili bir tedavi eksiktir. Koroner anjiyogenezin ayrıntılı hücresel ve moleküler mekanizmalarını anlamak, hasarlı koroner arterleri onarmak ve yenilemek için yeni ve etkili tedavilerin tasarımında yararlı olabilir.
Son zamanlarda, koroner damarların nasıl geliştiğine olan anlayışımızda bir dalgalanma kısmen yeni araçlar ve teknolojilerin geliştirilmesi ile sağlanmıştır. Özellikle, in vivo soy etiketleme ve gelişmiş görüntüleme teknolojileri koroner damarların hücresel kökenli ve farklılaşma yollarını ortaya çıkarmak için çok yararlı olmuştur9,10,11,12. Bu in vivo araçlarının avantajlarına rağmen, hız, esneklik ve erişilebilirlik açısından sınırlamalar vardır. Bu nedenle, sağlam in vitro model sistemleri yüksek iş lenme li bir şekilde koroner anjiyogenezin hücresel ve moleküler mekanizmalarını açıklığa kavuşturmak için in vivo sistemleri tamamlayabilir.
Burada koroner anjiyogenezin in vitro modelini tanımlıyoruz. Biz iki ata dokuları, SV ve Endo koroner damarlar büyümek için bir in vitro ekplant kültür sistemi geliştirdik. Bu model ile, in vitro doku eksplant kültürleri büyüme ortamı tarafından uyarıldığında koroner damar filizi büyümek olduğunu göstermektedir. Ayrıca, eksplant kültürleri vasküler endotelyal büyüme faktörü A (VEGF-A), son derece güçlü bir anjiyojenik protein tarafından uyarıldığında kontrol ile karşılaştırıldığında hızla büyür. Ayrıca, SV kültüründen anjiyojenik filizlerin venöz defarkyasyona (COUP-TFII ekspresyonu kaybı), vivo1'dekiSV anjiyogenezine benzer bir mekanizmaya maruz kaldığımız saptandı. Bu veriler, in vitro explant kültür sisteminin in vivo'da meydana gelen anjiyojenik olayları sadakatle yeniden ortaya attığını göstermektedir. Burada açıklanan anjiyogenezin in vitro modelleri, koroner anjiyogenezin hücresel ve moleküler mekanizmalarını yüksek iş ve erişilebilir bir şekilde araştırmak için idealdir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 x 20 MM Tissue Culture Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>877222</td>
			<td>Referred in the protocol as Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.0 uM PET membrane culture inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MCEP24H48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Donkey anti-rat 488</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled Metal Probe</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10088-15</td>
			<td>Angled 45 degree, used for detecting deep plugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- ERG 1/2/3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab92513</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- VE-Cadherin antibody</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB550548</td>
			<td>Primary antibody, manufacturer BD BioSciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 gas tank</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13998223</td>
			<td>For 37 &#176;C, 5% CO2 incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereomicrosope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>Leica S9i Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>Endothelial cell growth basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Commercially known as Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Singlequots Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td>Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003IR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiJi</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>Image processing software (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads" target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Used for embryo dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Straight-Blade operating scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-808-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH-302-5601LR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>various models available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Vectashield with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy/Fisher</td>
			<td>50-980-494</td>
			<td>This is available at 32%; needs to be diluted to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td>Useful in removing embryo/tissues from a solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine VEGF-A 165</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps, Dumont #5</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Mouse/Rat chamber</td>
			<td>Easysysteminc</td>
			<td>EZ-1785</td>
			<td>Euthanasia chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of coronary angiogenesis

Burada, koroner anjiyogenezi incelemek için in vitro kültür analizini tanımlıyoruz. Koroner damarlar kalp kasını besler ve klinik öneme sahiptir. Bu damarlarda kusurları ateroskleroz gibi ciddi sağlık riskleri temsil, hangi hastalarda miyokard enfarktüsü ve kalp yetmezliğine yol açabilir. Sonuç olarak, koroner arter hastalığı dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir. Klinik önemine rağmen, hasarlı koroner arterlerin nasıl yenilenecekkonusunda nispeten az ilerleme kaydedilmiştir. Bununla birlikte, koroner damar gelişiminin hücresel kökeni ve farklılaşma yollarının anlaşılmasında son zamanlarda ilerleme kaydedilmiştir. Araştırmacıların flüoresanslı ata hücrelerini etiketlemelerine, kaderlerini takip etmelerine ve in vivo'da ataları görselleştirmelerine olanak tanıyan araç ve teknolojilerin ortaya çıkışı, koroner damar gelişimini anlamada etkili olmuştur. In vivo çalışmalar değerlidir, ancak deneysel tasarımda hız, erişilebilirlik ve esneklik açısından sınırlamalar vardır. Alternatif olarak, koroner anjiyogenezin in vitro modelleri bu sınırlamaları aşabilir ve araştırmacıların önemli biyolojik soruları hız ve esneklikle sorgulamalarına olanak sağlar. Uygun in vitro model sistemlerinin eksikliği koroner damar büyümesinin hücresel ve moleküler mekanizmalarının anlaşılmasında ilerlemeyi engellemiş olabilir. Burada, sinüs venöz (SV) ve endokardyum (Endo), koroner damarların çoğu ortaya çıkan iki ata dokularından koroner damarlar büyümek için bir in vitro kültür sistemi açıklar. Ayrıca kültürlerin bilinen in vivo mekanizmaların bazılarını doğru bir şekilde özetlediğini de doğruladık. Örneğin, SV'den gelen kültürdeki anjiyojenik filizlerin in vivo gözlenene benzer COUP-TFII ifadesini etkisiz kizlediğini gösteriyoruz. Buna ek olarak, vivo'da iyi bilinen bir anjiyojenik faktör olan VEGF-A'nın hem SV hem de Endo kültürlerinden anjiyogenezi sağlam bir şekilde uyardığını gösteriyoruz. Koroner anjiyogenezi incelemek için topluca doğru bir in vitro kültür modeli tasarladık.

In vivo SV anjiyogenezinin en çarpıcı özelliklerinden biri, belirli bir yolu izlemesi ve basmakalıp zamanlarda vekonumlardameydana gelen hücre defarklılaşması ve yeniden farklılaşma olaylarını izlemesidir 1 . İlk SV hücreleri kalp ventrikülüne doğru büyüdükçe COUP-TFII gibi venöz belirteçler üretmeyi bırakırlar (Şekil 7). Daha sonra, koroner filiz iki göç yolları almak, ya kalp yüzeyinde ya da miyokardin...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Coronary Angiogenesis at JoVE.com

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

Koroner anjiyogenezin in vitro modelleri koroner anjiyogenezin hücresel ve moleküler mekanizmalarının keşfinde kullanılabilir. Sinüs venöz ve endkard dokularının in vitro eksplant kültürleri VEGF-A'ya yanıt olarak sağlam bir büyüme gösterir ve in vivo olarak coup-TFII ekspresyonunun benzer bir modelini gösterir.

Koroner Anjiyogenezin In Vitro Modeli

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Protokolümüz önemli çünkü araştırmacıların bir organizmanın dışındaki koroner anjiyogenezin moleküler mekanizmasını araştırmalarına olanak sağlıyor. Bu tekniğin en büyük avantajı, bir organizmanın içindeki koroner anjiyogenez sürecini doğru bir şekilde modelleyerek koroner anjiyogenez mekanizmalarının incelenmesini kolaylaştırıyor olmasıdır. Embriyonik gün taşıyan hamile bir fare püskürtme ile başlayın 11.5 embriyolar ile 70%etanol.Forseps ile karın üzerinde deri kaldırma, rahim boynuzu ortaya çıkarmak için bir karın deri ve periton insizyonu yanal ve anteriora kadar diyafram yapmak için makas kullanın. Rahmi kavrayarak, dokuyu serbest bırakıp rahim boynuzunu çıkar. Bir stereo mikroskop altında buz gibi steril PBS içine embriyoların dize yerleştirin ve rahim kas soyma, sarısı kese, ve her embriyo amnion kapağı.Her embriyo izole olarak, buz üzerinde steril PBS içeren yeni bir Petri kabına dokuları aktarmak için delikli bir kaşık kullanın. Embriyonik kalp dokusunu hasat etmek için, mikroskop altında yeni bir Petri kabına kesilecek ilk embriyoyu transfer edin ve embriyoyu ventral tarafa yerleştirin. Göğüste küçük bir kesi yapmak için ince forceps kullanın, diyafram biraz üzerinde, ve kesi büyütmek için kesi içine kapalı çifekler ekleyin.Kalp ve akciğerleri ortaya çıkarmak için göğüs duvarını açık tutmak için forceps kullanarak, hafifçe dorsal aort ve damar ortaya çıkarmak için kalbi anteriorly 90 derece hareket etmek için ikinci bir çift forceps kullanın. Sonra, kalbin tabanında bu damarları kavrayarak, dikkatle kalp ve akciğerler ön lüzuni çekin ve soğuk PBS ile dokuları durulayın. Tüm kardiyak doku hasat edildiğinde, mikroskop altında kalp örnekleri yerleştirin ve her kalpten akciğer lobları kaldırın.Onun sırt tarafında ilk kalp Orient, ve tabanında kalp tutarak, kalpTen SV çevreleyen bitişik dokuda sol ve sağ atria kazımak için ince forseps kullanın. SV'yi izole etmek için, kalp dorsal tarafını yukarı doğru yönlendirin. SV'yi dikkatlice kalpten çıkarın ve izole edilmiş dokuyu buz üzerinde buz soğuk steril PBS içeren yeni bir altı santimetrelik Petri kabına yerleştirmek için steril bir transfer pipeti kullanın.Tüm ventrikülleri izole etmek için, çıkış yolu kaldırmak ve buz üzerinde buz soğuk steril PBS içeren ayrı bir altı santimetre Petri kabına ventriküller yerleştirmek için yeni bir steril transfer pipet kullanın. SV ve tüm ventrikül kültürleri kurmak için, ilk kat bir sekiz mikrometre gözenek PET kültür membranlar 24 iyi kültür plaka sıcağı başına, taze seyreltilmiş ekstrasellüler matriks 100 mikrolitre ile kültür başına en az 30 dakika 37 santigrat derece. Matris katılaşmış olduğunda, her kesici uç üzerine bir ekstrüzyon aktarmak için bir transfer pipet kullanın ve mikroskop altında plaka hareket ettirin.Temiz pratisyenler kullanarak, eksmeleri yan duvarlara bağlı olmadığından emin olmak için her kesici ucun ortasına yerleştirin ve ekstra PBS'yi dikkatlice çıkarın. Daha sonra, bir laminar akış doku kültür başlığı altında kapak kapalı plaka aktarın ve her eklemek için önceden ısıtılmış komple orta 100 mikrolitre ekleyin ve 200 mikrolitre her eklemek altında çok. Daha sonra kullanılmayan kuyulara 300 mikrolitre PBS ekleyin ve plakayı beş gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.Kültürün ikinci gününde VEGF-A tedavisi için, her kültürün her iki odasından orta çıkarın ve her eklemek için PBS 100 mikrolitre ekleyin ve her kuyuya 200 mikrolitre PBS. Plakabirkaç kez döndükten sonra, kültürleri başlatmak için% 1 fetal sığır serumu ile takviye bazal orta 300 mikrolitre ile PBS değiştirin, ve kuvöz plaka dönmek. Açlıktan sonraki üçüncü günde, kontrol kuyularına 300 mikrolitre taze bazal orta artı serum ekleyin ve bazal ortam ait 50 nanogramı ve vegf-A'nın mililitresi başına tedavi kuyularına ekleyin ve plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün.Kültürün altıncı gününde, gösterildiği gibi PBS ile odaları yıkayın ve her kuyuda % 4 paraformaldehit 200 mikrolitre ve her kesici uçta 100 mikrolitre fiksatif ile kültürleri düzeltin. Sallanan 4 derece santigrat ile 20 dakika sonra, oda sıcaklığında sallanan yıkama başına 10 dakika pbs 300 mikrolitre ile kültürleri yıkayın. Son yıkamadan sonra, kuyulara 300 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin ve sallanan dört santigrat derecede bir gecede kültür için ekler.Ertesi sabah, kültürleri PBS'de iyonik olmayan yüzey aktif maddede 10 kez yıkayın, yıkama solüsyonunu her 10 dakikada bir değiştirerek kültürleri 300 mikrolitre uygun bir florofor konjuge ikincil antikor ile etiketlemeden önce bir gecede dört derece santigrat derece ile sallantıda. Ertesi gün, gösterildiği gibi non-iyonik yüzey aktif ile taze PBS kültürleri 10 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, membranı her kesici uçtan dikkatlice soymak ve membranları tek tek cam mikroskop slaytlarına yerleştirmek için ince prökler kullanın.Numuneleri DAPI takviyeli montaj ortamıyla kaplayın ve kapak fişlerinin kenarlarını açık ojeile kapatın. Oje kuruduğunda, confokal mikroskopi ile slaytlar görüntü. İlk SV hücreleri kalp ventrikülüzerine büyüdükçe, Coup-TF2 gibi venöz belirteçler üretmeyi bırakırlar.Kültür beş gün sonra, SV endotel hücreleri filizlenir ve membran üzerine göç. Embriyonik kalpte olduğu gibi, kaplar SV'den uzaklaştıkça Coup-TF2 ifadesi azalır. VEGF-A ile uyarılan kültürler, hem yoğunluk hem de uzunluk olarak anjiyojenik filizlerin arttığını göstermektedir. VEGF-A tarafından uyarılan diğer SV kültürleri, kontrollere kıyasla filiz uzunluğunun neredeyse üç kat arttığını göstererek, SV ve enddokardyumdan gelen endotel filizlerinin VEGF-A'ya yanıt verdiğini düşündürmektedir.Kalp ve akciğerleri çekerken, atria çıkarırken ve SV'yi çevreleyen komşu dokuyu temizlerken SV dokusunu kaybetmemek önemlidir. Koroner anjiyogenezi görselleştirmek ve süreç boyunca hücresel ve moleküler dinamiğin ayrıntılarını yakalamak için canlı görüntüleme deneyleri yapılabilir. Bu teknik koroner anjiyogenezin potansiyel moleküler mekanizmalarının değerlendirilmesinde ve genel olarak anjiyogenezin incelenmesinde model bir sistem olarak son derece yararlıdır.

Research

JoVE Journal

Medicine

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Enfarktüsü bir murin Model Koroner Arter ligasyon ve intramiyokardiyal Enjeksiyon

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

Anjiyogenez Çalışması Kornea Cep Testi Fare Modeli

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Manyetik Rezonans Görüntüleme, Volumetrik Bilgisayarlı Tomografi ve Ultrason Kullanımı Meme Kanseri Kemik metastazı bir Nude Rat Model Angiogenezis Multi-modal Görüntüleme

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

İskemik Sıçan Akciğer Angiogenezis

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Sodyum Hyaluronat subretinal Enjeksiyon Kemirgenler Retina Dekolmanı Modeli

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Farelerde Basınç Aşırı Modeli Koroner Arter Akış ve Koroner Akım Rezervi Ultrason Dayalı Değerlendirme

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Surgical Angiogenesis in Porcine Tibial Allotransplantation: A New Large Animal Bone Vascularized Composite Allotransplantation Model

Domuz Tibial Allotransplantation cerrahi angiogenez: bileşik Allotransplantation Model yeni bir büyük hayvan kemik skarların

Segmental bone loss resulting from trauma, infection malignancy and congenital anomaly remains a major reconstructive challenge. Current therapeutic ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

Monosit posta ve tümör ile ilgili angiogenez periferik arter hastalığı, bir fare modeli intravital mikroskobu

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

İzometrik Contractility ölçüm tel Myography kullanarak fare mezenterik arter

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Hindekstremite Iskemi bir Murine modelinde terapötik anjiyogenezi değerlendirilmesi

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...