Name: generation of transgenic rats using a lentiviral vector approach
Uploaded: 2020-05-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door het ANIMOD-project binnen het Team Tech Core Facility Plus-programma van de Foundation for Polish Science, medegefinancierd door de Europese Unie in het kader van het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling aan WK.

De productie en toepassing van virale vectoren was in overeenstemming met de bioveiligheidsniveau 2-richtlijnen en werd goedgekeurd door het Poolse ministerie van Milieu. Alle experimentele dierprocedures die hieronder worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Lokale Ethische Commissie. De dieren werden ondergebracht in individueel geventileerde kooien bij een stabiele temperatuur (21-23 °C) en vochtigheid (50-60%) met ad libitum toegang tot water en voedsel onder een 12 h/12 h licht/donker cyclus.
<p class="jove_...

<ol>
	<li>Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+genomics+on+research+in+the+rat.">Impact of genomics on research in the rat.</a> Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).</li><li>Tarkowski, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+mouse+chimeras+developed+from+eggs+fused+in+vitro.">Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro.</a> National Cancer Institute Monographs. 11, 51-71 (1963).</li><li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei.">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li><li>Gill, T. J., Smith, G. J., Wissler, R. W., Kunz, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rat+as+an+Experimental+Animal.">The Rat as an Experimental Animal.</a> Science. 245 (4915), 269-276 (1989).</li><li>Aitman, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+prospects+in+rat+genetics:+a+community+view.">Progress and prospects in rat genetics: a community view.</a> Nature Genetics. 40 (5), 516-522 (2008).</li><li>Hammer, R. E., Maika, S. D., Richardson, J. A., Tang, J. P., Taurog, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+inflammatory+disease+in+transgenic+rats+expressing+HLA-B27+and+human+beta+2m:+an+animal+model+of+HLA-B27-associated+human+disorders.">Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders.</a> Cell. 63 (5), 1099-1112 (1990).</li><li>Mullins, J. J., Peters, J., Ganten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fulminant+hypertension+in+transgenic+rats+harbouring+the+mouse+Ren-2+gene.">Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene.</a> Nature. 344 (6266), 541-544 (1990).</li><li>Menoret, S., Remy, S., Usal, C., Tesson, L., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgenic+Rats+by+Microinjection+of+Short+DNA+Fragments.">Generation of Transgenic Rats by Microinjection of Short DNA Fragments.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 81-92 (2010).</li><li>Tesson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+modifications+of+the+rat+genome.">Transgenic modifications of the rat genome.</a> Transgenic Research. 14 (5), 531-546 (2005).</li><li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+rats:+Technical+aspects+and+models.">Transgenesis in rats: Technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li><li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors.">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+by+lentiviral+vectors:+lack+of+gene+silencing+in+mammalian+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos.">Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2140-2145 (2002).</li><li>Koza, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+TDP-43+depletion+affects+activity-dependent+plasticity.">Neuronal TDP-43 depletion affects activity-dependent plasticity.</a> Neurobiology of Disease. 130, 104499 (2019).</li><li>Scherr, M., Battmer, K., Blomer, U., Ganser, A., Grez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+lentiviral+vector+particle+numbers+by+real-time+PCR.">Quantitative determination of lentiviral vector particle numbers by real-time PCR.</a> Biotechniques. 31 (3), 520 (2001).</li><li>Canseco, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+efficiency+during+gestation+and+the+influence+of+co-transfer+of+non-manipulated+embryos+on+production+of+transgenic+mice.">Gene transfer efficiency during gestation and the influence of co-transfer of non-manipulated embryos on production of transgenic mice.</a> Transgenic Research. 3 (1), 20-25 (1994).</li><li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+rats:+technical+aspects+and+models.">Transgenesis in rats: technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li><li>Armstrong, D. T., Opavsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superovulation+of+immature+rats+by+continuous+infusion+of+follicle-stimulating+hormone.">Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone.</a> Biology of Reproduction. 39 (3), 511-518 (1988).</li><li>Popova, E., Krivokharchenko, A., Ganten, D., Bader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+PMSG-+and+FSH-induced+superovulation+for+the+generation+of+transgenic+rats.">Comparison between PMSG- and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats.</a> Molecular Reproduction and Development. 63 (2), 177-182 (2002).</li><li>Johnson, L. W., Moffatt, R. J., Bartol, F. F., Pinkert, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+embryo+transfer+protocols+for+mice.">Optimization of embryo transfer protocols for mice.</a> Theriogenology. 46 (7), 1267-1276 (1996).</li><li>van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirally+generated+eGFP-transgenic+rats+allow+efficient+cell+tracking+in+vivo.">Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo.</a> Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Lentiviral+Vectors+to+Obtain+Transgenic+Rats.">The Use of Lentiviral Vectors to Obtain Transgenic Rats.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 109-125 (2010).</li></ol>

De vooruitgang in transgene technologieën heeft knaagdiermodellen tot een waardevol hulpmiddel in biomedisch onderzoek gemaakt. Ze bieden de mogelijkheid om genotype-fenotype relaties in vivo te bestuderen. Hier presenteren we een breed beschikbaar alternatief voor conventionele transgenese door pronucleaire injecties. Het gebruik van lentivirale gentransductie omzeilt de noodzaak van veeleisende micro-injecties omdat virale vectoren kunnen worden geïnjecteerd onder de zona pellucida. Deze aanpak heeft geen invloed op ...

Al vele jaren worden laboratoriumknaagdieren, zoals ratten en muizen, gebruikt om menselijke fysiologische en pathologische aandoeningen te modelleren. Dierlijk onderzoek heeft geleid tot ontdekkingen die op een andere manier onbereikbaar waren. Aanvankelijk richtten genetische studies zich op de analyse van spontaan voorkomende aandoeningen en fenotypes die worden beschouwd als een nauwe nabootsing van de menselijke conditie1. De ontwikkeling van genetische manipulatie methoden konden de introductie of verwijdering van specifieke genen om een gewenste fenotype te verkrijgen. Daarom wordt de generatie transgene dieren erkend als een fundamentele techniek in modern onderzoek dat studies van genfunctie in levende organismen mogelijk maakt.
Transgene diertechnologie is mogelijk geworden door een combinatie van prestaties in experimentele embryologie en moleculaire biologie. In de jaren 1960 publiceerde de Poolse embryoloog A. K. Tarkowski het eerste werk over de manipulatie van muisembryo's in de vroege stadia van ontwikkeling2. Daarnaast ontwikkelden moleculaire biologen technieken om DNA-vectoren (d.w.z. dragers) te genereren voor onder meer de introductie van vreemd DNA in het genoom van het dier. Deze vectoren maken de voortplanting van geselecteerde genen en de juiste modificatie mogelijk, afhankelijk van het type onderzoek dat wordt uitgevoerd. De term "transgene dier" werd geïntroduceerd door Gordon en Ruddle3.
De eerste algemeen aanvaarde soort die werd gebruikt in de neurobiologie, fysiologie, farmacologie, toxicologie, en vele andere gebieden van de biologische en medische wetenschappen was de Noorse rat, Rattus norvegicus4. Echter, vanwege de moeilijkheid bij het manipuleren van rattenembryo's, is de huismuis Mus musculus uitgegroeid tot de dominante diersoorten in genetisch onderzoek5. Een andere reden voor het primaat van de muis in dergelijk onderzoek was de beschikbaarheid van embryonale stamceltechnologie om knock-outdieren voor deze soort te genereren. De meest gebruikte techniek van transgenese (2-10% van transgene nakomelingen ten opzichte van alle geboren dieren) is de micro-injectie van DNA-fragmenten in een kern van een bevruchte eicel. In 1990 werd deze aanpak, die voor het eerst werd geïntroduceerd bij muizen, aangepast voor ratten6,7. Transgenese van ratten door pronucleaire injectie wordt gekenmerkt door een lagere efficiëntie8 in vergelijking met muizen, die strikt gerelateerd is aan de aanwezigheid van elastisch plasma en pronucleaire membranen9. Hoewel de overleving van embryo's na manipulatie 40-50% lager is dan bij muizen, wordt deze techniek beschouwd als een standaard in de generatie van genetisch gemodificeerde ratten10. Er zijn alternatieve benaderingen onderzocht die een efficiënte transgeneintegratie en hogere overlevingskansen van geïnjecteerde zygotes kunnen garanderen.
De belangrijkste determinant van stabiele transgene expressie en overdracht naar nakomelingen is de integratie ervan in het genoom van de gastheercel. Lentivirussen (LVs) hebben het onderscheidende kenmerk van de mogelijkheid om zowel delende als niet-delende cellen te infecteren. Hun gebruik als hulpmiddel voor de integratie van heterologe genen in embryo's bleek zeer efficiënt11, en transgene individuen worden gekenmerkt door stabiele expressie van de opgenomen DNA-fragment. De werkzaamheid van lentivirale vectoren is bevestigd voor de genetische modificatie van muizen12,13, ratten12,14en andere soorten11. Bij deze methode wordt de LV-suspensie geïnjecteerd onder de zonapellucida van het embryo in het stadium van twee pronuclei. Deze techniek garandeert in wezen 100% overleving van de embryo's omdat de oolemma onaangetast blijft. De productie van hoogwaardige en relatief sterk geconcentreerde LV-ophangingen zijn cruciale factoren. Lagere concentraties LV-suspensingen kunnen echter worden overwonnen door herhaalde injecties11, waardoor de hoeveelheid virale deeltjes aan het eioppervlak toeneemt en de membraanintegratie niet wordt beïnvloed. Embryo's die worden onderworpen aan herhaalde injecties in de perivitelline ruimte ontwikkelen zich verder, en transgene nakomelingen kunnen het transgeen overbrengen via de kiembaan. De efficiëntie van transgene rattengeneratie door lentivirale transgenese kan oplopen tot 80%12.
Hier beschrijven we de productie van hiv-1-afgeleid recombinant lentivirus dat pseudotyped was met vesiculaire stomatitisvirus (VSV) G-envelopeiwit. Het gebruik van het tweede generatie verpakkingssysteem VSV pseudotype bepaalt de brede infectiviteit van virale deeltjes en maakt de productie van zeer stabiele vectoren die kunnen worden geconcentreerd door ultracentrifugatie en cryopreserved. Na titer verificatie, de vectoren zijn klaar om te worden gebruikt als een voertuig voor transgene levering in albino Wistar rat zygotes. Na een reeks injecties kunnen de embryo's 's nachts worden gekweekt en in het tweecellige stadium worden overgedragen aan pleegmoeders. Op dit punt kan een van de twee alternatieve benaderingen worden overwogen. De standaardprocedure maakt gebruik van pseudozwangere vrouwtjes als embryo-ontvangers. Echter, wanneer de zwangerschap laag is na de paring met vasectomized mannetjes, kunnen de embryo's worden geïmplanteerd in zwangere Wistar / Sprague-Dawley (SD) vrouwtjes die zijn gepaard met vruchtbare mannelijke ratten met een donkere vacht kleur (bijvoorbeeld, Brown Norway [BN] ratten). De kleur van de vacht maakt het mogelijk om nakomelingen van natuurlijke zwangerschap en nakomelingen die afkomstig zijn van de overgedragen gemanipuleerde embryo's, te onderscheiden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1208px;" width="1209">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">7500 Real Time PCR System</td>
			<td style="width:186px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:354px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Aerrane (isoflurane)</td>
			<td style="width:186px;">Baxter</td>
			<td style="width:354px;">FDG9623</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Atipam 5 mg/ml</td>
			<td>Eurovet Animal Health BV</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5-10 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15</td>
			<td style="width:186px;">Harvard Apparatus Limited</td>
			<td style="width:354px;">30-0039</td>
			<td style="width:172px;">injection capillary</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bupivacaine 25 mg/ml</td>
			<td>Advanz Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.25% in&#160; 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Butomidor 10 mg/ml (butorphanol&#160; tartrate)</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm</td>
			<td style="width:186px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:354px;">627160</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:496px;">CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm</td>
			<td style="width:186px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:354px;">628160</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">CellTram Oil</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">5176 000.025</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml</td>
			<td>cp-pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin&#160;</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>150 IU/ ml ml 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">D6048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">DNase, RNase-free</td>
			<td style="width:186px;">A&#38;A Biotechnology</td>
			<td style="width:354px;">1009-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES-005-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid)&#160;</td>
			<td style="width:186px;">ADDGENE</td>
			<td style="width:354px;">14888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">FemtoJet</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">4i /5252 000.013</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">F9665-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Folligon, Pregnant Mare&#8217;s Serum Gonadotropin&#160;</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>125 IU/ml in .9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEK 293T cells&#160;</td>
			<td style="width:186px;">ATCC</td>
			<td style="width:354px;">ATCC CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase from Bovine Testis&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272-30MG</td>
			<td>0.5 mg/ml in M2 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Inverted Microscope&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Zeiss</td>
			<td style="width:354px;">Axiovert 200</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine 100mg/ml</td>
			<td>Biowet Pulawy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Paraffin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M16 medium EmbryoMax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MR-016-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Magnesium Chloride 1M</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">63069-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Microforge</td>
			<td style="width:186px;">Narishige</td>
			<td style="width:354px;">MF-900</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl 0.9%</td>
			<td>POLPHARMA OTC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sterile, 5ml ampules</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Operation microscope&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Inami Ophthalmic Instruments</td>
			<td style="width:354px;">Deca-21</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors&#160; (delta R8.2 plasmid)</td>
			<td style="width:186px;">ADDGENE</td>
			<td style="width:354px;">12263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,),</td>
			<td style="width:186px;">Polysciences, Inc</td>
			<td style="width:354px;">23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Penicilin-streptomycin</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">806552-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Puller&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:354px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Reflex Clip Applier/Reflex Clips</td>
			<td style="width:186px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:354px;">500345/500346</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads</td>
			<td style="width:186px;">B.Braun Surgical</td>
			<td style="width:354px;">1048029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:186px;">Olympus</td>
			<td style="width:354px;">SZX16</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Sewing Thread</td>
			<td>B.Braun&#160;</td>
			<td>C1048040</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:186px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:354px;">4334973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tolfedine 4% (tolfenamic acid)</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">TransferMan NK2</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">N/A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Trypsin EDTA solution</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">T3924-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:186px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:354px;">Optima L-100 XP&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">VacuTip</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">5175108.000</td>
			<td style="width:172px;">holders capillary</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vita-POS</td>
			<td>Ursapharm</td>
			<td>N/A</td>
			<td>eye ointment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Warming Plate</td>
			<td style="width:186px;">Semic</td>
			<td style="width:354px;">N/A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Watchmaker Forceps</td>
			<td style="width:186px;">VWR</td>
			<td>470018-868</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of transgenic rats using a lentiviral vector approach

Transgene diermodellen zijn van fundamenteel belang voor modern biomedisch onderzoek. De integratie van vreemde genen in vroege muis- of rattenembryo's is een waardevol instrument voor genfunctieanalyse in levende organismen. De standaard transgenese methode is gebaseerd op micro-injecterende vreemde DNA-fragmenten in een kern van een bevruchte eicel. Deze techniek wordt veel gebruikt bij muizen, maar blijft relatief inefficiënt en technisch veeleisend bij andere diersoorten. Het transgeen kan ook via lentivirale infectie in embryo's in een celstadium worden gebracht, wat een effectief alternatief biedt voor standaard pronucleaire injecties, vooral bij soorten of stammen met een meer uitdagende embryostructuur. In deze benadering wordt een suspensie die lentivirale vectoren bevat geïnjecteerd in de perivitellineruimte van een bevrucht rattenembryo, dat technisch minder veeleisend is en een hoger slagingspercentage heeft. Lentivirale vectoren bleken het transgeen efficiënt in het genoom op te nemen om de generatie van stabiele transgene lijnen te bepalen. Ondanks enkele beperkingen (bijvoorbeeld biosafety level 2-vereisten, DNA-fragmentgroottelimieten), is lentivirale transgenese een snelle en efficiënte transgenesemethode. Bovendien, met behulp van vrouwelijke ratten die zijn gepaard met een vruchtbare mannelijke stam met een andere dominante vacht kleur wordt gepresenteerd als een alternatief voor het genereren van pseudozwangere pleegmoeders.

Met behulp van het hierbeschreven protocol werden lentivirale vectoren die de Syn-TDP-43-eGFP-constructie droegen geproduceerd (fysieke LV-titer = 3,4 x 108/μL) en vervolgens kunnen worden gebruikt voor embryosubzonale injecties in één cel. Alleen embryo's met twee zichtbare pronuclei werden onderworpen aan de procedure. Het aantal injecties met virale suspensies werd experimenteel bepaald. Hoge implantatie-efficiëntie en een gelijktijdig gebrek aan transgene nakomelingen werden beschouwd als indicatoren v...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach at JoVE.com

Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach

Dit artikel is bedoeld om de methodologie voor lentivirale transgenese in rattenembryo's met behulp van meerdere injecties van een virussuspensie in de zygote perivitelline ruimte. Vrouwelijke ratten die zijn gepaard met een vruchtbare mannelijke stam met een andere dominante vacht kleur wordt gebruikt om pseudozwangere pleegmoeders te genereren.

Generatie transgene ratten met behulp van een Lentivirale Vector Approach

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is ...

Transgene dieren zijn fundamenteel voor modern biomedisch onderzoek omdat ze studies van genfunctie in levende organismen mogelijk maken. Verschillende methoden van genetische modificaties zijn toegepast in dierstudies. Hier presenteren we een breed toegankelijke en effectieve techniek die lentivirale vectoren gebruikt als een instrument voor transgene integratie in het genoom van een rattenembryo.Na menselijke chorionic gonadotropin administratie, mate vijf weken oude Wistar vrouwelijke ratten een-op-een met seksueel vruchtbare drie tot 10 maanden oude Wistar mannetjes. Om acht tot tien.m uur de volgende ochtend, controleer de vrouwtjes op de aanwezigheid van een vaginale plug en oogst de eicellen van de vrouwtjes met een paringsplug door niet later dan 10 a.m.in een collectieschotel met voorverwarmd M2-medium. Wanneer alle oviducten zijn verzameld, breng de weefsels in een 35 millimeter schotel met voorverwarmd M2 medium aangevuld met 0,5 milligram per milliliter hyaluronidase van rundertestes en plaats de schotel onder een stereomicroscoop. Gebruik fijne tangen om de wanden van het oviduct te openen en druk op de ampulla totdat de embryo's zijn vrijgegeven.Om het vrijkomen van de embryo's uit de cumuluscellen te vergemakkelijken, gebruikt u een glasoverdrachtpipet die is aangesloten op een in de mond bediende aspiratorbuis om de embryo's voorzichtig op en neer te pipetten. Wanneer alle embryo's zijn vrijgegeven, was de cellen een paar keer in verse M2 medium om de hyaluronidase en cellulaire puin te verwijderen. Breng de embryo's in individuele 50 microliter druppels van vooraf geëquilibreerde M16 medium bedekt met minerale olie in een 60 millimeter schotel.Plaats de schotel vervolgens in een bevochtigde 37 graden Celsius incubator met een 5%kooldioxide atmosfeer tot hun injectie. Voor lentivirale vectormicroinjectie onder de zona pellucida van de eencellige embryo's, gebruik een pipettrekker om microinjectieborosilicaat glas haarvaten met een gloeidraad voor te bereiden. Nadat elke keer dat de gloeidraad wordt veranderd of een nieuwe glazen capillaire wordt gebruikt, voert u een Ramp-test uit om de optimale parameters in te stellen.Gebruik vervolgens een microloadertip om ongeveer twee microliter vers ontdooide lentivirale oplossing per microinjectiepipet onder een bioveiligheidslainaire stroomkap te laden. Voeg een 100 microliter druppel M2 medium toe aan het midden van het deksel van een 60 millimeter petrischaal. Bedek het medium met minerale olie en monteer de houdpipet en het virus geladen microinjectie capillary op een micromanipulator.Plaats de micro-injectieschaal onder een omgekeerde microscoop en breng 15 tot 20 eencellige embryo's in de M2-druppel in de micro-injectieschaal. Vang een embryo met de holding pipet en gebruik de 400 keer vergroting en de glazen capillaire om de lentivirale oplossing onder de zona pellucida injecteren in de perivitelline ruimte met de capillaire onder de zona pellucida voor een moment nadat het virus is geleverd. Wanneer alle embryo's zijn geïnjecteerd, gebruik dan een fijne pipet om de geïnjecteerde cellen terug te keren naar de kweekschaal en de schotel terug te brengen naar de celkweek incubator tot hun implantatie.Ter voorbereiding van de pleegmoeders voor de embryo-overdracht, partner seksueel volwassen Sprague-Dawley vrouwtjes met vasectomized mannetjes en controleer de vrouwtjes de volgende ochtend voor een vaginale plug. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op pedaalreflex bij de verdoofde vrouwtjes met een levensvatbare stekker, breng dezeint aan op de ogen van het dier en scheer de vacht van de achterkant van elk dier. Plaats de eerste rat in de gevoelige positie op een schoon oppervlak op een verwarmingskussen onder een chirurgische microscoop.Bedek de rat met een steriel laken met een klein gaatje gesneden over de onderrug en maak een ongeveer twee centimeter huidincisie parallel aan de lendenwervelkolom. Gebruik een scherpe schaar om een snee in de buikwand te maken en gebruik tangen om een eierstok vet pad te grijpen. Trek de eierstok en het eicel uit de buikholte op een stuk van 0,9% natriumchloride gedrenkt gaas.Laad M2 medium, drie luchtbellen, en de embryo's in een overdracht capillair. Gebruik microscissors om een kleine incisie in het eivlies tussen het infundibulum en ampulla te maken en steek de punt van de overdrachtpipet in de incisie. Verdrijf voorzichtig de embryo's en luchtbellen in het eivlies en gebruik vervolgens stompe tangen om het voortplantingskanaal terug in de buikholte te plaatsen.Hecht de buikwand met polyglycolzuurabsorberende hechtingen en sluit de huidincisie met wondklemmen en plaats het dier in een schone kooi op een verwarmende plaat met controle tot volledige recumbency. Om potentiële partners te vasectomiseren, gebruik na het voorbereiden van de mannelijke rat voor een operatie zoals aangetoond, 70% ethanol en een chirurgische scrub om de huid over de teelballen te desinfecteren. Druk voorzichtig op de buik om de teelballen in de scrotale zak bloot te leggen en bedek de rat met een steriele gordijn met een klein gaatje over de chirurgische plaats en gebruik een scrotale schaar om een incisie van 0,5 centimeter in het midden van de zak te maken.Duw de testis voorzichtig naar links en lokaliseer de vas deferens tussen de testis en de middellijn als een wit kanaal met een enkel bloedvat. Gebruik de tang van de makep om de vas deferens voorzichtig uit de scrotale zak te trekken en het vat met tangen vast te houden, gebruik fijne schaar om een fragment van één centimeter uit het kanaal te verwijderen. Herhaal de procedure voor de tweede testis zoals net aangetoond en sluit de huid met polyglycolzuur absorbeerbare hechtingen.Plaats de rat vervolgens in een schone kooi op een opwarmingsplaat met controle tot volledige recumbency. In dit representatieve experiment waarbij enkele embryo's meerdere keren werden geïnjecteerd, werden acht ratten geboren uit embryo's die twee keer werden geïnjecteerd, waarvan er drie werden bevestigd om het transgene te dragen. Een van de oprichters bracht het transgene niet over aan nakomelingen en drie pleegvrouwtjes werden gebruikt voor elke experimentele opstelling.De gekozen aanpak stond de generatie van stabiele transgene rattenlijnen toe die het TDP-43-eGFP-fusieeiwit onder controle van de neuronale synaps in één promotor in het hele centrale zenuwstelsel uitdrukten. De transgenese op basis van lentivirus resulteerde in een enkele kopie inbrengen van het transgene, zoals blijkt uit kwantitatieve PCR. Toen deze methode werd gebruikt voor andere lentivirale vectoren, werd een overlevingskans van ongeveer 90% waargenomen.Het percentage embryo's dat de pronucleaire injecties overleefde was aanzienlijk lager. Over het algemeen suggereren deze resultaten dat zwangere vrouwelijke ratten kunnen worden gebruikt als pleegmoeders met een vergelijkbare efficiëntie. Met name de numerieke gegevens die werden geanalyseerd voor individuele rondes van micro-injectie aangegeven dat de effectiviteit van implantatie direct afhing van het aantal injecties in een embryo en indirect van de virale belasting.Het gebruik van lentivirale vectoren garandeert de genomische integratie en overdracht van het transgenaal en vergemakkelijkt een hoge overlevingskans van de micromanipuleerde embryo's, zelfs wanneer meerdere onderhuidse injecties worden uitgevoerd. Deze procedure kan effectief worden toegepast op andere soorten en kan worden beschouwd als een alternatief voor conventionele transgenese.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

Een Cre-Lox P Recombinatie Aanpak voor de detectie van celfusie In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Huid tatoeëren als een nieuwe benadering voor DNA-vaccin Levering

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Generatie afschuifhechting Kaart behulp SynVivo Synthetische Microvascular Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering van complexe systemen met behulp van de Design of Experiments Aanpak: Transient Eiwitexpressie in tabak als een case study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Dubbele Emulsion Generation Met een Polydimethylsiloxaan (PDMS) Co-axiale Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generatie van ESC afgeleide Mouse epitheelcellen behulp van cellen ontdane Lung Steigers

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: Een krachtige, Noninvasive benadering onderzoeken van cellulaire energiemetabolisme

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

In Silico Modeling Method for Computational Aquatic Toxicology of Endocrine Disruptors: A Software-Based Approach Using QSAR Toolbox

In silico Modeling method voor computationele aquatische toxicologie van hormoonontregelende stoffen: een op software gebaseerde aanpak met QSAR toolbox

Computational analyses of toxicological processes enables high-throughput screening of chemical substances and prediction of their endpoints in biological ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

Tissue-Engineered Graft voor circumferential slokdarmreconstructie bij ratten

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...