Name: detection of lung tumor progression in mice by ultrasound imaging
Uploaded: 2020-02-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging at JoVE.com

Vi tackar Dr I. Verma för den lentivirala Ca2Cre-shp53 vektorn. Arbetet stöddes av medel från Canadian Institutes of Health Research (CIHR MOP 137113) till AEK.

Djurstudier utfördes i enlighet med Kommittén för institutionsdjursvård och användning (IACUC) vid McGill University och förfaranden godkändes av Kommittén för djurskydd vid McGill University (djuranvändningsprotokoll # 2009-5754).
1. Generation av CA2Cre-shp53 Lentiviral Titre
OBS: Följande protokoll är detsamma som det som beskrivs i Xia et al.6, med mindre ändringar.
<ol><li>Beredning av lentivirus (för 15 cm x 10 cm rätte...

<ol>
	<li>Eisenstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine:+Special+treatment.">Personalized medicine: Special treatment.</a> Nature. 513, 8 (2014).</li><li>Karachaliou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+mutations+in+lung+cancer.">KRAS mutations in lung cancer.</a> Clinical Lung Cancer. 14 (3), 205-214 (2013).</li><li>Jackson, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+lung+tumor+initiation+and+progression+using+conditional+expression+of+oncogenic+K-ras.">Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras.</a> Genes &amp; Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).</li><li>DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+mouse+lung+cancer+models+using+adenoviral+or+lentiviral+delivery+of+Cre+recombinase.">Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase.</a> Nature Protocol. 4 (7), 1064-1072 (2009).</li><li>Chen, J., Lecuona, E., Briva, A., Welch, L. C., Sznajder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbonic+anhydrase+II+and+alveolar+fluid+reabsorption+during+hypercapnia.">Carbonic anhydrase II and alveolar fluid reabsorption during hypercapnia.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 38 (1), 32-37 (2008).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cell+proliferation+by+IKK2+depletion+in+a+mouse+lung-cancer+model.">Reduced cell proliferation by IKK2 depletion in a mouse lung-cancer model.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 532 (2015).</li><li>Demi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+a+potential+quantitative+measure+of+the+state+of+the+lung+using+lung+ultrasound+spectroscopy.">Determination of a potential quantitative measure of the state of the lung using lung ultrasound spectroscopy.</a> Scientific Reports. 7, 12746 (2017).</li><li>Mohanty, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Lung+Parenchyma+Using+Ultrasound+Multiple+Scattering.">Characterization of the Lung Parenchyma Using Ultrasound Multiple Scattering.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43, 993-1003 (2017).</li><li>Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Method+for+Rapid+Intubation+of+the+Trachea+in+Mice.">An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).</li><li>Saraogi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+ultrasound:+Present+and+future.">Lung ultrasound: Present and future.</a> Lung India. 32 (3), 250-257 (2015).</li><li>Gargani, L., Volpicelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+I+do+it:+lung+ultrasound.">How I do it: lung ultrasound.</a> Cardiovascular Ultrasound. 12, 25 (2014).</li><li>Soldati, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Physical+Basis+of+Pulmonary+Sonographic+Interstitial+Syndrome.">On the Physical Basis of Pulmonary Sonographic Interstitial Syndrome.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 35 (10), 2975 (2016).</li><li>Raes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Ultrasound+and+Photoacoustic+Imaging+of+Orthotopic+Lung+Cancer+in+Mice:+New+Perspectives+for+Onco-Pharmacology.">High-Resolution Ultrasound and Photoacoustic Imaging of Orthotopic Lung Cancer in Mice: New Perspectives for Onco-Pharmacology.</a> PLoS One. 11 (4), 15 (2016).</li><li>Lakshman, M., Needles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+quantification+of+the+tumor+microenvironment+with+micro-ultrasound+and+photoacoustic+imaging.">Screening and quantification of the tumor microenvironment with micro-ultrasound and photoacoustic imaging.</a> Nature Methods. 12 (4), 372 (2015).</li><li>Chichra, A., Makaryus, M., Chaudhri, P., Narasimhan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+for+the+Pulmonary+Consultant.">Ultrasound for the Pulmonary Consultant.</a> Clinical Medicine Insights: Circulatory Respiratory and Pulmonary Medicine. 10, 9 (2016).</li></ol>

Vi visar en metod som kan bedöma lungtumörtillväxt i Cre-induceradLSL-KRAS G12D musmodell med ultraljud. Denna metod kan användas för att utvärdera effekten av farmakologiska hämmare på lungtumörtillväxt. Det kan också användas för att jämföra lungtumörtillväxt mellan möss av olika genetiska bakgrunder. Med hjälp av denna teknik kräver inte specialiserade beräkningsfärdigheter, men det är viktigt att vara systematisk i antalet ramar som används för analys för att möjliggöra en korrekt jämför...

Som den främsta orsaken till cancerrelaterade dödsfall över hela världen, lungcancer är fortfarande eldfasta till behandlingar, främst på grund av brist på relevanta prekliniska modeller som kan sammanfatta sjukdomen i labbet1. Omkring 25% av lungcancer fall beror på mutationer i KRAS oncogene2. KRAS-driven lungcancer är ofta förknippad med dålig prognos och låg reaktion på terapi, belyser vikten av ytterligare studier i denna sjukdom2.
Vi optimerade en metod som möjliggör relativ utvärdering av lungtumörtillväxt i realtid i KRAS lungcancer-inducerad immun-kompetentmöss. Vi använder Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) möss där KRAS G12D oncogene kan uttryckas av Cre lentivirala vektorer3,4. Dessa vektorer drivs av kolsyraanhydras 2, vilket gör att virusinfektion en exakt i alveolar epitelceller5. Dessutom, för att påskynda inledande och progression av lungtumörer, den lentivirala konstruktionen uttrycker också P53 shRNA från en U6/H1 promotor (den lentivirala konstruktionen häri kommer att kallas Ca2Cre-shp53)6. Den biologiska relevansen av denna metod ligger i den naturliga kursen av lungtumörutveckling hos möss i motsats till xenografts av icke-ortopediska tumörer hos möss. Ett hinder med hjälp av ortopediska metoden är att övervaka lungtumör tillväxt utan att offra musen. För att övervinna denna begränsning optimerade vi ultraljudsavbildning för att möjliggöra analys av lungtumörprogression i tvådimensionellt (2D) läge i denna musmodell. Initiera tumörer vid 7 veckor efter infektion återspeglas som B-linjer i ultraljud bilder, som kan räknas, men kommer inte att återspegla det exakta antalet tumörer som finns på lungan. B-linjer kännetecknas av laser-liknande vertikala vita linjer som härrör från pleura linjen i lungparenkymen7,8. Stora tumörer kan visualiseras efter 18 veckors infektion. Den relativa volymen av dessa tumörer kvantifieras av 2D-mätningar gjorda på ultraljud.
Denna metod är optimal för forskare som undersöker effekten av farmakologiska läkemedel på lungtumörtillväxt i LSL-KRAS G12D-musmodellen. Dessutom kan lungtumörprogression jämföras mellan möss med olika genetiska härstamningar, för att undersöka vikten av närvaron eller frånvaron av vissa gener/proteiner på utvecklingen av lungtumörvolym.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m Acrodisc Syringe Filters</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>PN 4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm Cell Cultre Plate</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>664 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell Culture Plate</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>657 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra - 15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Merck Millipore Ltd.</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR-Fortessa</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>649225B 3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA2Cre-shp53 lentiviral vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From Dr. I Verma Laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>80450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSL-KRASG12D mouse</td>
			<td>JAX Mice</td>
			<td>8179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX550S; Centre Transmit: 40 MHz</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics</td>
			<td>51070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PsPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEVO-3100</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics</td>
			<td>51072-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of lung tumor progression in mice by ultrasound imaging

Med ~ 1,6 miljoner offer per år, bidrar lungcancer oerhört till den globala bördan av cancer. Lungcancer drivs delvis av genetiska förändringar i onkogener som KRAS oncogene, som utgör ~ 25% av lungcancer fall. Svårigheten att terapeutiskt rikta KRAS-driven lungcancer beror delvis på att ha dåliga modeller som kan efterlikna utvecklingen av sjukdomen i labbet. Vi beskriver en metod som tillåter relativ kvantifiering av primära KRAS lungtumörer i en Cre-inducerad LSL-KRAS G12D mus modell via ultraljud imaging. Denna metod bygger på ljusstyrka (B)-mode förvärv av lungparenkymen. Tumörer som ursprungligen bildas i denna modell visualiseras som B-linjer och kan kvantifieras genom att räkna antalet B-linjer som finns i de förvärvade bilderna. Dessa skulle representera det relativa tumörnumret som bildas på ytan av muslungan. Som de bildade tumörer utvecklas med tiden, de uppfattas som djupa klyftor inom lungparenkymen. Eftersom omkretsen av den bildade tumören är väl definierad, beräkna den relativa tumörvolymen uppnås genom att mäta längden och bredden på tumören och tillämpa dem i formeln som används för tumör bromsok mätningar. Ultraljud imaging är en icke-invasiv, snabb och användarvänlig teknik som ofta används för tumör kvantifieringar hos möss. Även artefakter kan visas när du får ultraljud bilder, har det visat sig att denna bildteknik är mer fördelaktigt för tumör kvantifieringar hos möss jämfört med andra bildtekniker såsom datortomografi (CT) bildbehandling och bioluminescensavbildning (BLI). Forskare kan undersöka nya terapeutiska mål med hjälp av denna teknik genom att jämföra lungtumör initiering och progression mellan olika grupper av möss.

Efter att ha fått en lentiviral smittsam titer på ~2 x 106 TU/ml (figur 1), injicerades Ca2Cre-shp53 lentivirus intratracheally när LSL-KRAS G12D möss nådde en lämplig ålder (6−8 veckor)9. Ultraljudsbild utfördes efter 7 veckors infektion vid initiering av tumörer (figur 3B). Imaging gjordes vid 7 veckor för att inkludera de olika typer av prekursor skador som förekommer i LSL-KRASG12D m...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging at JoVE.com

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Detta protokoll beskriver de åtgärder som vidtagits för att inducera KRAS lungtumörer hos möss samt kvantifiering av bildade tumörer genom ultraljudsavbildning. Små tumörer visualiseras i tidiga timepoints som B-linjer. Vid senare tidpunkter uppnås relativa tumörvolymmätningar genom mätverktyget i ultraljudsprogrammet.

Upptäckt av lungtumörprogression hos möss av ultraljudsavbildning

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Betydelsen av detta protokoll ligger i realtid detekterbarhet av lungtumörer som utvecklats spontant i denna mus modell, från tumör initiering till tumör progression. Fördelen med denna teknik är som är icke-invasiv, är kräver endast grundläggande skicklighet och tillåter oss att direkt övervaka effekten av läkemedlet och behandling av intresse. Lungtumörprogression kan också utvärderas i närvaro eller frånvaro av en gen av intresse.Med hjälp av denna analys kan nya behandlingsstrategier eventuellt utvidgas till kliniken. Sju och 18 veckor efter lentiviral intubation, slå på värmepumpen för ultraljud gel och temperaturmonitorn och inrätta en 33 grader celsius inkubator. Placera 3D-motorn på det integrerade skensystemet och bekräfta att motorn och givarens monteringssystem är säkrat på plats.Anslut en 40 hertz frekvens givare till 3D-motor och öppna en ny studie i ultraljud programvara. I det nya studiefönstret anger du studienamnet. I fönstret med serienamn anger du serienamn och eventuell annan relevant information.När du har klickat på klar, välj transducer typ. Programmet kommer att ändras till B-läge. Placera en värmelampa i ett bekvämt läge ovanför djurplattformen och bekräfta en brist på respons på pedalreflex i den sövda experimentmusen.Placera musen på djurplattformen i cubitus ventrala och applicera salva på djurets ögon. Säkra lemmarna ordentligt till plattformen med tejp och applicera ett tunt lager av den uppvärmda ultraljudsgelen på djurets bröst. Använd höjdkontrollratten för att sänka förvärvssonden tills den vidrör ytan på muskistan och placera sonden så att musens hjärta är ungefär centrerat.Använd sedan mikrovredarna för att förvärva bilder av hela bröstet från båda extremiteterna i tvärgående orientering. Helst samla 500 bilder per mus. När alla bilder har fångats, rengör gelen från bröstet på musen och placera djuret i den värmande inkubatorn.För 2D-analys av ultraljudsbilderna öppnar du de förvärvade ramarna i ultraljudsmjukvaran och skannar manuellt ramarna efter tumörer. För små initierande tumörer, räkna antalet beelines periodiskt varje 10 ramar för hela längden av de 500 ramar som förvärvats. För 2D-mätningar av stora tumörer använda det linjära verktyget för att mäta bredden och längden på tumören närvarande, sedan beräkna volymen av tumörerna med hjälp av formeln.Sju veckor efter intra trakeal infektion, ultraljud imaging utförs för att visualisera de olika typer av prekursor skador som förekommer i den experimentella musmodellen efter injektionen. Dessa beeline identifierade föregångare skador kan räknas av ögat och representerar små tumörer på ytan av lungorna. Spridnings plottning av dessa data möjliggör kvantifiering av tumörerna inom de experimentella mössen för att tillåta uppskattning av det relativa tumörnumret per djur.Vid 18 veckor efter infektion, stora tumörer visas som djupa klyftor avbryta plural yta som kan mätas inom ultraljud programvara. Den relativa tumörvolymen kan sedan kvantifieras för statistisk analys. Hematoxylin och eosin färgning på lung sektioner skördas vid 20 veckor post infektion bekräftar bildandet av stora tumörer samt bildandet av adenom och adenocarcinom.Det är viktigt att inte blanda ihop lungtumörerna, som är dynamiska, med falska positiva, som är statiska. Eftersom kvalificeringen av tumörnumret av volymen är relativ i denna metod, föreslår vi att använda ytterligare metoder, såsom petri färgning. Denna modell möjliggör direkt bedömning av effekterna av genetiska avvikelser eller behandlingsstrategier på lungcancer utveckling hos möss.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Lung tumör Cell rekrytering Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

En Murin Orthotopic blåstumör modell och Tumör Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Avbildning av bosatta CD8 T-lymfocyter i Human Lung tumör skivor med konfokalmikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Inrättandet av en Lung Colonization analys för cirkulerande tumör Cell visualisering i lungvävnad

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuklid-fluorescens Reporter gen Imaging för att spåra tumör Progression i gnagare tumör modeller

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid upptäcka i Vitro tumör Cell apoptos induceras av CD8+ T celler att studera suppressiv immunförsvaret av tumör-infiltrera myeloida celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering och uppräkning av cirkulerande tumörceller från icke-småcellig Lung cancer patienter genom Immunofluorescensering

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

Perfusion och inflation av muslungan för tumör histologi

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...

Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

Flerdimensionella coculture system för att modellera Lung Skivepitelcancer Progression

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Patologisk analys av lungmetastasering efter lateral svansveninjektion av tumörceller

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...