Name: detection of lung tumor progression in mice by ultrasound imaging
Uploaded: 2020-02-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging at JoVE.com

Vi takker Dr. I. Verma for den lentivirale Ca2Cre-shp53 vektoren. Arbeidet ble støttet av midler fra Canadian Institutes of Health Research (CIHR MOP 137113) til AEK.

Dyrestudier ble utført i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra McGill University og prosedyrer ble godkjent av Animal Welfare Committee of McGill University (dyrebrukprotokoll # 2009-5754).
1. Generasjon av CA2Cre-shp53 Lentiviral Titre
MERK: Følgende protokoll er den samme som beskrevet i Xia et al.6, med mindre modifikasjoner.
<ol><li>Forberedelse av lentivirus (for 15 cm x 10 cm retter)<ol>
<li>På dag 1, ...

<ol>
	<li>Eisenstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine:+Special+treatment.">Personalized medicine: Special treatment.</a> Nature. 513, 8 (2014).</li><li>Karachaliou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+mutations+in+lung+cancer.">KRAS mutations in lung cancer.</a> Clinical Lung Cancer. 14 (3), 205-214 (2013).</li><li>Jackson, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+lung+tumor+initiation+and+progression+using+conditional+expression+of+oncogenic+K-ras.">Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras.</a> Genes &amp; Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).</li><li>DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+mouse+lung+cancer+models+using+adenoviral+or+lentiviral+delivery+of+Cre+recombinase.">Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase.</a> Nature Protocol. 4 (7), 1064-1072 (2009).</li><li>Chen, J., Lecuona, E., Briva, A., Welch, L. C., Sznajder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbonic+anhydrase+II+and+alveolar+fluid+reabsorption+during+hypercapnia.">Carbonic anhydrase II and alveolar fluid reabsorption during hypercapnia.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 38 (1), 32-37 (2008).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cell+proliferation+by+IKK2+depletion+in+a+mouse+lung-cancer+model.">Reduced cell proliferation by IKK2 depletion in a mouse lung-cancer model.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 532 (2015).</li><li>Demi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+a+potential+quantitative+measure+of+the+state+of+the+lung+using+lung+ultrasound+spectroscopy.">Determination of a potential quantitative measure of the state of the lung using lung ultrasound spectroscopy.</a> Scientific Reports. 7, 12746 (2017).</li><li>Mohanty, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Lung+Parenchyma+Using+Ultrasound+Multiple+Scattering.">Characterization of the Lung Parenchyma Using Ultrasound Multiple Scattering.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43, 993-1003 (2017).</li><li>Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Method+for+Rapid+Intubation+of+the+Trachea+in+Mice.">An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).</li><li>Saraogi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+ultrasound:+Present+and+future.">Lung ultrasound: Present and future.</a> Lung India. 32 (3), 250-257 (2015).</li><li>Gargani, L., Volpicelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+I+do+it:+lung+ultrasound.">How I do it: lung ultrasound.</a> Cardiovascular Ultrasound. 12, 25 (2014).</li><li>Soldati, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Physical+Basis+of+Pulmonary+Sonographic+Interstitial+Syndrome.">On the Physical Basis of Pulmonary Sonographic Interstitial Syndrome.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 35 (10), 2975 (2016).</li><li>Raes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Ultrasound+and+Photoacoustic+Imaging+of+Orthotopic+Lung+Cancer+in+Mice:+New+Perspectives+for+Onco-Pharmacology.">High-Resolution Ultrasound and Photoacoustic Imaging of Orthotopic Lung Cancer in Mice: New Perspectives for Onco-Pharmacology.</a> PLoS One. 11 (4), 15 (2016).</li><li>Lakshman, M., Needles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+quantification+of+the+tumor+microenvironment+with+micro-ultrasound+and+photoacoustic+imaging.">Screening and quantification of the tumor microenvironment with micro-ultrasound and photoacoustic imaging.</a> Nature Methods. 12 (4), 372 (2015).</li><li>Chichra, A., Makaryus, M., Chaudhri, P., Narasimhan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+for+the+Pulmonary+Consultant.">Ultrasound for the Pulmonary Consultant.</a> Clinical Medicine Insights: Circulatory Respiratory and Pulmonary Medicine. 10, 9 (2016).</li></ol>

Vi viser en metode som kan vurdere lungetumorvekst i cre-inducible LSL-KRAS G12D musemodell ved ultralyd. Denne metoden kan brukes til å evaluere effekten av farmakologiske hemmere på lungetumorvekst. Den kan også brukes til å sammenligne lungetumorvekst mellom mus med forskjellig genetisk bakgrunn. Ved hjelp av denne teknikken krever ikke spesialiserte beregningsferdigheter, er det imidlertid viktig å være systematisk i antall rammer som brukes til analyse for å tillate riktig sammenligning hvis metoden brukes ti...

Som den ledende årsaken til kreftrelaterte dødsfall over hele verden, lungekreft forblir ildfast mot behandlinger, hovedsakelig på grunn av mangel på relevante prekliniske modeller som kan rekapitulere sykdommen i laboratoriet1. Rundt 25% av lungekrefttilfeller skyldes mutasjoner i KRAS oncogene2. KRAS-drevet lungekreft er ofte forbundet med dårlig prognose og lav respons på terapi, og fremhever viktigheten av videre studier i denne sykdommen2.
Vi optimaliserte en metode som tillater den relative evalueringen av lungetumorvekst i sanntid hos KRAS lungekreftinduserte immunkompetente mus. Vi bruker Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) mus der KRAS G12D onkogen kan uttrykkes av Cre lentivirale vektorer3,4. Disse vektorene er drevet av karbonanhydrase 2, slik at virusinfeksjonen kan finne sted spesielt i alveolær epitelceller5. I tillegg, for å akselerere initiering og progresjon av lungesvulster, uttrykker lentiviral konstruksjon også P53 shRNA fra en U6/H1-promotor (lentiviral konstruksjon en gang vil bli referert til som Ca2Cre-shp53)6. Den biologiske relevansen av denne metoden ligger i det naturlige løpet av lungetumorutvikling hos mus i motsetning til xenografts av ikke-ortopiske svulster hos mus. Et hinder ved hjelp av ortopisk metode overvåker lungetumorvekst uten å ofre musen. For å overvinne denne begrensningen optimaliserte vi ultralydavbildning for å tillate analyse av lungetumorprogresjon i todimensjonal (2D) modus i denne musemodellen. Initiering av svulster ved 7 uker etter infeksjon gjenspeiles som B-linjer i ultralydbilder, som kan telles, men vil ikke gjenspeile det nøyaktige antallet svulster som finnes på lungene. B-linjer er preget av laserlignende vertikale hvite linjer som oppstår fra pleural linjen i lungeparenchyma7,8. Store svulster kan visualiseres etter 18 ukers infeksjon. Det relative volumet av disse svulstene kvantifiseres av 2D-målinger gjort på ultralyd.
Denne metoden er optimal for forskere som undersøker effekten av farmakologiske legemidler på lungetumorvekst i LSL-KRAS G12D-musemodellen. I tillegg kan lungetumorprogresjon sammenlignes mellom mus med forskjellige genetiske linjer, for å undersøke viktigheten av tilstedeværelse eller fravær av visse gener/ proteiner på utviklingen av lungetumorvolum.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m Acrodisc Syringe Filters</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>PN 4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm Cell Cultre Plate</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>664 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell Culture Plate</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>657 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra - 15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Merck Millipore Ltd.</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR-Fortessa</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>649225B 3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA2Cre-shp53 lentiviral vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From Dr. I Verma Laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>80450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSL-KRASG12D mouse</td>
			<td>JAX Mice</td>
			<td>8179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX550S; Centre Transmit: 40 MHz</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics</td>
			<td>51070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PsPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEVO-3100</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics</td>
			<td>51072-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of lung tumor progression in mice by ultrasound imaging

Med ~ 1,6 millioner ofre per år, lungekreft bidrar enormt til den verdensomspennende byrden av kreft. Lungekreft er delvis drevet av genetiske endringer i onkogenes som KRAS oncogene, som utgjør ~ 25% av lungekreft tilfeller. Vanskeligheten med terapeutisk målretting KRAS-drevet lungekreft stammer delvis fra å ha dårlige modeller som kan etterligne utviklingen av sykdommen i laboratoriet. Vi beskriver en metode som tillater relativ kvantifisering av primære KRAS lungesvulster i en Cre-inducible LSL-KRAS G12D musemodell via ultralydavbildning. Denne metoden er avhengig av lysstyrke (B)-modus oppkjøp av lungeparenchyma. Svulster som opprinnelig dannes i denne modellen visualiseres som B-linjer og kan kvantifiseres ved å telle antall B-linjer som finnes i de oppkjøpte bildene. Disse ville representere det relative tumornummeret dannet på overflaten av muslungen. Etter hvert som de dannede svulstene utvikler seg med tiden, oppfattes de som dype kløfter i lungeparenchyma. Siden omkretsen av den dannede svulsten er godt definert, oppnås beregning av det relative tumorvolumet ved å måle lengden og bredden på svulsten og bruke dem i formelen som brukes til tumorkalipermålinger. Ultralydavbildning er en ikke-invasiv, rask og brukervennlig teknikk som ofte brukes til tumorkvantifiseringer hos mus. Selv om artefakter kan oppstå når du får ultralydbilder, har det vist seg at denne bildeteknikken er mer fordelaktig for tumorkvantifiseringer hos mus sammenlignet med andre bildeteknikker som computertomografi (CT) avbildning og bioluminescensavbildning (BLI). Forskere kan undersøke nye terapeutiske mål ved hjelp av denne teknikken ved å sammenligne lungetumorinitiering og progresjon mellom ulike grupper av mus.

Etter å ha fått en lentiviral smittsom titer på ~ 2 x 106 TU/ml (figur 1),ble Ca2Cre-shp53 lentivirus intratracheally injisert når LSL-KRAS G12D mus nådde en passende alder (6-8 uker)9. Ultralydavbildning ble utført etter 7 ukers infeksjon ved initiering av svulster (figur 3B). Imaging ble gjort på 7 uker for å inkludere de ulike typer forløper lesjoner som oppstår i LSL-KRASG12D musemodell...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging at JoVE.com

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Denne protokollen beskriver trinnene som er tatt for å indusere KRAS lungesvulster hos mus, samt kvantifisering av dannede svulster ved ultralydavbildning. Små svulster visualiseres i tidlige tidspunkter som B-linjer. Ved senere tidspunktoppnås relative tumorvolummålinger ved hjelp av måleverktøyet i ultralydprogramvaren.

Påvisning av lungetumorprogresjon hos mus ved ultralydavbildning

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Betydningen av denne protokollen ligger i sanntidsdefinerbarheten av lungesvulster som utviklet seg spontant i denne musemodellen, fra tumorinitiering til tumorprogresjon. Fordelen med denne teknikken er at det ikke er invasiv, krever bare grunnleggende ferdigheter og tillater oss direkte å overvåke effekten av stoffet og behandling av interesse. Lungesvulstprogresjon kan også evalueres i nærvær eller fravær av et gen av interesse.Ved hjelp av denne analysen kan nye behandlingsstrategier potensielt utvides til klinikken. Syv og 18 uker etter lentiviral intubasjon, slå på varmepumpen for ultralydgelen og temperaturmonitoren og sett opp en 33 grader celsius inkubator. Plasser 3D-motoren på det integrerte skinnesystemet og kontroller at motor- og svingermonteringssystemet er festet på plass.Koble en 40 hertz frekvenstransduser til 3D-motoren og åpne en ny studie i ultralydprogramvaren. Skriv inn studienavnet i det nye studievinduet. Skriv inn serienavn og annen relevant informasjon i serienavnvinduet.Når du har klikket ferdig, velger du transdusertypen. Programmet endres til B-modus. Plasser en varmelampe i en praktisk posisjon over dyreplattformen og bekreft mangel på respons på pedalrefleks i den bedøvede eksperimentelle musen.Plasser musen på dyreplattformen i cubitus ventral og påfør salve på dyrets øyne. Fest lemmer fast til plattformen med tape og påfør et tynt lag av den oppvarmede ultralydgelen til dyrets bryst. Bruk høydekontrollknappen til å senke oppkjøpsproben til den berører overflaten på musebrystet og plasser sonden slik at musens hjerte er omtrent sentrert.Bruk deretter mikroknottene til å skaffe bilder av hele brystet fra begge ekstremiteter i tverrgående retning. Ideelt sett samle 500 bilder per mus. Når alle bildene er tatt, rengjør gelen fra brystet på musen og plasser dyret i oppvarmingsinkubatoren.For 2D-analyse av ultralydbildene, åpne de oppkjøpte rammene i ultralydprogramvaren og skann rammene for svulster manuelt. For små initierende svulster teller du antall bilinjer med jevne mellomrom hver 10-ramme for hele lengden av de 500 rammene som er anskaffet. For 2D-målinger av store svulster, bruk det lineære verktøyet for å måle bredden og lengden på svulsten som er tilstede, og beregn deretter volumet av svulstene ved hjelp av formelen.Syv uker etter intra trakeal infeksjon utføres ultralydavbildning for å visualisere de ulike typer forløperlesjoner som oppstår i den eksperimentelle musemodellen etter injeksjonen. Disse bielinjeidentifiserte forløperlesjoner kan telles av øyet og representere små svulster på overflaten av lungene. Scatter plotting av disse dataene tillater kvantifisering av svulstene i eksperimentelle mus for å tillate estimering av det relative tumornummeret per dyr.Ved 18 uker etter infeksjon vises store svulster som dype kløfter som forstyrrer flertallsoverflaten som kan måles i ultralydprogramvaren. Det relative tumorvolumet kan deretter kvantifiseres for statistisk analyse. Hematoksylin og eosinfarging på lungeseksjoner høstet ved 20 uker etter infeksjon bekrefter dannelsen av store svulster samt dannelsen av adenom og adenokarsinom.Det er viktig å ikke forvirre lungesvulster, som er dynamiske, med falske positiver, som er statiske. Siden kvalifikasjonen av tumornummeret til volumet er relativ i denne metoden, foreslår vi å bruke flere metoder, for eksempel petrisfarging. Denne modellen muliggjør direkte vurdering av effekten av genetiske avvik eller behandlingsstrategier på lungekreftutvikling hos mus.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Lunge svulst celle rekruttering analysen

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

En Murine ortotopiske Blære Tumor Model og Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Avbildning av bosatt CD8 T-lymfocytter i menneskelig lunge svulst skiver bruker AC Confocal mikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Etablering av en lunge kolonisering analysen for sirkulerende svulst celle effekt i lunge vev

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuklidenes-fluorescens Reporter genet å spore svulst progresjon i gnager svulst modeller

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Sanntid påvisning av i Vitro svulst celle apoptose indusert av CD8+ T celler å studere immun undertrykkende funksjoner av svulst-infiltrere myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering og opplisting av sirkulerende tumor celler fra ikke-liten celle Lungekreftpasienter ved Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

Perfusjon og inflasjon av musen lunge for tumor histologi

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...

Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

Flerdimensjonal kokultur system for å modellere lungeplatekarsinom progresjon

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Patologisk analyse av lungemetastase etter lateral hale-vene injeksjon av tumorceller

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...