Name: detection of lung tumor progression in mice by ultrasound imaging
Uploaded: 2020-02-27T12:30:00
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Agradecemos ao Dr. I. Verma pelo vetor lentiviral Ca2Cre-shp53. O trabalho foi apoiado por fundos dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR MOP 137113) para a AEK.

Os estudos em animais foram realizados de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade McGill e os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Bem-Estar Animal da Universidade McGill (protocolo de uso animal nº 2009-5754).
1. Geração de CA2Cre-shp53 Titre Lentiviral
NOTA: O seguinte protocolo é o mesmo descrito em Xia et al.6,com pequenas modificações.
<ol><li>Preparação do lentivírus (p...

<ol>
	<li>Eisenstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine:+Special+treatment.">Personalized medicine: Special treatment.</a> Nature. 513, 8 (2014).</li><li>Karachaliou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+mutations+in+lung+cancer.">KRAS mutations in lung cancer.</a> Clinical Lung Cancer. 14 (3), 205-214 (2013).</li><li>Jackson, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+lung+tumor+initiation+and+progression+using+conditional+expression+of+oncogenic+K-ras.">Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras.</a> Genes &amp; Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).</li><li>DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+mouse+lung+cancer+models+using+adenoviral+or+lentiviral+delivery+of+Cre+recombinase.">Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase.</a> Nature Protocol. 4 (7), 1064-1072 (2009).</li><li>Chen, J., Lecuona, E., Briva, A., Welch, L. C., Sznajder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbonic+anhydrase+II+and+alveolar+fluid+reabsorption+during+hypercapnia.">Carbonic anhydrase II and alveolar fluid reabsorption during hypercapnia.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 38 (1), 32-37 (2008).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cell+proliferation+by+IKK2+depletion+in+a+mouse+lung-cancer+model.">Reduced cell proliferation by IKK2 depletion in a mouse lung-cancer model.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 532 (2015).</li><li>Demi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+a+potential+quantitative+measure+of+the+state+of+the+lung+using+lung+ultrasound+spectroscopy.">Determination of a potential quantitative measure of the state of the lung using lung ultrasound spectroscopy.</a> Scientific Reports. 7, 12746 (2017).</li><li>Mohanty, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Lung+Parenchyma+Using+Ultrasound+Multiple+Scattering.">Characterization of the Lung Parenchyma Using Ultrasound Multiple Scattering.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43, 993-1003 (2017).</li><li>Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Method+for+Rapid+Intubation+of+the+Trachea+in+Mice.">An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).</li><li>Saraogi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+ultrasound:+Present+and+future.">Lung ultrasound: Present and future.</a> Lung India. 32 (3), 250-257 (2015).</li><li>Gargani, L., Volpicelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+I+do+it:+lung+ultrasound.">How I do it: lung ultrasound.</a> Cardiovascular Ultrasound. 12, 25 (2014).</li><li>Soldati, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Physical+Basis+of+Pulmonary+Sonographic+Interstitial+Syndrome.">On the Physical Basis of Pulmonary Sonographic Interstitial Syndrome.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 35 (10), 2975 (2016).</li><li>Raes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Ultrasound+and+Photoacoustic+Imaging+of+Orthotopic+Lung+Cancer+in+Mice:+New+Perspectives+for+Onco-Pharmacology.">High-Resolution Ultrasound and Photoacoustic Imaging of Orthotopic Lung Cancer in Mice: New Perspectives for Onco-Pharmacology.</a> PLoS One. 11 (4), 15 (2016).</li><li>Lakshman, M., Needles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+quantification+of+the+tumor+microenvironment+with+micro-ultrasound+and+photoacoustic+imaging.">Screening and quantification of the tumor microenvironment with micro-ultrasound and photoacoustic imaging.</a> Nature Methods. 12 (4), 372 (2015).</li><li>Chichra, A., Makaryus, M., Chaudhri, P., Narasimhan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+for+the+Pulmonary+Consultant.">Ultrasound for the Pulmonary Consultant.</a> Clinical Medicine Insights: Circulatory Respiratory and Pulmonary Medicine. 10, 9 (2016).</li></ol>

Demonstramos um método que pode avaliar o crescimento do tumor pulmonar no modelo de camundongos LSL-KRAS G12D cre-indutor por ultrassom. Este método pode ser usado para avaliar o efeito dos inibidores farmacológicos no crescimento do tumor pulmonar. Também pode ser usado para comparar o crescimento do tumor pulmonar entre camundongos de diferentes origens genéticas. O uso dessa técnica não requer habilidades computacionais especializadas, no entanto, é importante ser sistemático no número de quadros utilizados...

Como a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, o câncer de pulmão permanece refratário aos tratamentos, principalmente pela falta de modelos pré-clínicos relevantes que possam recapitular a doença no laboratório1. Cerca de 25% dos casos de câncer de pulmão são devido a mutações no oncogene KRAS2. O câncer de pulmão orientado por KRAS está frequentemente associado ao mau prognóstico e baixa resposta à terapia, destacando a importância de estudos adicionais nesta doença2.
Otimizamos um método que permite a avaliação relativa do crescimento do tumor pulmonar em tempo real em camundongos imunes induzidos pelo câncer de pulmão do KRAS. Usamos ratos Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) nos quais o oncogene KRAS G12D pode ser expresso pelos vetores cre lentiviral3,4. Esses vetores são impulsionados pela anidrise carbônica 2, permitindo que a infecção viral ocorra especificamente nas células epiteliais aveolar5. Além disso, para acelerar a iniciação e progressão de tumores pulmonares, a construção lentiviral também expressa P53 shRNA de um promotor U6/H1 (a construção lentiviral aqui será referida como Ca2Cre-shp53)6. A relevância biológica desse método está no curso natural do desenvolvimento de tumores pulmonares em camundongos em oposição a xenôenxetos de tumores não ortotópicos em camundongos. Um obstáculo usando o método ortotópico é monitorar o crescimento do tumor pulmonar sem sacrificar o camundongo. Para superar essa limitação, otimizamos a ultrassom para permitir a análise da progressão do tumor pulmonar no modo bidimensional (2D) neste modelo de camundongo. A imitência de tumores a 7 semanas após a infecção se reflete como linhas B em imagens de ultrassom, que podem ser contadas, mas não refletirão o número exato de tumores presentes no pulmão. As linhas B são caracterizadas por linhas brancas verticais semelhantes a laser decorrentes da linha pleural na parenchymapulmonar 7,8. Tumores grandes podem ser visualizados após 18 semanas de infecção. O volume relativo desses tumores é quantificado por medidas 2D feitas no ultrassom.
Este método é ótimo para pesquisadores que investigam o efeito de drogas farmacológicas no crescimento do tumor pulmonar no modelo de camundongos LSL-KRAS G12D. Além disso, a progressão do tumor pulmonar pode ser comparada entre camundongos com diferentes linhagens genéticas, para examinar a importância da presença ou ausência de certos genes/proteínas no desenvolvimento do volume de tumores pulmonares.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m Acrodisc Syringe Filters</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>PN 4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm Cell Cultre Plate</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>664 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell Culture Plate</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>657 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra - 15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Merck Millipore Ltd.</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR-Fortessa</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>649225B 3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA2Cre-shp53 lentiviral vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From Dr. I Verma Laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>80450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSL-KRASG12D mouse</td>
			<td>JAX Mice</td>
			<td>8179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX550S; Centre Transmit: 40 MHz</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics</td>
			<td>51070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PsPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEVO-3100</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics</td>
			<td>51072-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of lung tumor progression in mice by ultrasound imaging

Com ~1,6 milhão de vítimas por ano, o câncer de pulmão contribui tremendamente para a carga mundial do câncer. O câncer de pulmão é parcialmente impulsionado por alterações genéticas em oncogenes como o oncogene KRAS, que constitui ~25% dos casos de câncer de pulmão. A dificuldade em mirar terapêuticamente o câncer de pulmão orientado pelo KRAS em parte decorre de ter modelos ruins que podem imitar a progressão da doença em laboratório. Descrevemos um método que permite a quantificação relativa dos tumores pulmonares KRAS primários em um modelo de rato LSL-KRAS G12D cre-induável através de imagens de ultrassom. Este método depende da aquisição do modo de brilho (B) do parenchyma pulmonar. Os tumores que são inicialmente formados neste modelo são visualizados como linhas B e podem ser quantificados contando o número de linhas B presentes nas imagens adquiridas. Estes representariam o número relativo do tumor formado na superfície do pulmão do rato. À medida que os tumores formados se desenvolvem com o tempo, eles são percebidos como fendas profundas dentro do parenchyma pulmonar. Uma vez que a circunferência do tumor formado é bem definida, calcular o volume relativo do tumor é alcançado medindo o comprimento e largura do tumor e aplicando-os na fórmula utilizada para medições de caliper tumoral. A imagem de ultrassom é uma técnica não invasiva, rápida e fácil de usar que é frequentemente usada para quantificações tumorais em camundongos. Embora os artefatos possam aparecer ao obter imagens de ultrassom, mostrou-se que essa técnica de imagem é mais vantajosa para quantificações tumorais em camundongos em comparação com outras técnicas de imagem, como imagens de tomografia computadorizada (TC) e imagem de bioluminescência (BLI). Os pesquisadores podem investigar novos alvos terapêuticos usando essa técnica comparando a iniciação do tumor pulmonar e a progressão entre diferentes grupos de camundongos.

Depois de obter um díter infeccioso lentiviral de ~2 x 106 TU/mL (Figura 1),o lentivírus Ca2Cre-shp53 foi injetado intratrachealmente quando os ratos LSL-KRAS G12D atingiram uma idade apropriada (6-8 semanas)9. A ultrassonografia foi realizada após 7 semanas de infecção após o início dos tumores (Figura 3B). A imagem foi feita em 7 semanas para incluir os vários tipos de lesões precursoras que ocorrem ...

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Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Este protocolo descreve as medidas tomadas para induzir tumores pulmonares KRAS em camundongos, bem como a quantificação de tumores formados por ultrassom. Pequenos tumores são visualizados nos primeiros tempos como linhas B. Em momentos posteriores, as medidas relativas do volume tumoral são alcançadas pela ferramenta de medição no software de ultrassom.

Detecção de Progressão do Tumor Pulmonar em Camundongos por ultrassom

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

A importância deste protocolo reside na detectabilidade em tempo real dos tumores pulmonares que se desenvolveram espontaneamente neste modelo de camundongos, desde a iniciação do tumor até a progressão do tumor. A vantagem dessa técnica é que não é invasiva, é exigir apenas habilidade básica e nos permitir monitorar diretamente o efeito da droga e o tratamento de interesse. A progressão do tumor pulmonar também pode ser avaliada na presença ou ausência de um gene de interesse.Por meio dessa análise, novas estratégias de tratamento podem ser potencialmente estendidas à clínica. Sete e 18 semanas após a intubação lentiviral, ligue a bomba de aquecimento para o gel de ultrassom e o monitor de temperatura e configure uma incubadora de 33 graus celsius. Coloque o motor 3D no sistema ferroviário integrado e confirme que o sistema de montagem do motor e do transdutor estão seguros no lugar.Conecte um transdutor de frequência de 40 hertz ao motor 3D e abra um novo estudo no software de ultrassom. Na nova janela de estudo, digite o nome do estudo. Na janela de nomes da série, digite o nome da série e quaisquer outras informações relevantes.Após o clique feito, selecione o tipo de transdutor. O programa mudará para o modo B. Coloque uma lâmpada de aquecimento em uma posição conveniente acima da plataforma animal e confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal no rato experimental anestesiado.Coloque o rato na plataforma animal no ventral cubitus e aplique pomada aos olhos do animal. Fixar os membros firmemente na plataforma com fita adesiva e aplicar uma fina camada do gel de ultrassom aquecido no peito do animal. Use o botão de controle de altura para baixar a sonda de aquisição até que toque a superfície do baú do mouse e posicione a sonda de tal forma que o coração do mouse esteja aproximadamente centrado.Em seguida, use os micro botões para adquirir imagens de todo o peito de ambas as extremidades na orientação transversal. Idealmente reunindo 500 quadros por mouse. Quando todas as imagens tiverem sido capturadas, limpe o gel do peito do rato e coloque o animal na incubadora de aquecimento.Para análise 2D das imagens de ultrassom, abra os quadros adquiridos no software de ultrassom e escaneie manualmente os quadros para tumores. Para pequenos tumores iniciantes, conte o número de linhas de abelhas periodicamente a cada 10 quadros para o comprimento total dos 500 quadros adquiridos. Para medições 2D de tumores grandes use a ferramenta linear para medir a largura e o comprimento do tumor presente, em seguida, calcule o volume dos tumores usando a fórmula.Sete semanas após a infecção intra traqueal, a imagem de ultrassom é realizada para visualizar os vários tipos de lesões precursoras que ocorrem no modelo experimental do camundongo após a injeção. Essas lesões precursoras identificadas por beelina podem ser contadas pelo olho e representam pequenos tumores na superfície dos pulmões. A dispersão desses dados permite quantificação dos tumores dentro dos camundongos experimentais para permitir a estimativa do número relativo de tumor por animal.Com 18 semanas após a infecção, grandes tumores aparecem como fissuras profundas interrompendo a superfície plural que pode ser medida dentro do software de ultrassom. O volume relativo do tumor pode então ser quantificado para análise estatística. A hematoxilina e a coloração de eosina em seções pulmonares colhidas a 20 semanas após a infecção confirmam a formação de tumores grandes, bem como a formação de adenoma e adenocarcinoma.É importante não confundir os tumores pulmonares, que são dinâmicos, com falsos positivos, que são estáticos. Como a qualificação do número de tumores do volume é relativa neste método, sugerimos o uso de métodos adicionais, como a coloração de petri. Este modelo permite a avaliação direta dos efeitos de aberrações genéticas ou estratégias de tratamento no desenvolvimento do câncer de pulmão em camundongos.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Ensaio de recrutamento de células de Tumor de pulmão

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Pesquisa do câncer

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Um modelo de tumor de murino de bexiga ortotópico e Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

O estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de Tumor nos tecidos do pulmão de circulação

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuclídeo-fluorescência Gene do repórter de imagem para controlar a progressão do Tumor em modelos de roedores Tumor

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Detecção de tempo real em Vitro Tumor celular apoptose induzida por CD8+ T células para estudar as funções imunológicas supressora de Tumor infiltrando células mieloides

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Caracterização e enumeração semiautomáticas de PD-L1 de células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas por imunofluorescência

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

Perfusão e Inflação do Pulmão do Rato para Histologia tumoral

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...

Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

Sistema de Cocultura Multidimensional para Modelar Progressão do Carcinoma Escamoso Pulmonar

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Análise patológica da metástase pulmonar após injeção lateral de cauda-veia de células tumorais

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...