Name: generation of transgenic rats using a lentiviral vector approach
Uploaded: 2020-05-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach at JoVE.com

这项研究得到了ANIMOD项目的支持，该项目由波兰科学基金会团队技术核心设施加方案内支持，该项目由欧洲联盟在欧洲区域发展基金下共同资助。

病毒载体的生产和应用符合生物安全二级准则，并经波兰环境部批准。下面描述的所有实验动物程序都得到当地伦理委员会的批准。这些动物被安置在稳定的温度（21~23°C）和湿度（50~60%）的单独通风的笼子里。在12 h/12 h的光/暗循环下，可以获得水和食物。
1. 伦迪病毒载体生产
<ol><li>HEK 293T 细胞的转染 注：本文介绍的协议是为20×10厘米培养皿的转染而设计的，这些培养?...

<ol>
	<li>Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+genomics+on+research+in+the+rat.">Impact of genomics on research in the rat.</a> Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).</li><li>Tarkowski, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+mouse+chimeras+developed+from+eggs+fused+in+vitro.">Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro.</a> National Cancer Institute Monographs. 11, 51-71 (1963).</li><li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei.">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li><li>Gill, T. J., Smith, G. J., Wissler, R. W., Kunz, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rat+as+an+Experimental+Animal.">The Rat as an Experimental Animal.</a> Science. 245 (4915), 269-276 (1989).</li><li>Aitman, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+prospects+in+rat+genetics:+a+community+view.">Progress and prospects in rat genetics: a community view.</a> Nature Genetics. 40 (5), 516-522 (2008).</li><li>Hammer, R. E., Maika, S. D., Richardson, J. A., Tang, J. P., Taurog, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+inflammatory+disease+in+transgenic+rats+expressing+HLA-B27+and+human+beta+2m:+an+animal+model+of+HLA-B27-associated+human+disorders.">Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders.</a> Cell. 63 (5), 1099-1112 (1990).</li><li>Mullins, J. J., Peters, J., Ganten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fulminant+hypertension+in+transgenic+rats+harbouring+the+mouse+Ren-2+gene.">Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene.</a> Nature. 344 (6266), 541-544 (1990).</li><li>Menoret, S., Remy, S., Usal, C., Tesson, L., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgenic+Rats+by+Microinjection+of+Short+DNA+Fragments.">Generation of Transgenic Rats by Microinjection of Short DNA Fragments.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 81-92 (2010).</li><li>Tesson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+modifications+of+the+rat+genome.">Transgenic modifications of the rat genome.</a> Transgenic Research. 14 (5), 531-546 (2005).</li><li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+rats:+Technical+aspects+and+models.">Transgenesis in rats: Technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li><li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors.">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+by+lentiviral+vectors:+lack+of+gene+silencing+in+mammalian+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos.">Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2140-2145 (2002).</li><li>Koza, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+TDP-43+depletion+affects+activity-dependent+plasticity.">Neuronal TDP-43 depletion affects activity-dependent plasticity.</a> Neurobiology of Disease. 130, 104499 (2019).</li><li>Scherr, M., Battmer, K., Blomer, U., Ganser, A., Grez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+lentiviral+vector+particle+numbers+by+real-time+PCR.">Quantitative determination of lentiviral vector particle numbers by real-time PCR.</a> Biotechniques. 31 (3), 520 (2001).</li><li>Canseco, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+efficiency+during+gestation+and+the+influence+of+co-transfer+of+non-manipulated+embryos+on+production+of+transgenic+mice.">Gene transfer efficiency during gestation and the influence of co-transfer of non-manipulated embryos on production of transgenic mice.</a> Transgenic Research. 3 (1), 20-25 (1994).</li><li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+rats:+technical+aspects+and+models.">Transgenesis in rats: technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li><li>Armstrong, D. T., Opavsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superovulation+of+immature+rats+by+continuous+infusion+of+follicle-stimulating+hormone.">Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone.</a> Biology of Reproduction. 39 (3), 511-518 (1988).</li><li>Popova, E., Krivokharchenko, A., Ganten, D., Bader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+PMSG-+and+FSH-induced+superovulation+for+the+generation+of+transgenic+rats.">Comparison between PMSG- and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats.</a> Molecular Reproduction and Development. 63 (2), 177-182 (2002).</li><li>Johnson, L. W., Moffatt, R. J., Bartol, F. F., Pinkert, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+embryo+transfer+protocols+for+mice.">Optimization of embryo transfer protocols for mice.</a> Theriogenology. 46 (7), 1267-1276 (1996).</li><li>van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirally+generated+eGFP-transgenic+rats+allow+efficient+cell+tracking+in+vivo.">Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo.</a> Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Lentiviral+Vectors+to+Obtain+Transgenic+Rats.">The Use of Lentiviral Vectors to Obtain Transgenic Rats.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 109-125 (2010).</li></ol>

转基因技术的进步使啮齿动物模型成为生物医学研究的宝贵工具。它们提供了研究体内基因型-表型关系的机会。在这里，我们提出了一种广泛可用的替代常规转基因通过前核注入。使用慢病毒基因转导绕过了要求苛刻的微注射的需要，因为病毒载体可以在zona pellucida下注射。这种方法不影响胚胎的完整性，这基本上保证了注射酶的100%存活率。通过慢病毒载体结合的转基因可稳稳地融入宿主基因组...

多年来，实验室啮齿动物，如大鼠和老鼠，一直被用来模拟人类的生理和病理状况。动物研究已经导致发现，这是无法通过任何其他手段。最初，基因研究侧重于分析自发发生的疾病和表型，被认为是密切模仿人类的条件1。基因工程方法的发展允许引入或删除特定基因来获得所需的表型。因此，转基因动物的产生被认为是现代研究中的一项基本技术，它允许对生物体内基因功能的研究。
转基因动物技术通过在实验胚胎学和分子生物学方面取得的成绩而成为可能。20世纪60年代，波兰胚胎学家A.K.Tarkowski发表了关于小鼠胚胎在发育早期阶段操纵的第一个工作。此外，分子生物学家还开发了产生DNA载体（即载体）的技术，以便除其他外将外来DNA引入动物的基因组。这些载体允许传播选定的基因及其适当的修饰，这取决于所进行的研究类型。"转基因动物"一词是由戈登和陆克文3引入的。
第一个被广泛接受的物种，用于神经生物学，生理学，药理学，毒理学和许多其他领域的生物和医学是挪威大鼠，拉图斯诺维吉库斯4。然而，由于难以操纵大鼠胚胎，室内小鼠肌肉已成为基因研究中的主要动物物种。在这种研究中，老鼠占主导地位的另一个原因是，有胚胎干细胞技术可以为这种物种生产淘汰动物。最常见的转基因技术（相对于所有出生的动物，转基因后代的2-10%）是将DNA片段微入受精卵母细胞的亲核中。1990年，这种方法首次引入小鼠体内，适用于66、7只大鼠。与小鼠相比，前列腺注射的鼠转基因具有效率低8的特点，这与弹性等离子体和前列腺膜的存在密切相关。虽然操纵后的胚胎存活率比小鼠低40-50%，但这项技术被认为是转基因大鼠10代的一个标准。研究了能够保证有效转基因结合和提高注射酶的存活率的替代方法。
稳定转基因表达和传染给后代的关键决定因素是它与宿主细胞基因组的集成。伦迪病毒（LV）具有能够感染分裂细胞和非分裂细胞的显著特征。它们用作将异质基因纳入胚胎的工具被证明是高效的11，而转基因个体的特点是结合DNA片段的稳定表达。扁病毒载体的疗效已确认为小鼠12、13、13大鼠12、14,14等11种进行基因改造。12在这种方法中，LV悬浮液在两个原核的阶段被注射在胚胎的zona pellucida下。这种技术基本上保证了胚胎100%的存活率，因为奥莱玛仍然不受影响。生产高质量和相对集中的LV悬架是关键因素。然而，低浓度的LV悬浮液可以通过重复注射11来克服，这增加了蛋表面的病毒颗粒量，同时不影响膜的整合。接受反复注射到围场的胚胎进一步发育，转基因后代可以通过生殖系传播转基因。扁病毒转变转基因大鼠的生成效率高达80%12。
在这里，我们描述了HIV-1衍生的重组性扁病毒的产生，这种病毒是伪型的，带有光眼口腔炎病毒（VSV）G包络蛋白。使用第二代包装系统 VSV 伪型决定了病毒颗粒的广泛感染性，并允许生产高度稳定的载体，这些载体可以通过超离心和低温保存进行浓缩。滴定验证后，载体可作为将基因转化为白化病的威斯塔大鼠酶体的工具。经过一系列的注射后，胚胎可以培养过夜，并在双细胞阶段转移到寄养母亲。在这一点上，可以考虑两种替代方法之一。标准程序利用伪怀孕女性作为胚胎接受者。然而，当与输精管结扎的雄配后怀孕率较低时，胚胎可以植入怀孕的 Wistar / Sprague - Dawley （ SD ）雌性，这些雌性与具有深色毛皮颜色的肥沃雄性大鼠交配（例如，棕色挪威 [ BN ] 大鼠）。毛皮的颜色允许区分后代与自然怀孕的后代，这些后代来自转移的操纵胚胎。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1208px;" width="1209">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">7500 Real Time PCR System</td>
			<td style="width:186px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:354px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Aerrane (isoflurane)</td>
			<td style="width:186px;">Baxter</td>
			<td style="width:354px;">FDG9623</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Atipam 5 mg/ml</td>
			<td>Eurovet Animal Health BV</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5-10 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15</td>
			<td style="width:186px;">Harvard Apparatus Limited</td>
			<td style="width:354px;">30-0039</td>
			<td style="width:172px;">injection capillary</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bupivacaine 25 mg/ml</td>
			<td>Advanz Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.25% in&#160; 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Butomidor 10 mg/ml (butorphanol&#160; tartrate)</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm</td>
			<td style="width:186px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:354px;">627160</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:496px;">CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm</td>
			<td style="width:186px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:354px;">628160</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">CellTram Oil</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">5176 000.025</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml</td>
			<td>cp-pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin&#160;</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>150 IU/ ml ml 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">D6048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">DNase, RNase-free</td>
			<td style="width:186px;">A&#38;A Biotechnology</td>
			<td style="width:354px;">1009-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES-005-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid)&#160;</td>
			<td style="width:186px;">ADDGENE</td>
			<td style="width:354px;">14888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">FemtoJet</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">4i /5252 000.013</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">F9665-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Folligon, Pregnant Mare&#8217;s Serum Gonadotropin&#160;</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>125 IU/ml in .9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEK 293T cells&#160;</td>
			<td style="width:186px;">ATCC</td>
			<td style="width:354px;">ATCC CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase from Bovine Testis&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272-30MG</td>
			<td>0.5 mg/ml in M2 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Inverted Microscope&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Zeiss</td>
			<td style="width:354px;">Axiovert 200</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine 100mg/ml</td>
			<td>Biowet Pulawy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Paraffin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M16 medium EmbryoMax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MR-016-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Magnesium Chloride 1M</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">63069-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Microforge</td>
			<td style="width:186px;">Narishige</td>
			<td style="width:354px;">MF-900</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl 0.9%</td>
			<td>POLPHARMA OTC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sterile, 5ml ampules</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Operation microscope&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Inami Ophthalmic Instruments</td>
			<td style="width:354px;">Deca-21</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors&#160; (delta R8.2 plasmid)</td>
			<td style="width:186px;">ADDGENE</td>
			<td style="width:354px;">12263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,),</td>
			<td style="width:186px;">Polysciences, Inc</td>
			<td style="width:354px;">23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Penicilin-streptomycin</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">806552-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Puller&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:354px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Reflex Clip Applier/Reflex Clips</td>
			<td style="width:186px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:354px;">500345/500346</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads</td>
			<td style="width:186px;">B.Braun Surgical</td>
			<td style="width:354px;">1048029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:186px;">Olympus</td>
			<td style="width:354px;">SZX16</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Sewing Thread</td>
			<td>B.Braun&#160;</td>
			<td>C1048040</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:186px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:354px;">4334973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tolfedine 4% (tolfenamic acid)</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">TransferMan NK2</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">N/A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Trypsin EDTA solution</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">T3924-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:186px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:354px;">Optima L-100 XP&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">VacuTip</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">5175108.000</td>
			<td style="width:172px;">holders capillary</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vita-POS</td>
			<td>Ursapharm</td>
			<td>N/A</td>
			<td>eye ointment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Warming Plate</td>
			<td style="width:186px;">Semic</td>
			<td style="width:354px;">N/A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Watchmaker Forceps</td>
			<td style="width:186px;">VWR</td>
			<td>470018-868</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of transgenic rats using a lentiviral vector approach

转基因动物模型在现代生物医学研究中至关重要。将外来基因植入早期小鼠或大鼠胚胎是活生物体基因功能分析的宝贵工具。标准转基因方法基于将外来DNA片段微注入受精卵母细胞的异核。这项技术在小鼠中被广泛应用，但在其他动物物种中仍然相对低效和技术要求高。转基因还可以通过慢病毒感染引入单细胞阶段胚胎，为标准前列腺注射提供有效的替代，特别是在胚胎结构更具挑战性的物种或菌株中。在这种方法中，含有慢病毒载体的悬浮液被注射到受精大鼠胚胎的围网空间，从技术上讲，这种胚胎要求较低，成功率也更高。线病毒载体被证明有效地将转基因纳入基因组，以确定稳定的转基因系的产生。尽管存在一些局限性（例如，生物安全等级 2 要求、DNA 片段大小限制），但慢病毒转基因是一种快速而高效的转基因方法。此外，使用雌性大鼠与肥沃的男性菌株交配，具有不同的显性毛皮颜色，作为产生伪孕养母的替代品。

使用本文所述的协议，产生了携带Syn-TDP-43-eGFP构造的慢病毒载体（物理LV定位 = 3.4 x 108/μL），然后可用于单细胞阶段胚胎子区注射。只有具有两个可见原核的胚胎接受手术。注射病毒悬浮液的数量是实验性的。高植入效率以及同时缺乏转基因后代被认为是病毒颗粒数量不足以成功转导的指标。在这种情况下，注射次数增加。LV的单一管理导致20只F0代大鼠出生，其中没有一只是转基因的。?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach at JoVE.com

Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach

本文旨在提供大鼠胚胎中扁病毒转生的方法，使用多次注射病毒悬浮液进入酶体肠。雌性大鼠与肥沃的雄性菌株交配，具有不同的显性毛皮颜色，用于产生伪怀孕的养母。

使用伦迪病毒载体方法生成转基因大鼠

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is ...

转基因动物是现代生物医学研究的根本，因为它们允许研究生物体中的基因功能。各种基因修饰方法已应用于动物研究。在这里，我们提出了一种广泛可获取和有效的技术，它使用扁病毒载体作为将转基因纳入大鼠胚胎基因组的工具。人类胆胃性腺激素给后，交配五周大的威斯塔雌性大鼠一对一与性肥沃的三到十个月大的维斯塔雄性。第二天上午8.m，检查女性是否存在阴道塞，并在不迟于上午10点之前用交配塞从雌性中采集.m。放入含有预热 M2 介质的收集盘中。当所有风管都收集起来后，将组织转移到一个35毫米的培养皿中，其中含有预热的M2介质，并辅以每毫升牛睾丸0.5毫克的透明酶，然后将培养皿置于立体显微镜下。使用精细钳子打开卵巢壁，然后按压安培，直到胚胎释放。为了便于从积液细胞中释放胚胎，请使用连接到嘴操作吸管的玻璃转移移液器，轻轻地上下移液胚胎。当所有胚胎都被释放后，用新鲜的M2介质清洗细胞几次，以去除透明和细胞碎片。将胚胎移植到60毫米培养皿中由矿物油覆盖的预平衡M16介质的单个50微升滴中。然后将盘子放入加湿的37摄氏度培养箱中，其二氧化碳含量为5%，直到其注入。对于单细胞阶段胚胎的佐纳佩普利达下的扁病毒载体微注射，使用移液器拉拔器用灯丝准备微注射硅酸盐玻璃毛细管。每次更换灯丝或使用新的玻璃毛细管后，运行 Ramp 测试以设置最佳参数。接下来，使用微装载机尖端，在生物安全层流罩下，每个微注射移液器装载大约两升新鲜解冻的扁病毒溶液。从 60 毫米培养皿中向盖子中央添加 100 微升的 M2 介质。用矿物油盖住介质，将保持移液器和病毒加载的微注射毛细管安装到微操纵器上。将微注射盘置于倒置显微镜下，将15至20个单细胞阶段胚胎转移到微注射盘中的M2滴中。用持有移液器捕获一个胚胎，并使用 400 倍的放大倍率和玻璃毛细管将佐纳佩普鲁西达下的扁病毒溶液注射到周围空间中，在病毒传递后将毛细管放在左皮利西达下一会儿。当所有胚胎都注射后，使用细移液器将注射的细胞返回到培养皿中，然后将培养皿返回到细胞培养箱，直到植入。为了准备养母的胚胎移植，交配性成熟的斯普拉格-道利雌性与输精管切除术的男性，并检查女性第二天早上阴道插头。在确认麻醉雌性女性对踏板反射缺乏反应后，用可行的插头涂抹软膏，从动物的背上剃皮毛。将第一只老鼠放在手术显微镜下加热垫上的清洁表面上。用无菌窗帘盖住大鼠，下背部有一个小孔，使大约两厘米的皮肤切口平行于腰椎柱。使用锋利的剪刀在腹壁上做切口，用钳子抓住卵巢脂肪垫。将卵巢和卵巢从腹腔中拉到一块 0.9% 氯化钠浸泡纱布上。将M2介质、三个气泡的空气和胚胎加载到转移毛细管中。使用微切口将小切口切入导管和安普拉之间的卵巢，并将转移移液器的尖端插入切口。轻轻地将胚胎和气泡排入卵巢，然后用钝钳将生殖道放回腹腔。用多糖酸可吸收缝合腹壁，用伤口夹关闭皮肤切口，将动物放在加热板上的清洁笼子里，监测直至完全下部。要对潜在的伴侣进行输精管切除术，在证明雄性大鼠进行手术后，使用70%乙醇和手术磨砂来消毒睾丸上的皮肤。轻轻按压腹部，露出阴囊中的睾丸，用无菌窗帘盖住大鼠，手术部位上有一个小洞，然后用阴囊剪刀在囊中间做一个0.5厘米的切口。小心地将睾丸向左推，将睾丸和中线之间的血管定位为带单血管的白色导管。使用制表师的钳子轻轻地将血管从阴囊中拉出，用钳子握住容器，用细剪刀从管道中去除一厘米的碎片。重复第二个睾丸的过程，正如刚刚演示的，并关闭皮肤与多糖酸可吸收缝合线。然后将老鼠放入加热板上的清洁笼中，进行监测，直到完全恢复。在这个代表性的实验中，单个胚胎被注射多次，8只大鼠从两次注射的胚胎中出生，其中3只被证实携带转基因。其中一个创始人没有将转基因转移到后代身上，每个实验装置都使用了三个寄养雌性。选择的方法允许生成稳定的转基因大鼠系，在神经突触的控制之下，在整个中枢神经系统的一个促进物中表达TDP-43-eGFP融合蛋白。基于伦蒂病毒的转生成导致转基因的单一拷贝插入，如定量 PCR 所证明的。当此方法用于其他扁病毒载体时，观察到大约 90% 的存活率。在亲核注射中幸存下来的胚胎比例要低得多。总的来说，这些结果表明，怀孕的雌性大鼠可以作为具有同等效率的养母。值得注意的是，对个别几轮微注射进行分析的数值数据表明，植入的有效性直接取决于注射到一个胚胎的数量，并间接取决于病毒载量。使用扁病毒载体保证了转基因的基因组整合和传输，并有利于微管理胚胎的高存活率，即使进行了多次次皮下注射。这个过程可以有效地应用于其他物种，并可以被认为是常规转世的替代方案。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

阿的Cre - LOX P为检测细胞融合重组方法在体内</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

科研

生物工程

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

皮肤纹身作为一种新的方法DNA疫苗交货

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

的剪切粘合地图使用SynVivo合成微血管网络代

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

烟草中瞬时表达的蛋白作为一个案例研究：复杂系统采用的实验方法设计的表征

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

脂质双层囊泡代使用微流控喷射

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

复乳代使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）同轴流量聚焦设备

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

用脱细胞支架龙ESC衍生鼠气道上皮细胞的生成

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: 一种功能强大、无创的研究细胞能量代谢的方法

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

In Silico Modeling Method for Computational Aquatic Toxicology of Endocrine Disruptors: A Software-Based Approach Using QSAR Toolbox

在内分泌干扰物计算水生毒理学的Silico建模方法：使用QSAR工具箱的基于软件的方法

Computational analyses of toxicological processes enables high-throughput screening of chemical substances and prediction of their endpoints in biological ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

用于大鼠圆周食管重建的组织工程移植

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...