Name: nf-&#954;b-dependent luciferase activation and quantification of gene expression in salmonella infected tissue culture cells
Uploaded: 2020-01-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NF-ÃŽÂºB-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells at JoVE.com

ويدعم البحوث في مختبر كيسترا-غندر بمنح من NIAID من المعاهد القومية للصحة تحت رقم الجائزة R21AI122092 ومن جمعيه السكري الامريكيه تحت جائزه رقم 1-18-JDF-035.

1. خليه العبور والبذر
<ol><li>الحفاظ علي الخلايا هيلا 57A في 75 سم2 قارورة تحتوي علي 10 مل من وسائل الاعلام النسر المعدلة دولبيكو (dmem) تستكمل مع 5 ٪ الحرارة الجنين البقري المنشط المصل (الدم) في 37 درجه مئوية في 5 ٪ CO2 حاضنه.</li>
	<li>يستنشق الخلية ثقافة الاعلام ويغسل مع 1 مل من 0.05 ٪ من الحل تريبس?...

<ol>
	<li>Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+signaling+in+inflammation.">NF-kappaB signaling in inflammation.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).</li><li>Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB:+a+stress-regulated+switch+for+cell+survival.">NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 8 (3-4), 478-486 (2006).</li><li>Lawrence, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+factor+NF-kappaB+pathway+in+inflammation.">The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), a001651 (2009).</li><li>Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+ICP27-dependent+activation+of+NF-kappaB.">Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB.</a> Journal of Virology. 80 (21), 10565-10578 (2006).</li><li>Zaragoza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+protease+cleavage+of+inhibitor+of+kappaBalpha+triggers+host+cell+apoptosis.">Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103 (50), 19051-19056 (2006).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+effector+binding+to+ribosomal+protein+s3+subverts+NF-kappaB+function.">Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function.</a> PLOS Pathogens. 5 (12), e1000708 (2009).</li><li>Kravchenko, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gene+expression+via+disruption+of+NF-kappaB+signaling+by+a+bacterial+small+molecule.">Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule.</a> Science. 321 (5886), 259-263 (2008).</li><li>Kawai, T., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+to+NF-kappaB+by+Toll-like+receptors.">Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors.</a> Trends in Molecular Medicine. 13 (11), 460-469 (2007).</li><li>Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Targeting+by+Enteropathogenic+Bacteria+T3SS+Effectors.">Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors.</a> Trends in Microbiology. 26 (4), 266-283 (2018).</li><li>Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+NF-kappaB+is+activated:+the+role+of+the+IkappaB+kinase+(IKK)+complex.">How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex.</a> Oncogene. , (1999).</li><li>Berti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+RT-PCR+analysis+of+inflammatory+gene+expression+associated+with+ischemia-reperfusion+brain+injury.">Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 22 (9), 1068-1079 (2002).</li><li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li><li>Holden, N. S., Tacon, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+problems+of+the+electrophoretic+mobility+shift+assay.">Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63 (1), 7-14 (2011).</li><li>Renard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB.">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Research. 29 (4), E21 (2001).</li><li>Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation.">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39 (5), 715-725 (2005).</li><li>Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+NF-kappaB+Activation+in+TLR-Activated+Macrophages.">Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).</li><li>Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+retention+of+IkappaBalpha+protects+it+from+signal-induced+degradation+and+inhibits+nuclear+factor+kappaB+transcriptional+activation.">Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 9108-9115 (1999).</li><li>Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+endoplasmic+reticulum+stress+response+impacts+the+NOD1+signaling+pathway.">Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway.</a> Infection and Immunity. , (2019).</li><li>Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aromatic-Dependent+Salmonella-Typhimurium+Are+Non-Virulent+and+Effective+as+Live+Vaccines.">Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines.</a> Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).</li><li>Keestra, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+small+Rho+GTPases+is+a+pathogen-induced+process+detected+by+NOD1.">Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1.</a> Nature. 496 (7444), 233-237 (2013).</li><li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+characterization+of+NF-kappaB+binding+uncovers+non-canonical+motifs+and+advances+the+interpretation+of+genetic+functional+traits.">Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits.</a> Genome Biology. 12 (7), R70 (2011).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+mutants+as+sensors+of+proteome+stress.">Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress.</a> Nature Methods. 8 (10), 879-884 (2011).</li><li>Cogswell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappa+B+regulates+IL-1+beta+transcription+through+a+consensus+NF-kappa+B+binding+site+and+a+nonconsensus+CRE-like+site.">NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site.</a> Journal of Immunology. 153 (2), 712-723 (1994).</li><li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Heterodimeric+Cysteine+Protease+Is+Required+for+Interleukin-1-Beta+Processing+in+Monocytes.">A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes.</a> Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).</li></ol>

المساهمة الرئيسية للبروتوكول الموصوفة هي انه يوفر طريقه سريعة وسهله للكشف عن التنشيط NF-κB في الخلايا ، والذي يسمح لتحليل الانتاجيه العالية من الظروف تنشيطية متعددة أو الادويه التي تؤثر علي تنشيط NF-κB. هنا ، ونحن وصف بروتوكول لتنشيط NF-κB في الخلايا هيلا المصابة السالمونيلا. ويمكن استخد?...

العامل النووي-κB (نف-κB) الاسره من البروتينات هي المنشطات النسخ الهامه التي تنظم التعبير الجيني في مختلف المسارات البيولوجية. تنشيط NF-κb يدفع النسخ من الجينات المستهدفة ، والعديد منها مهمة للاستجابات المناعية والتهابيه ، وانتشار الخلايا ، والاستجابات الإجهاد والسرطان التقدم1،2. NF-κB يلعب دورا أساسيا في التوسط في النتائج التهابيه المبكرة لأزاله الممرض. النظر إلى العمليات البيولوجية العديدة التي توسط فيها NF-κB التنشيط ، يمكن ان يكون للاضطرابات في الإشارات لها عواقب وخيمه علي الصحة والمرض. فقدان الطفرات وظيفة في NF-κB الإشارات المرتبطة في العديد من الظواهر الظاهرية نقص المناعة ، في حين يرتبط كسب الطفرات وظيفة مع عده أنواع من السرطانات ، بما في ذلك الأورام اللمفاوية الخلية B وسرطان الثدي3. بالاضافه إلى ذلك, وقد ثبت العديد من مسببات الامراض لتعدل مباشره حاله التنشيط NF-κb من خلال التعبير عن عوامل الضراوة4,5,6,7.
ومن المعروف ان تنشيط NF-κB لتكون نتيجة للعديد من المحفزات المتغيرة بما في ذلك المنتجات البكتيرية مثل الليبووليساشاريدس (LPS) ، والصواري والتي تعرف باسم الأنماط الجزيئية المرتبطة بالممرض (PAMPs). يتم الكشف عن هذه PAMPs بواسطة مستقبلات التعرف علي النمط (PRRs) مثل مستقبلات الأرقام مثل (TLRs) ومستقبلات شبيهه بالإيماءات (NLRs) مما يؤدي إلى تنشيط NF-κB والتعبير اللاحق لمجموعه من الجينات التهابيه NF-κB المعتمدة8. بالاضافه إلى التنشيط PRR من قبل PAMPs ، المنتجات البكتيرية الأخرى ، مثل البروتينات البكتيرية المستجيب ، يمكن ان تحفز تنشيط NF-κB. ومن المثير للاهتمام ، والبكتيريا أيضا التعبير عن البروتينات المستجيب الذي يخفف بنشاط NF-κB المسار وتعزيز الامراضيهم ، مما يؤكد علي اهميه NF-κB كوسيط أساسي للحصانة9.
هناك خمس وحدات فرعيه مختلفه التي تشكل الدمامل NF-κB ؛ p50 ، p52 ، ريلا (p65) ، RelB و cRel. الرئيسيتين NF-κB المتغايرة هي p50: ريلا و p52: الدمامل RelB. المنشطات NF-κB تنشيط ربط إلى مواقع الحمض النووي ، والمعروفة باسم المواقع κB ، في المروج ومحسن المناطق من الجينات المستهدفة المختلفة. في ظل ظروف التماثل الطبيعي ، يتفاعل NF-κB مع عائله من البروتينات المثبطة المعروفة باسم بروتينات IκB لتبقي غير نشطه. عند التحفيز ، فان IκB هو الفوسفارلاتيد من قبل كيناز IκB (IKK) ، والذي يسمح لها ان تكون مستهدفه للابده ، وبعد ذلك تدهور. التحلل من IκB ينشط NF-κB عن طريق الكشف عن اشاره التعريب النووي. NF-κB ثم ينتقل إلى النواة ، حيث انه يربط مواقع κB في منطقه المروج من الجينات المستهدفة وتعزيز النسخ10. التالي ، تفعيل nf-κb اوبريجولاتيس mrna التعبير عن الجينات الهدف nf-κb ، ويمكن قياس هذا التغيير من خلال اختبارات التحديد الكمي RNA مثل RT-qpcr11.
توجد عده طرق وتستخدم عاده لقياس التنشيط NF-κB ، بما في ذلك اختبارات تحول التنقل الكهربي (EMSA) ، والنقل النووي ، واختبارات مراسل الجينات. يستخدم EMSA للكشف عن مجمعات البروتين مع الأحماض النووية. يتم تجزئه الخلايا المحفزة لعزل البروتينات النووية ، بما في ذلك NF-κB ، الذي يتم احتضانه بعد ذلك مع نوكليوتيد الشعاعية التي تحتوي علي مجال ربط NF-κB. يتم تشغيل العينات علي هلام والتي تصوير عن طريق أوتوغرافي من 32P-المسمي الحمض النووي. إذا NF-κB موجود في جزء البروتين ، فانه سيتم ربط النيوبوتيدس ، والتي سوف تهاجر إبطا من خلال هلام والحاضر والعصابات المنفصلة. الكسور النووية من الخلايا التي تفتقر إلى تنشيط NF-κB (علي سبيل المثال ، خلايا التحكم غير المحفزة) سوف تنتج اي عصابات كما نوكليوديس تهاجر بشكل أسرع إلى نهاية الهلام. والعيب الرئيسي لهذا الأسلوب هو انه من الناحية الكمية إلى حد كبير في الحس الثنائي (اي ، أو إيقاف تشغيله) ولا يلتقط بشكل كاف اختلافات ذات مغزى في القدرة الملزمة NF-κB. بالاضافه إلى ذلك ، لا يعتبر هذا الأسلوب بنيات الكروماتين الهامه وظيفيا NF-κb الهدف الجينات12,13.
وعلي غرار الطريقة السابقة ، هناك اختبار "عدم التحول" الذي يتم فيه تغليف لوحات البئر المتعددة بالنواة التي تحتوي علي تسلسل الربط NF-κB. بعد العلاج من الخلايا مع الكسور النووية من البروتين ، وسوف NF-κB ربط إلى النيوبوتيدس منضما إلى البئر. وبعد ذلك تضاف الأجسام المضادة-NF-κB ، والتي ستتفاعل مع المنضم NF-κB وتنتج اشاره قياس ألوان تتناسب مع كميه NF-κB ، مما يشير إلى درجه التنشيط NF-κB. هذا الأسلوب هو مفيد علي EMSA في انه لا يتطلب الأحماض النووية الشعاعية والكمية ، في المقارنة. مهما, تحذير من هذا أسلوب ان هو ثانيه لا يميز بين [كروماتين] دول من [نف-Κب] هدف مورثات14.
طريقه أخرى التي NF-κb التنشيط قد يتم الكشف عنها بواسطة الكروماتين ايمونوبريسيبيتيشن (رقاقه) ، حيث الحمض النووي والبروتينات المتفاعلة هي عبر مرتبطة مع الفورمالديهايد والإيمونوبريسيبيتاتيد مع الأجسام المضادة لمكافحه nf-κb محدده. ثم يتم تنقيه شظايا النيوكليوتيد المحددة وتحديدها من خلال تضخيم PCR أو التسلسل الإنتاجي العالي المباشر. وتوفر النتائج المتولدة من هذه الطريقة نتائج شبه كميه للنشاط الملزم NF-κB مع الجينات المستهدفة. ومع ذلك ، فان النتائج تعتمد بشكل كبير علي شروط التثبيت وعمليات التنقية في كل خطوه15.
في اختبارات نقل المواقع النووية ، يتم تحفيز الخلايا للحث علي تنشيط NF-κB ومن ثم إصلاحها. يتم أضافه الأجسام المضادة لp65 إلى الخلايا الثابتة. وبدلا من ذلك ، يمكن وضع علامة علي الوحدة الفرعية p65 نفسها باستخدام ببتيد فلوري مثل الأخضر الفلوري الأخضر (GFP). في كلتا الحالتين ، سيسمح المناعي التصوير من توطين p65 لتحديد توزيع الخلوية. من خلال قياس نسبه البروتين الموضعي الخلوي والنووي ، يمكن للمحققين تحديد حاله التنشيط النسبية NF-κB. والعيب في هذا الأسلوب هو ان المناعي هو مضيعه للوقت نسبيا ، ويتطلب الأجسام المضادة مكلفه ، ويحتاج إلى خبره تقنيه أكبر نسبيا16.
ويشيع استخدام الجينات مراسل أدوات لدراسة الأنماط التنظيمية والتعبير من جين الفائدة. عاده ، يتم بناء الجينات مراسل من تسلسل المروج لجين الفائدة تنصهر إلى الترميز الجينات لبروتين قابل للكشف بسهوله. يتم اختيار البروتينات مع الانشطه الانزيميه ، فلوري ، أو خصائص التلالؤ عاده لقدرتها علي ان تكون التهاوي والكمية. وهكذا ، فان القراءة (علي سبيل المثال ، التلالؤ ، الفلورية) بمثابه اشاره للكشف عن التعبير الجيني. ويمكن بعد ذلك إدخال هذه الثوابت الصحفية في أنواع مختلفه من الخلايا ، مثل الخلايا الظهاريه أو الضامة.
الموصوفة في البروتوكول هو استخدام خط الخلية هيلا المستنسخة (هيلا 57a) التي يتم نقلها بشكل ثابت مع مراسل لوسيفيراز تحتوي علي ثلاث نسخ من توافق الآراء κb من κ الغلوبولين المناعي المنطقة17المروج. التعبير عن لوسيفيراز يعتمد علي تنشيط NF-κb ، الذي يحدث بعد تحفيز الخلايا. الخلايا المحفزة بسهوله باستخدام الخلية تحلل العازلة المقدمة في مجموعه الفحص لوسيفيراز. ثم يتم خلط جزء من محلله الخلية مع العازلة الفحص لوسيفيراز الذي يحتوي علي لوسيفيراز. Luciferin هو الركيزة من luciferin ومطلوب لتوليد الضوء في وجود luciferin. بعد الجمع بين العازلة الفحص مع lysate ، فان الحل تنبعث الضوء في عمليه تعرف باسم التلالؤ. كميه الضوء المنتجة ، نظرا في شمعه ، يتناسب مع كميه لوسيفيراز الموجودة في محلله وبمثابه مقياس للتنشيط NF-κb. وتفسر قراءات التجويف بالمقارنة مع معيار غير محفز لحساب النشاط NF-κB خط الأساس والاشاره نفسها مستقره لعده دقائق للسماح لقياس موثوق بها. الاضافه إلى ذلك ، يتم نقل خط الخلية هيلا 57A بشكل ثابت مع مراسل غالاكتوزيداز المستقلة NF-κB. المراسلة [β-غالاكتوزيداز عبر عن دستوريا, و [β-غالاكتوزيداز] نشاط يستطيع كنت قست إلى تحكم لخليه بقاء أو تغير في خليه أرقام17. ويمكن بعد ذلك تعديل قيم لوسيفيراز إلى قيم β-غالاكتوزيداز والإبلاغ عنها كزيادة اضعاف علي خلايا التحكم غير المحفزة.
منذ NF-κB هو عامل النسخ المسؤولة عن زيادة التعبير عن الجينات الهدف NF-κB المعتمدة ، ومتابعه التجربة للسيطرة علي NF-κB-تعتمد زيادة التعبير الجينات هو النسخ العكسي العددية تفاعل البلمره سلسله ( RT-qPCR). ان RT-qPCR هي طريقه حساسة للغاية يمكن من خلالها قياس التغيرات في التعبير الجيني علي عده أوامر بالحجم. يتم حصاد الخلايا المحفزة والمسيطرة للجيش النيبالي الريبي عبر استخراج كلوروفورم الفينول. بعد فصل مرحله, استخرجت [رنا] كالعنصر رئيسيه من الطبقة مائية. ثم عجلت RNA وغسلها لإنتاج بيليه نقيه. ثم يتم أعاده تشكيل هذا بيليه وتنظيفها من الحمض النووي الملوث عن طريق العلاج DNase. ثم يتم عكس الحمض النووي الريبي النقي لإنشاء DNA التكميلي (cDNA). ويمكن بعد ذلك تحليل هذه التقنية من خلال تقنيات PCR الكمية ، حيث يتم قياس وفره تسلسل mRNA محدده لتحديد التعبير الجيني. لا توضح هذه التقنية التحكم الانتقالي ، أو التعديل بعد الانتقالية ، أو وفره البروتين ، أو نشاط البروتين. ومع ذلك ، يتم تنظيم العديد من الجينات ، ولا سيما تلك التي تشارك في العمليات الموالية للالتهابات ، عن طريق NF-κB ووفرتها mRNA يدل علي التعبير عنها.
الطريقة المقترحة هنا يستخدم طريقه سريعة وبسيطه التي NF-κB التنشيط يمكن الكشف عنها عن طريق اختبارات التلالؤ من lysate الخلوية. ويمكن استخدام RT-qPCR من NF-κB الهدف التعبير الجيني لقياس التعبير عن جينات معينه ، فضلا عن التحقق من صحة النشاط الوظيفي NF-κB التنشيط. المزايا الرئيسية لمثل هذا النظام هي بساطته والسرعة ، والذي يسمح لفحص الانتاجيه العالية من مجموعه من الشروط التي تعدل NF-κB التنشيط. هذا البروتوكول هو مناسبه لخطوط الخلايا الأخرى التعبير عن NF-κB:: المراسل luciferase ، وقد ثبت في الخلايا 264.7 الخام المتحولة بشكل ثابت18. مقدار الوقت اللازم للتعامل مع العينات ، بدءا من تحلل الخلية لتوليد اشاره التلالؤ ، هو الحد الأدنى وياخذ فتره حوالي ساعة. قياس NF-κB يتطلب فقط المعدات المختبرية الاساسيه مثل لوحات مبهمه ، قارئ لوحه قادره علي قياس التلالؤ ، والبرمجيات تحليل البيانات البسيطة مثل برنامج جدول بيانات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive film</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>60941-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11665092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse treatment kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td>molecular grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa 57A cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref # 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP26181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>promega luciferase assay system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1501</td>
			<td>Cell lysis buffer &#38; luciferin substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time GAPDH forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-CCAGGAAATGAGCTTGAC 
			AAAGT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time GAPDH reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5-&#39;CCCACTCCTCCACCT 
			TTGAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time IL-23 forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5-&#39;GAGCCTTCTCTGCTCCC 
			TGAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time IL-23 reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time IL-6 forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GTAGCCGCCCCACACAGA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time IL-6 reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-CATGTCTCCTTTCTCAGG 
			GCTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4308228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL1344</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref # 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL1344 &#916;sipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref # 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL1344 &#916;sopE &#916;sipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref # 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4309155</td>
			<td>2x mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-reagent</td>
			<td>Molecular Research Center</td>
			<td>TR 118</td>
			<td>guanidine thiocyanate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP248450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well plate for PCR</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89218-294</td>
			<td>384-well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nf-&#954;b-dependent luciferase activation and quantification of gene expression in salmonella infected tissue culture cells

وينظم عامل النسخ ديميريك NF-κB العديد من مسارات الاستجابة الخلوية ، بما في ذلك المسارات التهابيه عن طريق الحث علي التعبير عن مختلف السايتوكينات والكيمياء الكيميائية. وأعرب عن الدستورية NF-κb ويتم عزله في عصارة من البروتين المثبطة عامل النووية من كابا الخفيفة ببتيد الجينات محسن في المانع الخلايا ب ، الفا (iκbα). تفعيل NF-κB يتطلب تدهور IκBα ، والذي يكشف بعد ذلك اشاره التعريب النووي علي NF-κB ويعزز الاتجار بها إلى النواة. مره واحده في النواة ، NF-κB يربط إلى المنطقة بروموتور من NF-κB الجينات المستهدفة مثل انترلوكين 6 (آيل-6) و IL-23 ، لتعزيز التعبير عنها.
يحدث تنشيط NF-κB بشكل مستقل عن النسخ أو الترجمة. لذلك ، يجب ان يتم قياس حاله التنشيط NF-κB اما عن طريق التحديد الكمي NF-κB بشكل خاص في النواة ، أو عن طريق قياس التعبير عن الجينات الهدف NF-κB. في هذا البروتوكول ، والخلايا بشكل ثابت مع NF-κB:: تم التهاوي بناء مراسل luciferase ل NF-κB التنشيط باستخدام في المختبر تقنيات ثقافة الانسجه. يتم أصابه هذه الخلايا مع السالمونيلا التيفوئيد لتنشيط NF-κb ، الذي يتاجر إلى النواة ويربط إلى المواقع κb في منطقه المروج من luciferase ، مما يحفز التعبير عنها. يتم فحص الخلايا وتحليلها مع نظام مقايسة لوسيفيراز. يرتبط مقدار لوسيفيراز التي تنتجها الخلايا مع كثافة اشاره التلالؤ ، والتي يتم الكشف عنها من قبل قارئ لوحه. توفر اشاره التلالؤ الناتجة عن هذا الاجراء طريقه سريعة وحساسة للغاية لتقييم التنشيط NF-κB ضمن مجموعه من الشروط. يستخدم هذا البروتوكول أيضا النسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR) للكشف عن مستويات mRNA النسبية التي تدل علي التعبير الجيني.

ويركز الفحص الموصوف هنا علي تنشيط عامل النسخ nf-κb باستخدام مراسل لوسيفيراز المعتمد من nf-κb والذي يتم تحويله بشكل ثابت إلى خط من خلايا هيلا. ينشط NF-κB ينتقل إلى النواة حيث انه يربط المواقع الملزمة κB من الجينات المستهدفة ، بما في ذلك السايتوكينات الموالية للالتهابات IL6 و...

Watch this Scientific Journal Video about NF-ÃŽÂºB-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells at JoVE.com

NF-ÃƒÅ½Ã‚ÂºB-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells

هنا ، ونحن نقدم بروتوكول بسرعة وسهوله قياس العامل النووي كابا-ضوء سلسله-محسن من الخلايا المنشطة ب (NF-κB) التنشيط في خطوط الخلايا التعبير عن NF-κB:: يبني مراسل luciferase ، عن طريق قياسات التلالؤ في الخلية lysate. بالاضافه إلى ذلك ، يتم تحديد التعبير الجيني عن طريق RT-qPCR معزولة عن الخلايا المصابة السالمونيلا التيفوئيد.

NF-κB-الاعتماد علي التنشيط والتقدير الكمي للتعبير الجيني في خلايا الانسجه المصابة السالمونيلا الثقافة

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of ...

هذا البروتوكول مفيد لتحديد التغييرات في NF-كابا-B التنشيط في الخلايا التي تعبر عن مراسل NF-kappa-B لوسيفراسي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح لشاشة عالية الإنتاجية من العوامل أو الظروف التي تؤدي إلى تغييرات في NF-kappa-B التنشيط. NF-kappa-B هو عامل النسخ لمجموعة واسعة من العمليات الخلوية.وظيفة معروفة من NF-كابا-B هو في تحريض الاستجابات الالتهابية عن طريق تحفيز التعبير عن السيتوكينات المختلفة و chemokines. مختبرنا مهتم بشكل خاص في تحريض NF-كابا-B الناجمة عن مسببات الأمراض السالمونيلا typhimurium. هنا، نستخدم خط الخلية هيلا التي هي مُصابة بشكل ثابت مع مراسل NF-kappa-B luciferase plasmid.يمكن استخدام بكتيريا أخرى ، أو حتى الفيروسات أو المركبات الكيميائية ، في هذا الخط الخلية لدراسة تفعيل NF -kappa-B. خطوط الخلية الأخرى يمكن أن تستخدم أيضا إذا كنت تستطيع أن أعرض مثل هذا NF- كابا-B luciferase مراسل plasmid في هذا الخط الخلية. شخص ما القيام بذلك للمرة الأولى قد يكون لديك قضايا استخدام تقنية معقمة بشكل صحيح التي هي مطلوبة لثقافة الخلية والعمل البكتيري.قبل يوم واحد من تحفيز الخلايا، وإزالة وسائل الإعلام نمو خلايا هيلا 57A التي نمت إلى حوالي 75٪التقاء. غسل الخلايا مع ملليلتر واحد من 0.05٪ تبسين EDTA. استبدال مع ملليلتر آخر من التربسين EDTA ونقل القارورة إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.بعد أن تم فصل الخلايا من القارورة، وتعليقها في 10 ملليلتر من وسائل الإعلام النمو. الجمع بين 10 ميكرولترات من تعليق الخلية مع 10 ميكرولترات من الأزرق Trypan، ماصة صعودا وهبوطا لخلط، ونقل 10 ميكرولترات إلى شريحة عداد الخلية. عد الخلايا في التعليق باستخدام عداد الخلايا، واستخدام وسائل الإعلام نمو لتمييع الخلايا إلى تركيز النهائي من 2.5 مرات 10 إلى الخلايا الخمس لكل ملليلتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.نقل 250 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة 48-جيدا. غطاء دوري وتسليم أنبوب مخروطي لضمان تعليق الخلية متجانسة. اضغط على اللوحة بلطف على الجانب لضمان أن الخلايا توزع بشكل موحد في الآبار.نقل لوحة إلى 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ والسماح للخلايا لإرفاق والنمو بين عشية وضحاها. الأسهم المجمدة المتتالية من السالمونيلا على لوحات LB agar لإنتاج مستعمرات واحدة. نقل لوحات إلى حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية والسماح للنمو بين عشية وضحاها.في اليوم التالي، إضافة ثلاثة ملليلتر من LB إلى أنابيب الثقافة البكتيرية العقيمة، وإضافة المضادات الحيوية المناسبة لوسائل الإعلام. باستخدام حلقة تطعيم عقيمة، اختر مستعمرة واحدة من الثقافات البكتيرية المتتالية والمس الحلقة إلى وسائط LB. اِقم الأنابيب بعد تلقيحها وتخلص من الحلقة.ضع الأنابيب في حاضنة مهزوزة تبلغ 37 درجة مئوية و180 دورة في الدقيقة ، ثم اسمح للبكتيريا بالنمو بين عشية وضحاها. في الصباح، استرداد الثقافات البكتيرية بين عشية وضحاها من الحاضنة. إعداد أنابيب لزراعة فرعية عن طريق إضافة ثلاثة ملليلتر من LB الطازجة والمضادات الحيوية.نقل 30 ميكرولترات من ثقافة البكتيريا بين عشية وضحاها إلى وسائل الإعلام الطازجة. ضع الأنابيب في حاضنة مهزوزة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد الحضانة لمدة ثلاث ساعات ، قم بنقل ملليلتر واحد من مرق LB العقيم إلى cuvette بلاستيكي ليكون فارغًا.نقل 900 ميكرولترات من LB إلى cuvettes أخرى لاستخدامها في تحليل العينة. نقل 100 ميكرولترات من الثقافة الفرعية البكتيرية في cuvette تحتوي على 900 ميكرولتر من LB، وماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط. كرر هذا لكل تعليق بكتيري.قم بتشغيل مقياس الطيف لقياس الكثافة البصرية للثقافات البكتيرية عند طول موجة 600 نانومتر. ضع الفراغ في مقياس الطيف. يحيط علما التوجه.أغلق الغطاء واضغط على الزر الفارغ على مقياس الطيف للحصول على امتصاص الخلفية. استبدال cuvette فارغة مع cuvette عينة في نفس الاتجاه والصحافة قراءة. تسجيل قيم OD600 من هذه العينات.اضرب القيمة بـ 10 لمراعاة عامل التخفيف. تمييع التعليق واحد إلى 10 في cuvette وامتصاص التدبير، والتي ينبغي أن تعطي قيمة حوالي 0.1 الذي يتوافق تقريبا إلى واحد مرات 10 إلى CFU تسعة لكل ملليلتر. في أنبوب جديد، إضافة حجم مناسب من الثقافة الفرعية المخففة لLB الطازجة لتحقيق تعليق من مرة واحدة 10 إلى CFU ثمانية لكل ملليلتر لاستخدامها في inoculum.إعداد التخفيفات التسلسلية من inoculum عن طريق نقل 50 ميكرولترات من التعليق البكتيري إلى أنبوب يحتوي على 450 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني معقم حتى يتم تخفيف النهائي من حوالي 100 CFU لكل ملليلتر. نقل 100 ميكرولترات من اثنين من أدنى dilutions، 100 و 1000 CFU لكل ملليلتر، إلى اثنين من لوحات أجار LB، ونشر التعليق مع موزع الخلية للحصول على مستعمرات واحدة. نقل هذه اللوحات إلى حاضنة 37 درجة مئوية واحتضان بين عشية وضحاها.في اليوم التالي، عد المستعمرات وحساب التركيز البكتيري من inoculum الأولي لتحديد تركيز inoculum الفعلية. في نفس اليوم، تسمية غطاء من لوحة وفقا لظروف العدوى التي سيتم استخدامها لكل بئر، مع كل حالة يجري في ثلاثية. إضافة 10 ميكرولترات من inoculum إلى الآبار المناسبة، وإضافة 10 ميكرولترات من LB العقيمة لآبار السيطرة غير المصابة.لمزامنة وقت العدوى، ضع اللوحة في جهاز طرد مركزي و دوران بمعدل 500 مرة من G لمدة خمس دقائق، مع ضمان موازنة اللوحة. ثم، نقل الخلايا المصابة إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. وضع أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على aliquot من وسائل الإعلام ثقافة الخلية في حمام الماء 37 درجة مئوية لاستخدامها في الخطوة التالية.بعد ساعة واحدة من وقت العدوى، وإزالة أنبوب مخروطي 15 ملليلتر تحتوي على وسائل الإعلام ثقافة الخلية من حمام الماء ومسح الخارج مع 70٪ الإيثانول. نقل لوحات ثقافة الأنسجة من الحاضنة إلى مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. استخدام نصائح عقيمة لpirate وسائل الإعلام من الآبار واستبدالها مع 250 microliters من الطازجة، وسائل الإعلام ثقافة الخلية الدافئة.إعادة لوحات إلى 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات إضافية. بعد ذلك، قم بإزالة الأطباق من حاضنة ثاني أكسيد الكربون وابتد من الآبار. لتحليل لوسيفيراز، إضافة 100 ميكرولترات من 1X خلية تحلل العازلة إلى الآبار.نقل لوحة إلى ثلاجة سلبية 80 درجة مئوية واحتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل لضمان كفاءة الخلية. ثم، ضع لوحة تحتوي على خلية مجمدة lysate على مقاعد البدلاء لذوبان الجليد، وإعداد الكواشف الركيزة لوسيفيراز وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. السماح للكاسيفراسي الكواشف الركيزة لتكسير إلى درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك، قم بتشغيل قارئ اللوحة وافتح برنامج القارئ المطابق. قم بتعيين الجهاز لقياس الإنارة. نقل 10 ميكرولترات من كل خلية lysate إلى بئر من لوحة 96-well مبهمة.باستخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 50 ميكرولترات من مكاشف luciferase إلى كل بئر من لوحة مبهمة. اضغط بلطف على اللوحة على الجانب لخلط الآبار، وضمان تغطية السطح السفلي بالسائل. ضع اللوحة في قارئ لوحة وابدأ القراءة.انسخ قيم الإنارة في برنامج جدول بيانات و قم برسم النتائج. ويركز هذا البروتوكول على تفعيل عامل النسخ NF-kappa-B باستخدام مراسل luciferase التابع لـ NF-kappa-B الذي يتم نقل العدوى بشكل ثابت إلى خط من خلايا HeLa. هذا الرقم يظهر تجربة تمثيلية من NF-كابا-B التفعيل luciferase تعتمد والتعبير الجيني IL6 في خلايا HeLA 57A المصابة بسلالات السالمونيلا typhimurium.تسبب العدوى مع سلالة SL1344 من النوع البرية إشارة لوسيفيراز قوية في كل من التعبير RLU و IL6 ، والتي انخفضت في الخلايا المصابة مع sipA sopB sopE2 متحولة ثلاثية وخفضت إلى مستويات التحكم مع SIPA sopB sopE2 sopE طافرة رباعية. إيلاء اهتمام وثيق عند القيام الخاص بك تخفيف المسلسل والطلاء. وهذا يضمن أن لديك inoculum متسقة عبر سلالات الخاص بك.بعد تحديد العوامل التي تساهم في تنشيط NF-kappa-B وتغييرات المصب في التعبير مرنا، يمكن استخدام تقنية البقعة الغربية لتحديد التغيرات في التعبير البروتيني. وقد سمح هذا البروتوكول مختبرنا ليس فقط لتقييم NF-كابا-B تفعيل الناجمة عن السالمونيلا ولكن غيرها من المركبات والبروتينات المتورطة في NF-كابا-B التنشيط. السالمونيلا التيثيموريوم هو الممرض البشري.استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند العمل مع هذه البكتيريا.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Immunology and Infection

NF-&#954;B-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells

Unit 2

Cell Signaling Pathways

SCIENTISTS IN ACTION

Murine Model of CD40-activation of B cells

الفئران نموذج تفعيل CD40 - B من الخلايا

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

التفريق الأدوار الوظيفية في التعبير الجيني من الخلايا المناعية وغير المناعية في التهاب القولون الماوس عن طريق زرع نخاع العظم

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

تقييم الغزو البكتيري لخلايا القلب في الثقافة والاستعمار القلب في الفئران المصابة باستخدام monocytogenes الليستيريا

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

الكمي عصاري خلوي مقابل رغوي<em&gt; السالمونيلا</em&gt; في الضامة الابتدائية التي كتبها التفاضلية Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

كوانتيتيشن خلية واحدة مرناً و "سطح التعبير البروتين" في خلايا CD4 المصابين "فيروس نقص المناعة القردي"+ "تي الخلايا المعزولة" من macaques ريسوس

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

قياس فيروس حمى الدنج الجيش الملكي النيبالي في المادة طافية الثقافة من الخلايا المصابة بسلسلة البلمرة الكمية في الوقت الحقيقي

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

في المختبر المستندة إلى الجيش النيبالي الريبي القائم علي الفحص التشخيصي لدراسة تنظيم الترجمة في الخلايا المصابة Poxvirus

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

الفلورة الكمية في الموقع التهجين (FISH) والفلورة المناعية (IF) من منتجات جينية محددة في الخلايا المصابة KSHV

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

فيروس أنفلونزا مراسل لوسيفيراز الفلورسنت للتصوير الحي والقياس الكمي للعدوى الفيروسية

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...