Name: detection of lung tumor progression in mice by ultrasound imaging
Uploaded: 2020-02-27T12:30:00
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レンチウイルスCa2Cre-shp53ベクターに対するI.ヴェルマ博士に感謝します。この作業は、カナダ保健研究所(CIHR MOP 137113)からAEKへの資金によって支えられていました。

動物研究は、マギル大学の施設動物管理委員会(IACUC)に従って行われ、手順はマギル大学の動物福祉委員会(動物使用プロトコル#2009-5754)によって承認されました。
1. CA2Cre-shp53 レンチウイルス・ティトレの生成
注 : 以下のプロトコルは、Xia et al.6で説明したものと同じです。
<ol><li>レンチウイルスの調製(15cm x 10cmの料理用)<ol>
<li>1日?...

<ol>
	<li>Eisenstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine:+Special+treatment.">Personalized medicine: Special treatment.</a> Nature. 513, 8 (2014).</li><li>Karachaliou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+mutations+in+lung+cancer.">KRAS mutations in lung cancer.</a> Clinical Lung Cancer. 14 (3), 205-214 (2013).</li><li>Jackson, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+lung+tumor+initiation+and+progression+using+conditional+expression+of+oncogenic+K-ras.">Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras.</a> Genes &amp; Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).</li><li>DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+mouse+lung+cancer+models+using+adenoviral+or+lentiviral+delivery+of+Cre+recombinase.">Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase.</a> Nature Protocol. 4 (7), 1064-1072 (2009).</li><li>Chen, J., Lecuona, E., Briva, A., Welch, L. C., Sznajder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbonic+anhydrase+II+and+alveolar+fluid+reabsorption+during+hypercapnia.">Carbonic anhydrase II and alveolar fluid reabsorption during hypercapnia.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 38 (1), 32-37 (2008).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cell+proliferation+by+IKK2+depletion+in+a+mouse+lung-cancer+model.">Reduced cell proliferation by IKK2 depletion in a mouse lung-cancer model.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 532 (2015).</li><li>Demi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+a+potential+quantitative+measure+of+the+state+of+the+lung+using+lung+ultrasound+spectroscopy.">Determination of a potential quantitative measure of the state of the lung using lung ultrasound spectroscopy.</a> Scientific Reports. 7, 12746 (2017).</li><li>Mohanty, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Lung+Parenchyma+Using+Ultrasound+Multiple+Scattering.">Characterization of the Lung Parenchyma Using Ultrasound Multiple Scattering.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43, 993-1003 (2017).</li><li>Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Method+for+Rapid+Intubation+of+the+Trachea+in+Mice.">An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).</li><li>Saraogi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+ultrasound:+Present+and+future.">Lung ultrasound: Present and future.</a> Lung India. 32 (3), 250-257 (2015).</li><li>Gargani, L., Volpicelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+I+do+it:+lung+ultrasound.">How I do it: lung ultrasound.</a> Cardiovascular Ultrasound. 12, 25 (2014).</li><li>Soldati, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Physical+Basis+of+Pulmonary+Sonographic+Interstitial+Syndrome.">On the Physical Basis of Pulmonary Sonographic Interstitial Syndrome.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 35 (10), 2975 (2016).</li><li>Raes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Ultrasound+and+Photoacoustic+Imaging+of+Orthotopic+Lung+Cancer+in+Mice:+New+Perspectives+for+Onco-Pharmacology.">High-Resolution Ultrasound and Photoacoustic Imaging of Orthotopic Lung Cancer in Mice: New Perspectives for Onco-Pharmacology.</a> PLoS One. 11 (4), 15 (2016).</li><li>Lakshman, M., Needles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+quantification+of+the+tumor+microenvironment+with+micro-ultrasound+and+photoacoustic+imaging.">Screening and quantification of the tumor microenvironment with micro-ultrasound and photoacoustic imaging.</a> Nature Methods. 12 (4), 372 (2015).</li><li>Chichra, A., Makaryus, M., Chaudhri, P., Narasimhan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+for+the+Pulmonary+Consultant.">Ultrasound for the Pulmonary Consultant.</a> Clinical Medicine Insights: Circulatory Respiratory and Pulmonary Medicine. 10, 9 (2016).</li></ol>

我々は、超音波によるCre-誘導性LSL-KRAS G12Dマウスモデルにおける肺腫瘍の成長を評価できる方法を実証する。この方法は、肺腫瘍の増殖に対する薬理学的阻害薬の効果を評価するために使用することができる。また、異なる遺伝的背景のマウス間の肺腫瘍の成長を比較するために使用することができます。この手法を使用すると、専門的な計算スキルは必要ありませんが、マウスの異なるグ?...

世界中のがん関連死の主な原因として、肺癌は、主に実験室1で病気を再現できる関連する前臨床モデルの欠如のために、治療に耐え難いままである。肺癌症例の約25%はKRASの癌遺伝子2の突然変異によるものである。KRAS駆動肺癌は、しばしば予後不良および治療に対する低応答と関連しており、この疾患におけるさらなる研究の重要性を強調する2。
KRAS肺がんによる免疫力マウスにおいて、肺腫瘍の成長をリアルタイムで相対的に評価できる方法を最適化した。我々は、KRAS G12Dオンコジーンをクレレンチウイルスベクター3、4で発現させることができる、ロクスストップ-ロクスKRAS G12D(LSL-KRAS G12D)マウスを用いる。これらのベクターは、炭酸脱水酵素2によって駆動され、ウイルス感染が肺胞上皮細胞5で特異的に起こるようにする。また、肺腫瘍の開始および進行を促進するために、レンチウイルス構築物は、U6/H1プロモーター(本明細書中のレンチウイルス構築物をCa2Cre-shp53)6と称するP53shRNAを発現する。この方法の生物学的関連性は、マウスの非正所性腫瘍の異種移植片とは対照的に、マウスにおける肺腫瘍の自然な過程にある。正所法を用いた障害は、マウスを犠牲にすることなく肺腫瘍の増殖をモニタリングすることである。この制限を克服するために、我々は、このマウスモデルにおける2次元(2D)モードでの肺腫瘍の進行の分析を可能にするために超音波画像を最適化した。感染後7週で腫瘍を発進させることは、超音波画像のB線として反映され、これは数えることができるが、肺に存在する腫瘍の正確な数を反映しない。B線は、肺のパレンチマ7、8の胸膜線から生じるレーザー状の垂直白線によって特徴付けられる。大きな腫瘍は、感染の18週間後に視覚化することができます。これらの腫瘍の相対的な容積は、超音波で行われる2D測定によって定量化される。
この方法は、LSL-KRAS G12Dマウスモデルにおける肺腫瘍の増殖に対する薬理薬の効果を調べている研究者にとって最適である。さらに、肺腫瘍の進行は、異なる遺伝的系統を有するマウス間で比較することができ、肺腫瘍容積の発達における特定の遺伝子/タンパク質の有無の重要性を調べることができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m Acrodisc Syringe Filters</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>PN 4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm Cell Cultre Plate</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>664 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell Culture Plate</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>657 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra - 15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Merck Millipore Ltd.</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR-Fortessa</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>649225B 3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA2Cre-shp53 lentiviral vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From Dr. I Verma Laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>80450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSL-KRASG12D mouse</td>
			<td>JAX Mice</td>
			<td>8179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX550S; Centre Transmit: 40 MHz</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics</td>
			<td>51070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PsPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEVO-3100</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics</td>
			<td>51072-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of lung tumor progression in mice by ultrasound imaging

年間160万人の犠牲者を出す肺癌は、世界的ながんの負担に大きく貢献しています。肺癌は、肺癌症例の約25%を構成するKRAS腫瘍遺伝子などの腫瘍遺伝子における遺伝的変化によって部分的に駆動される。KRAS主導の肺癌を治療的に標的化することの難しさは、実験室での病気の進行を模倣できる貧弱なモデルを持つことに部分的に起因する。我々は、超音波画像を介して、Cre-誘導性LSL-KRAS G12Dマウスモデルにおける原発性KRAS肺腫瘍の相対定量を可能にする方法を記載する。この方法は、肺のパレンチマの明るさ(B)モードの獲得に依存する。このモデルで最初に形成された腫瘍はB線として可視化され、取得した画像に存在するB線の数を数えることによって定量化することができる。これらは、マウス肺の表面に形成された相対的な腫瘍番号を表すであろう。形成された腫瘍は時間とともに発達するとともに、肺の中の深い裂け目として知覚される。形成された腫瘍の円周が十分に定義されているので、腫瘍の長さと幅を測定し、腫瘍キャリパー測定に用いる式に適用することにより、相対的な腫瘍体積を計算することが達成される。超音波画像処理は、マウスの腫瘍定量に使用されることが多い非侵襲的で、高速でユーザーフレンドリーな技術です。超音波画像を取得すると人工物が現れる可能性がありますが、このイメージング技術は、コンピュータ断層撮影(CT)イメージングなどの他のイメージング技術と比較して、マウスの腫瘍定量に対してより有利であることがわかりました。生物発光イメージング(BLI)。研究者は、マウスの異なるグループ間の肺腫瘍の開始と進行を比較することによって、この技術を使用して新しい治療標的を調査することができます。

〜2 x 106 TU/mLのレンチウイルス感染力を得た後(図1)、LSL-KRAS G12Dマウスが適切な年齢(6−8週間)9に達したときにCa2Cre-shp53レンチウイルスを気管内注射した。超音波画像は、腫瘍の開始時に感染の7週間後に行われた(図3B)。画像化は、LSL-KRASG12Dマウスモデルで生じる様々なタイプの前駆体病変を含むため7週...

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Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

このプロトコルは、マウスにおけるKRAS肺腫瘍を誘導するために取られたステップと、超音波画像による形成された腫瘍の定量化を記述する。小さな腫瘍は、初期の時間でBラインとして視覚化されます。後の時点で、相対的な腫瘍体積測定は、超音波ソフトウェアの測定ツールによって達成される。

超音波画像によるマウスにおける肺腫瘍の進行の検出

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

このプロトコルの重要性は、腫瘍開始から腫瘍進行まで、このマウスモデルで自発的に発症した肺腫瘍のリアルタイム検出性にあります。この技術の利点は、非侵襲的であり、基本的なスキルのみを必要とし、私たちは直接薬物の効果と関心の治療を監視することができます。肺腫瘍の進行は、対象遺伝子の有無において評価することもできる。この分析を使用すると、新しい治療戦略をクリニックに拡張できる可能性があります。レンチウイルス挿管後7週間と18週間、超音波ゲルと温度モニターの加熱ポンプをオンにし、摂氏33度のインキュベーターを設置します。3Dモーターを統合レールシステムに設置し、モータおよびトランスデューサ取り付けシステムが所定の位置に固定されていることを確認します。40ヘルツ周波数トランスデューサを3Dモータに接続し、超音波ソフトウェアで新しい研究を開きます。新しいスタディ ウィンドウで、スタディ名を入力します。系列名ウィンドウで、系列名およびその他の関連情報を入力します。クリックした後、トランスデューサタイプを選択します。プログラムは B モードに変わります。動物のプラットホームの上の便利な位置に暖房ランプを置き、麻酔付き実験用マウスのペダル反射への応答の欠如を確認する。動物のプラットホームにマウスを置いてキュービタス腹側に入れ、動物の目に軟膏を塗布します。テープでプラットフォームにしっかりと手足を固定し、動物の胸に温めた超音波ゲルの薄い層を適用します。高さコントロールノブを使用して、マウス胸部の表面に触れるまで集録プローブを下げ、マウスの心臓がほぼ中央に合うようプローブを配置します。その後、マイクロノブを使用して、横方向の両方の四肢から胸全体の画像を取得します。理想的には、マウスあたり500フレームを収集します。すべての画像がキャプチャされたら、マウスの胸からゲルをきれいにし、動物を温まるインキュベーターに入れてください。超音波画像の2D分析のために、超音波ソフトウェアで取得したフレームを開き、手動で腫瘍のフレームをスキャンします。小さな腫瘍を起用する場合は、獲得した500フレームの全長に対して、10フレームごとに定期的にビーラインの数を数えます。大きな腫瘍の2D測定では、線形ツールを使用して、存在する腫瘍の幅と長さを測定し、次に式を使用して腫瘍の体積を計算します。気管内感染から7週間後、超音波画像診断が行われ、注射後の実験マウスモデルで生じる様々なタイプの前駆体病変を可視化する。これらの同定された前駆体病変は、眼で数えられ、肺の表面上の小さな腫瘍を表すことができる。これらのデータの散布プロットにより、実験マウス内の腫瘍を定量化し、動物ごとの相対的な腫瘍数を推定することを可能にする。感染後18週で、大きな腫瘍は、超音波ソフトウェア内で測定することができる複数表面を中断する深い裂け目として現れる。その後、統計的分析のために相対的な腫瘍量を定量化することができます。感染後20週で採取した肺切片にヘマトキシリンおよびエオシン染色は、大きな腫瘍の形成ならびに腺腫および腺癌の形成を確認する。動的な肺腫瘍と、静的な偽陽性を混同しないことが重要である。この方法では体積の腫瘍数の修飾は相対的であるため、シャートリ染色などの追加の方法を用いることを提案する。このモデルは、マウスの肺癌の発達に対する遺伝的収差または治療戦略の影響を直接評価することを可能にする。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

肺腫瘍細胞募集試験

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

マウス同所性膀胱腫瘍モデルおよび腫瘍検出システム

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivoひと肺腫瘍内常駐 cd8 陽性 T リンパ球の画像スライス共焦点顕微鏡を用いた

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

肺組織に腫瘍のセルの視覚化を循環させるため肺植民地化アッセイの確立

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

放射性核種蛍光レポーターの遺伝子齧歯動物腫瘍モデルで腫瘍の進行を追跡するイメージング

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

CD8 による培養腫瘍細胞のアポトーシスのリアルタイム検出+ T 細胞腫瘍浸潤骨髄細胞の免疫抑制機能を勉強するには

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

免疫蛍光による非小細胞肺癌患者からの循環腫瘍細胞の半自動PD-L1特性図と列挙

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

腫瘍組織学におけるマウス肺の多灌流とインフレーション

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...

Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

肺扁平上皮癌進行をモデル化する多次元共培養システム

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...