Name: generation of transgenic rats using a lentiviral vector approach
Uploaded: 2020-05-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach at JoVE.com

وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل مشروع ANIMOD ضمن برنامج Team Tech Corefacilits Plus التابع لمؤسسة العلوم البولندية ، الذي شارك في تمويله الاتحاد الأوروبي في إطار صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي إلى WK.

وكان إنتاج ناقلات العدوى الفيروسية وتطبيقها وفقاً للمبادئ التوجيهية للسلامة البيولوجية من المستوى 2 ووافقت عليها وزارة البيئة البولندية. وقد وافقت اللجنة الأخلاقية المحلية على جميع الإجراءات التجريبية للحيوانات التي يرد وصفها أدناه. تم إيواء الحيوانات في أقفاص مهواة بشكل فردي في درجة ح...

<ol>
	<li>Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+genomics+on+research+in+the+rat.">Impact of genomics on research in the rat.</a> Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).</li><li>Tarkowski, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+mouse+chimeras+developed+from+eggs+fused+in+vitro.">Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro.</a> National Cancer Institute Monographs. 11, 51-71 (1963).</li><li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei.">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li><li>Gill, T. J., Smith, G. J., Wissler, R. W., Kunz, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rat+as+an+Experimental+Animal.">The Rat as an Experimental Animal.</a> Science. 245 (4915), 269-276 (1989).</li><li>Aitman, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+prospects+in+rat+genetics:+a+community+view.">Progress and prospects in rat genetics: a community view.</a> Nature Genetics. 40 (5), 516-522 (2008).</li><li>Hammer, R. E., Maika, S. D., Richardson, J. A., Tang, J. P., Taurog, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+inflammatory+disease+in+transgenic+rats+expressing+HLA-B27+and+human+beta+2m:+an+animal+model+of+HLA-B27-associated+human+disorders.">Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders.</a> Cell. 63 (5), 1099-1112 (1990).</li><li>Mullins, J. J., Peters, J., Ganten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fulminant+hypertension+in+transgenic+rats+harbouring+the+mouse+Ren-2+gene.">Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene.</a> Nature. 344 (6266), 541-544 (1990).</li><li>Menoret, S., Remy, S., Usal, C., Tesson, L., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgenic+Rats+by+Microinjection+of+Short+DNA+Fragments.">Generation of Transgenic Rats by Microinjection of Short DNA Fragments.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 81-92 (2010).</li><li>Tesson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+modifications+of+the+rat+genome.">Transgenic modifications of the rat genome.</a> Transgenic Research. 14 (5), 531-546 (2005).</li><li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+rats:+Technical+aspects+and+models.">Transgenesis in rats: Technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li><li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors.">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+by+lentiviral+vectors:+lack+of+gene+silencing+in+mammalian+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos.">Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2140-2145 (2002).</li><li>Koza, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+TDP-43+depletion+affects+activity-dependent+plasticity.">Neuronal TDP-43 depletion affects activity-dependent plasticity.</a> Neurobiology of Disease. 130, 104499 (2019).</li><li>Scherr, M., Battmer, K., Blomer, U., Ganser, A., Grez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+lentiviral+vector+particle+numbers+by+real-time+PCR.">Quantitative determination of lentiviral vector particle numbers by real-time PCR.</a> Biotechniques. 31 (3), 520 (2001).</li><li>Canseco, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+efficiency+during+gestation+and+the+influence+of+co-transfer+of+non-manipulated+embryos+on+production+of+transgenic+mice.">Gene transfer efficiency during gestation and the influence of co-transfer of non-manipulated embryos on production of transgenic mice.</a> Transgenic Research. 3 (1), 20-25 (1994).</li><li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+rats:+technical+aspects+and+models.">Transgenesis in rats: technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li><li>Armstrong, D. T., Opavsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superovulation+of+immature+rats+by+continuous+infusion+of+follicle-stimulating+hormone.">Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone.</a> Biology of Reproduction. 39 (3), 511-518 (1988).</li><li>Popova, E., Krivokharchenko, A., Ganten, D., Bader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+PMSG-+and+FSH-induced+superovulation+for+the+generation+of+transgenic+rats.">Comparison between PMSG- and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats.</a> Molecular Reproduction and Development. 63 (2), 177-182 (2002).</li><li>Johnson, L. W., Moffatt, R. J., Bartol, F. F., Pinkert, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+embryo+transfer+protocols+for+mice.">Optimization of embryo transfer protocols for mice.</a> Theriogenology. 46 (7), 1267-1276 (1996).</li><li>van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirally+generated+eGFP-transgenic+rats+allow+efficient+cell+tracking+in+vivo.">Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo.</a> Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Lentiviral+Vectors+to+Obtain+Transgenic+Rats.">The Use of Lentiviral Vectors to Obtain Transgenic Rats.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 109-125 (2010).</li></ol>

وقد جعل التقدم في التكنولوجيات المعدلة وراثيا نماذج القوارض أداة لا تقدر بثمن في البحوث الطبية الحيوية. أنها توفر الفرصة لدراسة العلاقات النمط الجيني والنمط الظاهري في الجسم الحي. هنا، نقدم بديلاً متاحاً على نطاق واسع للتوليد التقليدي عن طريق الحقن النووي. استخدام نقل الجينات lentiviral يتجا?...

لسنوات عديدة، تم استخدام القوارض المختبرية، مثل الفئران والجرذان، لنمذجة الحالات الفسيولوجية والمرضية البشرية. وقد أدت البحوث الحيوانية إلى اكتشافات لم تكن قابلة للتحقيق بأي وسيلة أخرى. في البداية ، ركزت الدراسات الجينية على تحليل الاضطرابات والظواهر التي تحدث تلقائيًا التي تعتبر تحاكي عن كثب الحالة البشرية1. وسمح تطوير أساليب الهندسة الوراثية بإدخال أو حذف جينات محددة للحصول على النمط الظاهري المطلوب. لذلك ، يتم التعرف على جيل الحيوانات المعدلة وراثيا كتقنية أساسية في البحوث الحديثة التي تسمح بإجراء دراسات لوظيفة الجينات في الكائنات الحية.
أصبحت تكنولوجيا الحيوانات المحورة وراثيا ممكنة من خلال مزيج من الإنجازات في علم الأجنة التجريبية والبيولوجيا الجزيئية. في 1960s, الأجنة البولندية أ. ك. Tarkowski نشرت أول عمل على التلاعب الجنين الماوس خلال المراحل المبكرة من التنمية2. بالإضافة إلى ذلك، طور علماء الأحياء الجزيئيون تقنيات لتوليد ناقلات الحمض النووي (أي الناقلين) لإدخال الحمض النووي الأجنبي في جينوم الحيوان في جملة أمور. وتسمح هذه النواقل بانتشار جينات مختارة وتعديلها المناسب، تبعاً لنوع البحوث التي تجرى. تم تقديم مصطلح "الحيوان المعدل وراثيا" من قبل غوردون ورودل3.
أول الأنواع المقبولة على نطاق واسع التي كانت تستخدم في علم الأعصاب، علم وظائف الأعضاء، علم الصيدلة، وعلم السموم، والعديد من المجالات الأخرى للعلوم البيولوجية والطبية كان الجرذ النرويج، راتوس نورفيغيموس4. ومع ذلك ، بسبب صعوبة في التلاعب أجنة الفئران ، أصبح موسكولوس فأر المنزل الأنواع الحيوانية المهيمنة في البحوث الوراثية5. وثمة سبب آخر لأولوية الفأر في مثل هذه البحوث هو توافر تكنولوجيا الخلايا الجذعية الجنينية لتوليد الحيوانات التي خروج المغلوب لهذا النوع. إن الأسلوب الأكثر استخداماً للتوليد (2-10% من النسل المعدل وراثياً بالنسبة لجميع الحيوانات المولودة) هو الحقن المجهري لشظايا الحمض النووي في نواة من البويضات المخصبة. في عام 1990، تم تكييف هذا النهج، الذي قدم لأول مرة في الفئران، للفئران6,7. يتميز تحويل الفئران عن طريق الحقن النووي بكفاءة أقل8 مقارنة بالفئران ، وهو ما يرتبط ارتباطًا صارمًا بوجود بلازما مرنة وأغشية برونووي9. على الرغم من أن بقاء الأجنة بعد التلاعب هو 40-50٪ أقل مما كانت عليه في الفئران، وتعتبر هذه التقنية معيارا في توليد الفئران المعدلة وراثيا10. وجرى بحث النُهج البديلة التي يمكن أن تضمن إدماجاً فعالاً في مجال الجين اتوجينات وارتفاع معدلات بقاء الزيجوتات المحقونة.
المحدد الرئيسي للتعبير عن انتقال مستقر والانتقال إلى ذرية هو اندماجها في جينوم الخلية المضيفة. الفيروسات اللينة (LVs) لديها سمة مميزة للقدرة على إصابة كل من الخلايا المنقسمة وغير المقسمة. استخدامها كأداة لدمج الجينات غير المتجانسة في الأجنة ثبت أن كفاءة عالية11، ويتميز الأفراد المعدلين وراثيا من خلال التعبير المستقر من جزء الحمض النووي المدمجة. وقد تم تأكيد فعالية ناقلات العدوى للفيروسي للتعديل الوراثي للفئران12،13، الفئران12،14،وغيرها من الأنواع11. في هذه الطريقة ، يتم حقن تعليق LV تحت الزونا بيليسيدا للجنين في مرحلة اثنين من النوى. تضمن هذه التقنية بشكل أساسي بقاء الأجنة بنسبة 100٪ لأن الأوليما لا تزال غير متأثرة. إنتاج عالية الجودة وعالية التركيز نسبيا تعليق LV هي عوامل حاسمة. ومع ذلك، يمكن التغلب على تركيزات أقل من تعليق LV عن طريق الحقنالمتكرر11، مما يزيد من كمية الجسيمات الفيروسية على سطح البيض في حين لا تؤثر على تكامل الغشاء. تتطور الأجنة التي تتعرض للحقن المتكررة في الفضاء perivitelline بشكل أكبر ، ويمكن للنسل المعدل وراثيا ً نقل الجين المتحول عبر الخط الجرثومي. كفاءة توليد الفئران المعدلة وراثيا عن طريق توليد transgenesis اتلافيروسي يمكن أن يصل إلى 80٪12.
هنا، نحن نصف إنتاج فيروس نقص المناعة البشرية-1 المؤتلف اتّصال يُعنى بالبروتين المظروف G. استخدام الجيل الثاني من نظام التعبئة والتغليف VSV النمط الزائف يحدد السلبية واسعة من الجسيمات الفيروسية ويسمح بإنتاج ناقلات مستقرة للغاية التي يمكن أن تركز عن طريق ultracentrifugation وcryopreserved. بعد التحقق من التتر، تكون المتجهات جاهزة للاستخدام كوسيلة لتوصيل الجين إلى الزيجوت الفئران الويستار المهق. بعد سلسلة من الحقن، يمكن استزراع الأجنة بين عشية وضحاها ونقلها في مرحلة الخليتين إلى الأمهات التبني. وفي هذه المرحلة، يمكن النظر في أحد نهجين بديلين. يستخدم الإجراء القياسي الإناث الحوامل الزائفات كمتلقيات للأجنة. ومع ذلك، عندما يكون معدل الحمل منخفضًا بعد التزاوج مع الذكور الأسهر، يمكن زرع الأجنة في الإناث الحوامل Wistar/Sprague-Dawley (SD) التزاوج مع الفئران الذكور الخصبة بلون الفراء الداكن (على سبيل المثال، براون النرويج [BN] الفئران). يسمح لون الفراء بتمييز النسل عن الحمل الطبيعي عن النسل الذي ينشأ من الأجنة المنقولة المتلاعب ة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1208px;" width="1209">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">7500 Real Time PCR System</td>
			<td style="width:186px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:354px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Aerrane (isoflurane)</td>
			<td style="width:186px;">Baxter</td>
			<td style="width:354px;">FDG9623</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Atipam 5 mg/ml</td>
			<td>Eurovet Animal Health BV</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5-10 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15</td>
			<td style="width:186px;">Harvard Apparatus Limited</td>
			<td style="width:354px;">30-0039</td>
			<td style="width:172px;">injection capillary</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bupivacaine 25 mg/ml</td>
			<td>Advanz Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.25% in&#160; 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Butomidor 10 mg/ml (butorphanol&#160; tartrate)</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm</td>
			<td style="width:186px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:354px;">627160</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:496px;">CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm</td>
			<td style="width:186px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:354px;">628160</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">CellTram Oil</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">5176 000.025</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml</td>
			<td>cp-pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin&#160;</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>150 IU/ ml ml 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">D6048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">DNase, RNase-free</td>
			<td style="width:186px;">A&#38;A Biotechnology</td>
			<td style="width:354px;">1009-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES-005-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid)&#160;</td>
			<td style="width:186px;">ADDGENE</td>
			<td style="width:354px;">14888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">FemtoJet</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">4i /5252 000.013</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">F9665-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Folligon, Pregnant Mare&#8217;s Serum Gonadotropin&#160;</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>125 IU/ml in .9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEK 293T cells&#160;</td>
			<td style="width:186px;">ATCC</td>
			<td style="width:354px;">ATCC CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase from Bovine Testis&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272-30MG</td>
			<td>0.5 mg/ml in M2 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Inverted Microscope&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Zeiss</td>
			<td style="width:354px;">Axiovert 200</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine 100mg/ml</td>
			<td>Biowet Pulawy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Paraffin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M16 medium EmbryoMax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MR-016-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Magnesium Chloride 1M</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">63069-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Microforge</td>
			<td style="width:186px;">Narishige</td>
			<td style="width:354px;">MF-900</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl 0.9%</td>
			<td>POLPHARMA OTC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sterile, 5ml ampules</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Operation microscope&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Inami Ophthalmic Instruments</td>
			<td style="width:354px;">Deca-21</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors&#160; (delta R8.2 plasmid)</td>
			<td style="width:186px;">ADDGENE</td>
			<td style="width:354px;">12263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,),</td>
			<td style="width:186px;">Polysciences, Inc</td>
			<td style="width:354px;">23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Penicilin-streptomycin</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">806552-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Puller&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:354px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Reflex Clip Applier/Reflex Clips</td>
			<td style="width:186px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:354px;">500345/500346</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads</td>
			<td style="width:186px;">B.Braun Surgical</td>
			<td style="width:354px;">1048029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:186px;">Olympus</td>
			<td style="width:354px;">SZX16</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Sewing Thread</td>
			<td>B.Braun&#160;</td>
			<td>C1048040</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:186px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:354px;">4334973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tolfedine 4% (tolfenamic acid)</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">TransferMan NK2</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">N/A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Trypsin EDTA solution</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">T3924-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:186px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:354px;">Optima L-100 XP&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">VacuTip</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">5175108.000</td>
			<td style="width:172px;">holders capillary</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vita-POS</td>
			<td>Ursapharm</td>
			<td>N/A</td>
			<td>eye ointment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Warming Plate</td>
			<td style="width:186px;">Semic</td>
			<td style="width:354px;">N/A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Watchmaker Forceps</td>
			<td style="width:186px;">VWR</td>
			<td>470018-868</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of transgenic rats using a lentiviral vector approach

نماذج الحيوانات المعدلة وراثيا هي مهمة بشكل أساسي للبحوث الطبية الحيوية الحديثة. إن دمج الجينات الأجنبية في أجنة الفئران أو الفئران المبكرة هو أداة لا تقدر بثمن لتحليل وظائف الجينات في الكائنات الحية. تعتمد طريقة تحويل التكوين القياسية على حقن أجزاء الحمض النووي الأجنبية في نواة من البويضات المخصبة. وتستخدم هذه التقنية على نطاق واسع في الفئران ولكنها لا تزال غير فعالة نسبيا وتتطلب من الناحية التقنية في الأنواع الحيوانية الأخرى. ويمكن أيضا إدخال الترانسجين في الأجنة ذات مرحلة الخلية الواحدة عن طريق العدوى بفيروس اللارض، مما يوفر بديلا فعالا للحقن برونووي القياسية، وخاصة في الأنواع أو السلالات ذات بنية الأجنة الأكثر تحديا. في هذا النهج، يتم حقن التعليق الذي يحتوي على ناقلات الفيروس في الفضاء perivitelline من جنين الفئران المخصبة، والتي هي من الناحية الفنية أقل تطلبا ولديه معدل نجاح أعلى. وقد تبين أن ناقلات الفيروس الليندية تدمج الجين المتحول بكفاءة في الجينوم لتحديد توليد خطوط معدلة مستقرة. وعلى الرغم من بعض القيود (مثل متطلبات المستوى 2 للسلامة البيولوجية، وحدود حجم شظايا الحمض النووي)، فإن تحويل الجينوجينيس إلى اللادفيروسات هو طريقة سريعة وفعالة لتولد الجين. بالإضافة إلى ذلك، يتم تقديم استخدام الفئران الإناث التي تزاوج مع سلالة الذكور الخصبة مع لون فرو المهيمنة مختلفة كبديل لتوليد الأمهات بالتبني الحوامل.

باستخدام البروتوكول الموصوف هنا، تم إنتاج ناقلات العدوى المُرضية التي حملت بناء Syn-TDP-43-eGFP (titer LV الفعلي = 3.4 × 108/μL) ومن ثم يمكن استخدامها للحقن تحت زوزال الجنين في مرحلة واحدة. فقط أجنّة مع اثنان بوونينوينيّ مرئية كان أخضعت إلى الإجراء. تم تحديد عدد حقن التعليق الفيروسي تجريبيًا. واعتب?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach at JoVE.com

Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach

تهدف هذه المقالة إلى توفير منهجية لتحول العدوى إلى اللافروسية في أجنة الفئران باستخدام حقن متعددة لتعليق الفيروس في الفضاء perivitelline الزيغوت. يتم استخدام الفئران الإناث التي تزاوج مع سلالة الذكور الخصبة مع لون فرو المهيمنة مختلفة لتوليد الأمهات بالتبني الحوامل.

جيل من الفئران المعدلة وراثيا باستخدام نهج ناقلات لينديفيس

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is ...

الحيوانات المعدلة وراثيا أساسية للبحوث الطبية الحيوية الحديثة لأنها تسمح بإجراء دراسات عن وظائف الجينات في الكائنات الحية. وقد طبقت أساليب مختلفة من التعديلات الجينية في الدراسات الحيوانية. هنا، نقدم تقنية فعالة يمكن الوصول إليها على نطاق واسع تستخدم ناقلات العدسي كوسيلة لدمج المتحولين جنسيا في جينوم جنين الفئران.بعد إدارة gonadotropin المشيمية البشرية ، ورفيقة خمسة أسابيع من العمر الجرذان الإناث في ويستار واحد إلى واحد مع خصوبة جنسية ثلاثة إلى 10 أشهر من الذكور ويستار. في 8 إلى 10 a.m في صباح اليوم التالي، تحقق من الإناث لوجود المكونات المهبلية وحصاد oviducts من الإناث مع قابس التزاوج في موعد أقصاه 10 .m.في طبق جمع يحتوي على متوسط M2 مُدفأ مسبقًا. عندما تم جمع جميع oviducts، نقل الأنسجة إلى طبق 35 ملليمتر تحتوي على M2 المتوسطة التي تم تسخينها مسبقاً مع 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر من الهيالورونيداز من الخصيات البقرية ووضع الطبق تحت مجهر ستيريو. استخدم ملقطًا ناعمًا لفتح جدران oviduct واضغط على أمبولاً حتى يتم تحرير الأجنة.لتسهيل إطلاق الأجنة من خلايا الكامولو، استخدم ماصة نقل الزجاج متصلة بأنبوب اسبيرات يعمل بالفم إلى ماصة الأجنة بلطف صعودا وهبوطا. عندما يتم إطلاق جميع الأجنة، قم بغسل الخلايا عدة مرات في وسط M2 جديد لإزالة الحطام الهيالوروني والخلوي. نقل الأجنة إلى 50 قطرات ميكرولتر الفردية من M16 المتوسطة قبل التوازن التي تغطيها الزيوت المعدنية في طبق 60 ملليمتر.ثم ضع الطبق في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية مع غلاف جوي ثاني أكسيد الكربون 5٪ حتى حقنها. بالنسبة للضخ الدقيق للمتجهات الناقلة في إطار zona pellucida من الأجنة مرحلة خلية واحدة ، استخدم سحب ماصة لإعداد الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات الدقيقة بوروزيليكات مع خيوط. بعد كل مرة يتم فيها تغيير خيوط أو يتم استخدام شعري زجاجي جديد، قم بتشغيل اختبار منحدر لتعيين المعلمات المثلى.بعد ذلك ، استخدم طرف microloader لتحميل ما يقرب من اثنين microliters من محلول العدسي الطازج المذاب في ماص الحقن الدقيق تحت غطاء تدفق اللامينار. أضف قطرة 100 ميكرولتر من M2 متوسطة إلى مركز الغطاء من طبق بيتري 60 ملليمتر. تغطية المتوسطة مع النفط المعدني وجبل ماصة عقد والفيروس حملت الشعرية microinjection على micromanipulator.ضع طبق الحقن المجهري تحت مجهر مقلوب ونقل 15 إلى 20 جنينًا من خلية واحدة في مرحلة الخلية الواحدة إلى قطرة M2 في طبق الحقن الدقيق. القبض على جنين واحد مع ماصة عقد واستخدام التكبير 400 مرة والشعيرات الدموية الزجاجية لحقن محلول العدسي فيروسيل تحت pellucida زونا في الفضاء ما بينيتلين عقد الشعرية تحت pellucida زونا للحظة بعد أن تم تسليم الفيروس. عندما يتم حقن جميع الأجنة ، استخدم ماصة دقيقة لإعادة الخلايا المحقونة إلى طبق الثقافة وإعادة الطبق إلى حاضنة زراعة الخلايا حتى زرعها.لإعداد الأمهات بالتبني لنقل الجنين، رفيقة ناضجة جنسيا Sprague-Dawley الإناث مع الذكور المنوية والتحقق من الإناث في صباح اليوم التالي عن المكونات المهبلية. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لدواسة منعكس في الإناث تخدير مع سد قابلة للحياة، وتطبيق مرهم على عيون الحيوان وحلق الفراء من الجزء الخلفي من كل. ضع الفأر الأول في موضعه المعرض على سطح نظيف على منصة تدفئة تحت مجهر جراحي.غطي الجرذ بغطاء معقمة مع فتحة صغيرة تقطع على أسفل الظهر و قومي بشق جلدي يبلغ سنتيمترين تقريباً موازياً للعمود الفقري القطني. استخدام مقص حاد لجعل قطع في جدار البطن واستخدام ملقط لفهم وسادة الدهون المبيض. سحب المبيض وoviduct من تجويف البطن على قطعة من 0.9٪ شاش كلوريد الصوديوم غارقة.تحميل M2 المتوسطة، ثلاث فقاعات من الهواء، والأجنة في الشعرية نقل. استخدام microscisors لجعل شق صغير في oviduct بين infundibulum و ampulla وإدراج غيض من ماصة نقل في شق. طرد الأجنة وفقاعات الهواء بلطف في oviduct ، ثم استخدم ملقطًا حادًا لوضع الجهاز التناسلي مرة أخرى في تجويف البطن.خياطة جدار البطن مع خياطة حمض متعدد الكليات القابلة للامتصاص وإغلاق شق الجلد مع مقاطع الجرح ووضع الحيوان في قفص نظيف على لوحة الاحترار مع رصد حتى إعادة شغل كامل. إلى قطع القناة المنوية الاصحاح الاصحاح المحتملة، بعد إعداد الفئران الذكور لعملية جراحية كما هو موضح، واستخدام 70٪ الإيثانول وفرك الجراحية لتطهير الجلد على الخصية. اضغط بلطف على البطن لفضح الخصيات في الكيس الكيس وتغطية الجرذ مع ستائر معقمة مع ثقب صغير فوق موقع الجراحة واستخدام مقص scrotal لجعل شق 0.5 سنتيمتر في منتصف الكيس.دفع بعناية الخصية إلى اليسار وتحديد مكان الأوعية الدموية بين الخصية وخط الوسط كما قناة بيضاء مع وعاء دموي واحد. استخدام ملقط صانع الساعات لسحب بلطف vas deferens من كيس scrotal وعقد السفينة مع ملقط، واستخدام مقص غرامة لإزالة جزء سنتيمتر واحد من القناة. كرر الإجراء للخصي الثاني كما أظهرت للتو وإغلاق الجلد مع الغرز حمض متعدد الكوليك امتصاص.ثم ضع الجرذ في قفص نظيف على لوحة دافئة مع المراقبة حتى إعادة شغل الوظائف بالكامل. وفي هذه التجربة التمثيلية التي تم فيها حقن أجنة منفردة عدة مرات، ولدت ثمانية فئران من أجنة تم حقنها مرتين، وتأكد أن ثلاثة منها تحمل ال transgene. ولم ينقل أحد المؤسسين الترانسجين إلى ذرية واستخدمت ثلاث إناث بالتبني لكل إعداد تجريبي.سمح النهج المختار بتوليد خطوط فئران ثابتة محورة وراثياً تعبر عن بروتين الاندماج TDP-43-eGFP تحت سيطرة المشبك العصبي في مروج واحد في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي. نتج عن التحول عبر النسل القائم على فيروس العدين إدخال نسخة واحدة من transgene كما يتضح من PCR الكمية. عندما تم استخدام هذه الطريقة لناقلات أخرى من فيروسات عدسي، لوحظ تقريبا 90٪ معدل البقاء على قيد الحياة.وكانت النسبة المئوية للأجنة التي نجت من الحقن برونويك أقل بكثير. وعموما، تشير هذه النتائج إلى أن الجرذان الحامل يمكن أن تستخدم كأمهات حاضنة ذات كفاءة مماثلة. وتجدر الإشارة إلى أن البيانات الرقمية التي تم تحليلها لجولات فردية من الحقن المجهري تشير إلى أن فعالية الزرع تعتمد بشكل مباشر على عدد الحقن في جنين واحد وبشكل غير مباشر على الحمل الفيروسي.ويضمن استخدام ناقلات فيروسات العدتي التكامل الجيني وانتقالها من المتحولين جنسيا ويسهل معدل بقاء عالية من الأجنة micromanipulated حتى عندما يتم إجراء حقن تحت الجلد متعددة. ويمكن تطبيق هذا الإجراء بفعالية على الأنواع الأخرى ويمكن اعتباره بديلاً عن التغاير التقليدي.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

أ ف التوحد لجنة المساواة العرقية ، السلمون المدخن النهج للكشف عن خلية الانصهار في فيفو</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

الجلد الوشم ونهجا جديدا للتسليم اللقاحات DNA

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

جيل من القص التصاق خريطة طريق SynVivo شبكات الاوعية الدموية الدقيقة الاصطناعية

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

توصيف النظم المعقدة باستخدام تصميم التجارب النهج: عابر التعبير البروتين في التبغ كدراسة حالة

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

الدهون طبقة ثنائية الحويصلة انشاء طريق ميكروفلويديك النفث

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

ضعف مستحلب الجيل باستخدام Polydimethylsiloxane (PDMS) المشارك المحوري تدفق التركيز الأجهزة

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

جيل من خلايا الفأر مجرى الهواء طلائي المشتقة ESC عن طريق Decellularized الرئة السقالات

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

كالوريسبيروميتري: اتباع نهج موسع، قوية للتحقيق في استقلاب الطاقة الخلوية

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

In Silico Modeling Method for Computational Aquatic Toxicology of Endocrine Disruptors: A Software-Based Approach Using QSAR Toolbox

في طريقة النمذجة Silico لعلم السموم المائية الحسابية من اضطرابات الغدد الصماء: نهج يستند إلى البرمجيات باستخدام أدوات QSAR

Computational analyses of toxicological processes enables high-throughput screening of chemical substances and prediction of their endpoints in biological ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

الترقيع المهندس بالأنسجة لإعادة بناء المريء المحيطي في الفئران

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...