Name: generation of transgenic rats using a lentiviral vector approach
Uploaded: 2020-05-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af ANIMOD-projektet inden for Team Tech Core Facility Plus-programmet under Foundation for Polish Science, der samfinansieres af EU under Den Europæiske Fond for Regionaludvikling til WK.

Produktionen og anvendelsen af virale vektorer var i overensstemmelse med retningslinjerne for biosikkerhedsniveau 2 og blev godkendt af det polske miljøministerium. Alle forsøgsdyreprocedurer, der er beskrevet nedenfor, blev godkendt af det lokale etiske udvalg. Dyrene blev anbragt i individuelt ventilerede bure ved en stabil temperatur (21-23 °C) og fugtighed (50-60%) med ad libitum adgang til vand og mad under en 12 h/12 h lys / mørk cyklus.
1. Lentiviral vektorproduktion
<ol><li>Tran...

<ol>
	<li>Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+genomics+on+research+in+the+rat.">Impact of genomics on research in the rat.</a> Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).</li><li>Tarkowski, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+mouse+chimeras+developed+from+eggs+fused+in+vitro.">Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro.</a> National Cancer Institute Monographs. 11, 51-71 (1963).</li><li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei.">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li><li>Gill, T. J., Smith, G. J., Wissler, R. W., Kunz, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rat+as+an+Experimental+Animal.">The Rat as an Experimental Animal.</a> Science. 245 (4915), 269-276 (1989).</li><li>Aitman, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+prospects+in+rat+genetics:+a+community+view.">Progress and prospects in rat genetics: a community view.</a> Nature Genetics. 40 (5), 516-522 (2008).</li><li>Hammer, R. E., Maika, S. D., Richardson, J. A., Tang, J. P., Taurog, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+inflammatory+disease+in+transgenic+rats+expressing+HLA-B27+and+human+beta+2m:+an+animal+model+of+HLA-B27-associated+human+disorders.">Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders.</a> Cell. 63 (5), 1099-1112 (1990).</li><li>Mullins, J. J., Peters, J., Ganten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fulminant+hypertension+in+transgenic+rats+harbouring+the+mouse+Ren-2+gene.">Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene.</a> Nature. 344 (6266), 541-544 (1990).</li><li>Menoret, S., Remy, S., Usal, C., Tesson, L., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgenic+Rats+by+Microinjection+of+Short+DNA+Fragments.">Generation of Transgenic Rats by Microinjection of Short DNA Fragments.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 81-92 (2010).</li><li>Tesson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+modifications+of+the+rat+genome.">Transgenic modifications of the rat genome.</a> Transgenic Research. 14 (5), 531-546 (2005).</li><li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+rats:+Technical+aspects+and+models.">Transgenesis in rats: Technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li><li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors.">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+by+lentiviral+vectors:+lack+of+gene+silencing+in+mammalian+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos.">Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2140-2145 (2002).</li><li>Koza, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+TDP-43+depletion+affects+activity-dependent+plasticity.">Neuronal TDP-43 depletion affects activity-dependent plasticity.</a> Neurobiology of Disease. 130, 104499 (2019).</li><li>Scherr, M., Battmer, K., Blomer, U., Ganser, A., Grez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+lentiviral+vector+particle+numbers+by+real-time+PCR.">Quantitative determination of lentiviral vector particle numbers by real-time PCR.</a> Biotechniques. 31 (3), 520 (2001).</li><li>Canseco, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+efficiency+during+gestation+and+the+influence+of+co-transfer+of+non-manipulated+embryos+on+production+of+transgenic+mice.">Gene transfer efficiency during gestation and the influence of co-transfer of non-manipulated embryos on production of transgenic mice.</a> Transgenic Research. 3 (1), 20-25 (1994).</li><li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+rats:+technical+aspects+and+models.">Transgenesis in rats: technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li><li>Armstrong, D. T., Opavsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superovulation+of+immature+rats+by+continuous+infusion+of+follicle-stimulating+hormone.">Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone.</a> Biology of Reproduction. 39 (3), 511-518 (1988).</li><li>Popova, E., Krivokharchenko, A., Ganten, D., Bader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+PMSG-+and+FSH-induced+superovulation+for+the+generation+of+transgenic+rats.">Comparison between PMSG- and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats.</a> Molecular Reproduction and Development. 63 (2), 177-182 (2002).</li><li>Johnson, L. W., Moffatt, R. J., Bartol, F. F., Pinkert, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+embryo+transfer+protocols+for+mice.">Optimization of embryo transfer protocols for mice.</a> Theriogenology. 46 (7), 1267-1276 (1996).</li><li>van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirally+generated+eGFP-transgenic+rats+allow+efficient+cell+tracking+in+vivo.">Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo.</a> Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Lentiviral+Vectors+to+Obtain+Transgenic+Rats.">The Use of Lentiviral Vectors to Obtain Transgenic Rats.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 109-125 (2010).</li></ol>

Fremskridt inden for transgene teknologier har gjort gnavere modeller et uvurderligt redskab i biomedicinsk forskning. De giver mulighed for at studere genotype-fænotype relationer in vivo. Her præsenterer vi et bredt tilgængeligt alternativ til konventionel transgenese ved pronuclear injektioner. Brugen af lentiviral gentransduktion omgår behovet for krævende mikroinjektioner, fordi virale vektorer kan injiceres under zona pellucida. Denne fremgangsmåde påvirker ikke embryonens integritet, som i det væsentlige g...

I mange år har laboratoriegnavere, såsom rotter og mus, været brugt til at modellere menneskelige fysiologiske og patologiske forhold. Dyreforsøg har ført til opdagelser, der var uopnåelige på nogen anden måde. I første omgang fokuserede genetiske undersøgelser på analyse af spontant forekommende lidelser og fænotyper, der anses for nøje at efterligne den menneskelige tilstand1. Udviklingen af genteknologiske metoder gjorde det muligt at indføre eller slette specifikke gener for at opnå en ønsket fænotype. Derfor er generation af transgene dyr anerkendt som en grundlæggende teknik i moderne forskning, der tillader undersøgelser af genfunktion i levende organismer.
Transgene dyreteknologi er blevet mulig gennem en kombination af resultater inden for eksperimentel embryologi og molekylærbiologi. I 1960'erne offentliggjorde den polske embryolog A. K. Tarkowski det første værk om museembryosmanipulation i de tidlige udviklingsstadier2. Derudover udviklede molekylærbiologer teknikker til at generere DNA-vektorer (dvs. bærere) til bl.a. Disse vektorer tillader udbredelse af udvalgte gener og deres passende modifikation, afhængigt af hvilken type forskning der udføres. Udtrykket "transgene dyr" blev indført af Gordon og Ruddle3.
Den første bredt accepterede arter, der blev brugt i neurobiologi, fysiologi, farmakologi, toksikologi, og mange andre områder af biologiske og medicinske videnskaber var Norge rotte, Rattus norvegicus4. Men på grund af vanskelighederne med at manipulere rotte embryoner, huset musen Mus muskulahar blevet den dominerende dyrearter i genetisk forskning5. En anden grund til musens forrang i en sådan forskning var tilgængeligheden af embryonal stamcelleteknologi til at generere knockout dyr til denne art. Den mest almindeligt anvendte teknik transgenese (2-10% af transgene afkom i forhold til alle fødte dyr) er mikroinjektion af DNA-fragmenter i en pronucleus af en befrugtet oocyt. I 1990 blev denne fremgangsmåde, som først blev indført i mus, tilpasset til rotter6,7. Rotte transgenese ved pronuclear injektion er karakteriseret ved lavere effektivitet8 sammenlignet med mus, som er strengt relateret til tilstedeværelsen af elastisk plasma og pronukleare membraner9. Selv om overlevelsen af embryoner efter manipulation er 40-50% lavere end hos mus, denne teknik betragtes som en standard i dannelsen af genetisk modificerede rotter10. Alternative tilgange, der kan garantere effektiv transgeniblanding og højere overlevelsesrater for injicerede zygoter, er blevet undersøgt.
Den vigtigste faktor for stabil transgene udtryk og overførsel til afkom er dens integration i værtscellegenomet. Lentivira (LVs) har det karakteristiske træk at være i stand til at inficere både dividere og ikke-dividere celler. Deres anvendelse som et redskab til inkorporering af heterologe gener i embryoner viste sig at være yderst effektiv11, og transgene individer er kendetegnet ved stabil teksion af det inkorporerede DNA-fragment. Effekten af lentivirale vektorer er blevet bekræftet til genetisk modifikation af mus12,13, rotter12,14og andre arter11. Ved denne metode injiceres LV-suspensionen under embryonets zona pellucida på stadiet af to pronuclei. Denne teknik væsentlige garanterer 100% overlevelse af embryoner, fordi oolemma forbliver upåvirket. Produktionen af forholdsvis koncentrerede LV-suspensioner af høj kvalitet er afgørende faktorer. Lavere koncentrationer af LV-suspensioner kan dog overvindes ved gentagne injektioner11, hvilket øger mængden af viruspartikler på ægoverfladen, mens det ikke påvirker membranintegrationen. Embryoner, der udsættes for gentagne injektioner i perivitellinrummet, udvikler sig yderligere, og transgene afkom kan overføre transgene gennem kønskiminen. Effektiviteten af transgene rotte generation af lentiviral transgenese kan være så højt som 80%12.
Her beskriver vi produktionen af HIV-1-afledt rekombinant lentivirus, der blev pseudotyped med vesikulær stomatitisvirus (VSV) G kuvertprotein. Brugen af anden generations emballeringssystem VSV pseudotype bestemmer den brede infektivitet af viruspartikler og tillader produktion af meget stabile vektorer, der kan koncentreres ved ultracentrifugering og kryopræpareret. Efter titer verifikation, vektorerne er klar til at blive brugt som et køretøj til transgene levering i albino Wistar rotte zygotes. Efter en række injektioner, kan embryonerne dyrkes natten over og overføres på to-celle stadium til plejemødre. På dette tidspunkt kan en af to alternative tilgange overvejes. Standardproceduren udnytter pseudogravide hunner som embryomodtagere. Men når graviditetsraten er lav efter parring med vasektomerede hanner, kan embryonerne implanteres i gravide Wistar/Sprague-Dawley (SD) hunner, der er parret med frugtbare hanrotter med en mørk pelsfarve (f.eks. Farven på pelsen tillader sondringen af afkom fra naturlig graviditet fra afkom, der stammer fra de overførte manipulerede embryoner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1208px;" width="1209">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">7500 Real Time PCR System</td>
			<td style="width:186px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:354px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Aerrane (isoflurane)</td>
			<td style="width:186px;">Baxter</td>
			<td style="width:354px;">FDG9623</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Atipam 5 mg/ml</td>
			<td>Eurovet Animal Health BV</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5-10 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15</td>
			<td style="width:186px;">Harvard Apparatus Limited</td>
			<td style="width:354px;">30-0039</td>
			<td style="width:172px;">injection capillary</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bupivacaine 25 mg/ml</td>
			<td>Advanz Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.25% in&#160; 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Butomidor 10 mg/ml (butorphanol&#160; tartrate)</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm</td>
			<td style="width:186px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:354px;">627160</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:496px;">CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm</td>
			<td style="width:186px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:354px;">628160</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">CellTram Oil</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">5176 000.025</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml</td>
			<td>cp-pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin&#160;</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>150 IU/ ml ml 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">D6048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">DNase, RNase-free</td>
			<td style="width:186px;">A&#38;A Biotechnology</td>
			<td style="width:354px;">1009-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES-005-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid)&#160;</td>
			<td style="width:186px;">ADDGENE</td>
			<td style="width:354px;">14888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">FemtoJet</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">4i /5252 000.013</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">F9665-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Folligon, Pregnant Mare&#8217;s Serum Gonadotropin&#160;</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>125 IU/ml in .9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEK 293T cells&#160;</td>
			<td style="width:186px;">ATCC</td>
			<td style="width:354px;">ATCC CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase from Bovine Testis&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272-30MG</td>
			<td>0.5 mg/ml in M2 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Inverted Microscope&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Zeiss</td>
			<td style="width:354px;">Axiovert 200</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine 100mg/ml</td>
			<td>Biowet Pulawy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Paraffin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M16 medium EmbryoMax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MR-016-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Magnesium Chloride 1M</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">63069-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Microforge</td>
			<td style="width:186px;">Narishige</td>
			<td style="width:354px;">MF-900</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl 0.9%</td>
			<td>POLPHARMA OTC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sterile, 5ml ampules</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Operation microscope&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Inami Ophthalmic Instruments</td>
			<td style="width:354px;">Deca-21</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors&#160; (delta R8.2 plasmid)</td>
			<td style="width:186px;">ADDGENE</td>
			<td style="width:354px;">12263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,),</td>
			<td style="width:186px;">Polysciences, Inc</td>
			<td style="width:354px;">23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Penicilin-streptomycin</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">806552-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Puller&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:354px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Reflex Clip Applier/Reflex Clips</td>
			<td style="width:186px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:354px;">500345/500346</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads</td>
			<td style="width:186px;">B.Braun Surgical</td>
			<td style="width:354px;">1048029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:186px;">Olympus</td>
			<td style="width:354px;">SZX16</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Sewing Thread</td>
			<td>B.Braun&#160;</td>
			<td>C1048040</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:186px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:354px;">4334973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tolfedine 4% (tolfenamic acid)</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">TransferMan NK2</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">N/A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Trypsin EDTA solution</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">T3924-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:186px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:354px;">Optima L-100 XP&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">VacuTip</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">5175108.000</td>
			<td style="width:172px;">holders capillary</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vita-POS</td>
			<td>Ursapharm</td>
			<td>N/A</td>
			<td>eye ointment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Warming Plate</td>
			<td style="width:186px;">Semic</td>
			<td style="width:354px;">N/A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Watchmaker Forceps</td>
			<td style="width:186px;">VWR</td>
			<td>470018-868</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of transgenic rats using a lentiviral vector approach

Transgene dyremodeller er grundlæggende vigtige for moderne biomedicinsk forskning. Inkorporeringen af fremmede gener i tidlige muse- eller rotteembryoner er et uvurderligt redskab til analyse af genfunktionen i levende organismer. Standardtransgenesemetoden er baseret på mikroindsprøjtning af udenlandske DNA-fragmenter i en pronucleus af en befrugtet oocyt. Denne teknik er meget udbredt i mus, men er stadig relativt ineffektiv og teknisk krævende hos andre dyrearter. Transgenet kan også indføres i et-trins embryoner via lentiviral infektion, hvilket giver et effektivt alternativ til standard pronuclear injektioner, især hos arter eller stammer med en mere udfordrende embryo struktur. I denne fremgangsmåde sprøjtes en suspension, der indeholder lentivirale vektorer, ind i perivitelline-rummet hos et befrugtet rottefoster, som er teknisk mindre krævende og har en højere succesrate. Lentivirale vektorer viste sig effektivt at indarbejde transgenet i genomet for at bestemme dannelsen af stabile transgene linjer. Trods visse begrænsninger (f.eks. biosikkerhedsniveau 2-krav, DNA-fragmentstørrelsesgrænser) er lentiviral transgenese en hurtig og effektiv transgenesemetode. Derudover, ved hjælp af kvindelige rotter, der er parret med en frugtbar mandlig stamme med en anden dominerende pels farve præsenteres som et alternativ til at generere pseudopregnant plejemødre.

Ved hjælp af den protokol, der er beskrevet heri, blev der produceret udlånte vektorer, der bar Syn-TDP-43-eGFP-konstruktionen (fysisk LV-titer = 3,4 x 108/μL), og derefter kunne de anvendes til subzonale injektioner i ét celletrin. Kun embryoner med to synlige pronuclei er blevet underkastet proceduren. Antallet af injektioner af virale suspensioner blev bestemt eksperimentelt. Høj implantationseffektivitet og samtidig mangel på transgene afkom blev betragtet som indikatorer for et utilstrækkeligt anta...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach at JoVE.com

Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach

Denne artikel har til formål at give metoden for lentiviral transgenese i rotte embryoner ved hjælp af flere injektioner af en virus suspension i zygote perivitelline rummet. Kvindelige rotter, der er parret med en frugtbar mandlig stamme med en anden dominerende pels farve bruges til at generere pseudopregnant plejemødre.

Generation af transgene rotter ved hjælp af en lentiviral Vector Approach

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is ...

Transgene dyr er grundlæggende for moderne biomedicinsk forskning, da de tillader undersøgelser af genfunktion i levende organismer. Forskellige metoder til genetiske modifikationer er blevet anvendt i dyreforsøg. Her præsenterer vi en bredt tilgængelig og effektiv teknik, der bruger lentivirale vektorer som et redskab til transgene inkorporering i genomet af en rotte embryo.Efter human chorionic gonadotropin administration, mate fem uger gamle Wistar kvindelige rotter en-til-en med seksuelt frugtbare tre til 10-måneder gamle Wistar mænd. På otte til 10 a.m. næste morgen, kontrollere hunnerne for tilstedeværelsen af en vaginal stik og høste fåruktterne fra hunnerne med et parringsstik senest 10 a.m.i en opsamlingsskål, der indeholder forvardt M2-medium. Når alle oviducts er blevet indsamlet, overføres vævene til en 35 millimeter skål indeholdende forvarmt M2-medium suppleret med 0,5 mg per milliliter hyaluronidase fra kvæg testiklerne og placere skålen under et stereomikroskop. Brug fine hæcener til at åbne oviductens vægge og tryk på ampullaen, indtil embryonerne er frigjorte.For at lette frigivelsen af embryonerne fra cumuluscellerne skal du bruge en glasoverførselspipette, der er forbundet med et mundbetjent aspiratorrør, til forsigtigt at pipette embryonerne op og ned. Når alle embryoner er blevet frigivet, vaske cellerne et par gange i frisk M2 medium for at fjerne hyaluronidase og cellulære snavs. Embryonerne overføres til individuelle 50 mikroliterdråber af forkvædet M16-medium, der er dækket af mineralsk olie, i en 60 millimeter skål.Derefter placere parabol i en befugtet 37 grader Celsius inkubator med en 5% kuldioxid atmosfære, indtil deres injektion. For lentiviral vektor mikroinjektion under zona pellucida af encellede fase embryoner, skal du bruge en pipette puller til at forberede mikroinjection borosilikat glas kapillærer med en glødetråd. Efter hver gang glødetråden skiftes eller en ny glaskapillær anvendes, skal du køre en rampetest for at indstille de optimale parametre.Brug derefter en mikrolæsserspids til at indlæse ca. to mikroliter frisk optøet lentiviral opløsning pr. mikroinjektionspipette under en biosikkerhed laminar flowhætte. Tilsæt en 100 mikroliter dråbe M2 medium til midten af låget fra en 60 millimeter petriskål. Dæk mediet med mineralsk olie og monter holdepipetten og den virusbelastede mikroinjstionkapillær på en mikromanipulator.Anvend mikroinjektionskålen under et omvendt mikroskop, og overfør 15 til 20 encellede faseembryoner i M2-dråben i mikroinjektionskålen. Opfang et embryon med holdepipetten, og brug 400 gange forstørrelsen og glaskapillæren til at indsprøjte lentiviral opløsningen under zona pellucida i perivitellinerummet, der holder kapillæren under zona pellucida et øjeblik efter, at virussen er blevet leveret. Når alle embryonerne er blevet injiceret, skal du bruge en fin pipette til at returnere de injicerede celler til kulturskålen og returnere skålen til cellekulturinkubatoren, indtil de implanteres.For at forberede plejemødre til embryo overførsel, mate seksuelt modne Sprague-Dawley hunner med vasectomized mænd og kontrollere hunnerne næste morgen for en vaginal stik. Efter at have bekræftet en manglende reaktion på pedal refleks i bedøvet hunner med en levedygtig stik, anvende salve til dyrets øjne og barbere pelsen fra bagsiden af hvert dyr. Placer den første rotte i den udsatte position på en ren overflade på en varmepude under et kirurgisk mikroskop.Dæk rotten med en steril drapere med et lille hul skåret over lænden og lav et ca. to centimeters hudincision parallelt med lændehvirvelsøjlen. Brug skarpe saks til at gøre et snit i bugvæggen og bruge antændre til at forstå en æggestokkene fedt pad. Træk æggestokkene og oviduct ud af bughulen på et stykke 0,9% natriumchlorid gennemblødt gaze.Belastning M2 medium, tre bobler af luft, og embryoner i en overførsel kapillær. Brug mikroscissorer til at lave et lille snit i oviductet mellem infundibulum og ampulla og indsæt spidsen af overførselspipetten i snittet. Forsigtigt udvise embryoner og luftbobler i oviduct, derefter bruge stumpe kraftstrømp til at placere forplantningsorganerne tilbage i bughulen.Sutur bugvæggen med polyglykolsyre absorberbare suturer og lukke huden snit med sårclips og placere dyret i et rent bur på en opvarmning plade med overvågning, indtil fuld recumbency. At vasectomize potentielle hjælpere, efter at forberede den mandlige rotte til kirurgi som påvist, bruge 70% ethanol og en kirurgisk krat til at desinficere huden over testiklerne. Tryk forsigtigt maven for at udsætte testiklerne i scrotal sac og dække rotten med en steril drapere med et lille hul over operationsstedet og bruge scrotal saks til at gøre en 0,5 centimeter snit i midten af sæk.Skub forsigtigt testiklerne til venstre og find vas deferens mellem testiklerne og midterlinjen som en hvid kanal med et enkelt blodkar. Brug urmagerens kraftbecer til forsigtigt at trække vasen deferens ud af scrotal sac og holde fartøjet med kraftbekræftende, skal du bruge en saks til at fjerne en en centimeter fragment fra kanalen. Proceduren for den anden testis gentages som blot påvist, og huden lukkes med polyglykolsyre absorberbare suturer.Derefter placere rotte i et rent bur på en opvarmning plade med overvågning, indtil fuld recumbency. I dette repræsentative eksperiment, hvor enkelte embryoner blev injiceret flere gange, blev der født otte rotter af embryoner, der blev injiceret to gange, hvoraf tre blev bekræftet at bære transgenet. En af grundlæggerne ikke overføre transgene til afkom og tre pleje hunner blev brugt til hver eksperimentel opsætning.Den valgte tilgang gjorde det muligt at producere stabile transgene rottelinjer, der udtrykte TDP-43-eGFP-fusionsproteinet under kontrol af neuronal synapse hos en promotor i hele centralnervesystemet. Lentivirus-baseret transgenese resulterede i en enkelt kopi indsættelse af transgenet som påvist ved kvantitativ PCR. Når denne metode blev anvendt til andre lentivirale vektorer, en ca 90% overlevelsesrate blev observeret.Procentdelen af embryoner, der overlevede de pronukleare injektioner var betydeligt lavere. Samlet set tyder disse resultater på, at gravide hunrotter kan anvendes som plejemødre med en sammenlignelig effektivitet. Især viste de numeriske data, der blev analyseret for individuelle runder af mikroinjektion, at implantationens effektivitet afhang direkte af antallet af injektioner i et embryon og indirekte på den virale belastning.Brugen af lentivirale vektorer garanterer den genomiske integration og overførsel af transgenet og letter en høj overlevelsesrate for de mikromanipulerede embryoner, selv når der udføres flere subdermale injektioner. Denne procedure kan anvendes effektivt på andre arter og kan betragtes som et alternativ til konventionel transgenese.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

En Cre-Lox P Rekombination Fremgangsmåde til påvisning af Cell Fusion In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Hud tatovering som en ny tilgang til DNA Vaccine Delivery

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Generering af Shear Vedhæftning kort Brug SynVivo Syntetisk Mikrovaskulære Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering af komplekse systemer ved hjælp af udformning af eksperimenter Fremgangsmåde: Transient Protein Expression i tobak som et casestudie

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddobbeltlaget Vesikel Generation Brug Mikrofluid højtryksspuler

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Dobbelt Emulsion Generation Ved hjælp af en Polydimethylsiloxan (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generation af ESC-afledt Mouse Airway epitelceller Brug decellulariserede Lung Stilladser

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: En kraftfuld, Noninvasive tilgang at undersøge cellulære energimetabolisme

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

In Silico Modeling Method for Computational Aquatic Toxicology of Endocrine Disruptors: A Software-Based Approach Using QSAR Toolbox

I silico modellering metode til Computational akvatisk toksikologi af hormonforstyrrende stoffer: en software-baseret tilgang ved hjælp af QSAR Toolbox

Computational analyses of toxicological processes enables high-throughput screening of chemical substances and prediction of their endpoints in biological ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

Væv-Manipuleret Graft for circumferential esophageal rekonstruktion hos rotter

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...