Name: generation of transgenic rats using a lentiviral vector approach
Uploaded: 2020-05-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach at JoVE.com

Diese Studie wurde durch das ANIMOD-Projekt im Rahmen des Team Tech Core Facility Plus-Programms der Stiftung für polnische Wissenschaft unterstützt, das von der Europäischen Union aus dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung an die WK kofinanziert wurde.

Die Herstellung und Anwendung von Virusvektoren entsprach den Richtlinien der Biosicherheitsstufe 2 und wurde vom polnischen Umweltministerium genehmigt. Alle versuchsweisen Tierverfahren, die unten beschrieben werden, wurden von der Lokalen Ethikkommission genehmigt. Die Tiere wurden in individuell belüfteten Käfigen bei stabiler Temperatur (21–23 °C) und Luftfeuchtigkeit (50–60%) untergebracht. mit ad libitum Zugang zu Wasser und Nahrung unter einem 12 h/12 h Licht/Dunkel-Zyklus.
1. Len...

<ol>
	<li>Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+genomics+on+research+in+the+rat.">Impact of genomics on research in the rat.</a> Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).</li><li>Tarkowski, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+mouse+chimeras+developed+from+eggs+fused+in+vitro.">Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro.</a> National Cancer Institute Monographs. 11, 51-71 (1963).</li><li>Gordon, J. W., Ruddle, F. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superovulation+of+immature+rats+by+continuous+infusion+of+follicle-stimulating+hormone.">Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone.</a> Biology of Reproduction. 39 (3), 511-518 (1988).</li><li>Popova, E., Krivokharchenko, A., Ganten, D., Bader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+PMSG-+and+FSH-induced+superovulation+for+the+generation+of+transgenic+rats.">Comparison between PMSG- and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats.</a> Molecular Reproduction and Development. 63 (2), 177-182 (2002).</li><li>Johnson, L. W., Moffatt, R. J., Bartol, F. F., Pinkert, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+embryo+transfer+protocols+for+mice.">Optimization of embryo transfer protocols for mice.</a> Theriogenology. 46 (7), 1267-1276 (1996).</li><li>van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirally+generated+eGFP-transgenic+rats+allow+efficient+cell+tracking+in+vivo.">Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo.</a> Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Lentiviral+Vectors+to+Obtain+Transgenic+Rats.">The Use of Lentiviral Vectors to Obtain Transgenic Rats.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 109-125 (2010).</li></ol>

Fortschritte in den transgenen Technologien haben Nagetiermodelle zu einem unschätzbaren Werkzeug in der biomedizinischen Forschung gemacht. Sie bieten die Möglichkeit, Genotyp-Phänotyp-Beziehungen in vivo zu untersuchen. Hier stellen wir eine weit verbreitete Alternative zur konventionellen Transgenese durch pronukleäre Injektionen vor. Die Verwendung von lentiviraler Gentransduktion umgeht die Notwendigkeit anspruchsvoller Mikroinjektionen, da virale Vektoren unter der Zona pellucida injiziert werden können. Diese...

Seit vielen Jahren werden Labornagetiere wie Ratten und Mäuse verwendet, um menschliche physiologische und pathologische Bedingungen zu modellieren. Tierforschung hat zu Entdeckungen geführt, die auf andere Weise unerreichbar waren. Zunächst konzentrierten sich genetische Studien auf die Analyse spontan auftretender Störungen und Phänotypen, die den menschlichenZustandeng nachahmen 1 . Die Entwicklung gentechnischer Methoden ermöglichte die Ein- oder Löschung bestimmter Gene, um einen gewünschten Phänotyp zu erhalten. Daher wird die Erzeugung transgener Tiere als eine grundlegende Technik in der modernen Forschung anerkannt, die Studien über die Genfunktion in lebenden Organismen ermöglicht.
Die transgene Tiertechnologie ist durch eine Kombination von Errungenschaften in der experimentellen Embryologie und Molekularbiologie möglich geworden. In den 1960er Jahren veröffentlichte der polnische Embryologe A. K. Tarkowski die ersten Arbeiten zur Manipulation von Mausembryonen in den frühen Stadien der Entwicklung2. Zusätzlich entwickelten Molekularbiologen Techniken zur Erzeugung von DNA-Vektoren (d.h. Trägern) für die Unterweise der Einschleppung fremder DNA in das Genom des Tieres. Diese Vektoren ermöglichen die Ausbreitung ausgewählter Gene und deren entsprechende Modifikation, abhängig von der Art der Forschung, die durchgeführt wird. Der Begriff "transgenes Tier" wurde von Gordon und Ruddle3eingeführt.
Die erste weithin akzeptierte Art, die in der Neurobiologie, Physiologie, Pharmakologie, Toxikologie und vielen anderen Bereichen der biologischen und medizinischen Wissenschaften verwendet wurde, war die Norwegische Ratte, Rattus norvegicus4. Aufgrund der Schwierigkeit, Rattenembryonen zu manipulieren, ist die Hausmaus Mus musculus jedoch die dominierende Tierart in der Genforschung geworden5. Ein weiterer Grund für den Vorrang der Maus in solchen Forschungen war die Verfügbarkeit embryonaler Stammzelltechnologie, um Knockout-Tiere für diese Art zu erzeugen. Die am häufigsten verwendete Technik der Transgenese (2–10% der transgenen Nachkommen im Vergleich zu allen geborenen Tieren) ist die Mikroinjektion von DNA-Fragmenten in einen Pronukle einer befruchteten Oozyte. 1990 wurde dieser Ansatz, der erstmals bei Mäusen eingeführt wurde, für Ratten6,7angepasst. Rattentransgenese durch pronukleare Injektion ist durch eine geringere Effizienz8 im Vergleich zu Mäusen gekennzeichnet, die eng mit dem Vorhandensein von elastischem Plasma und pronukleären Membranen 9 zusammenhängt.9 Obwohl das Überleben von Embryonen nach Dermanipulation um 40–50 % niedriger ist als bei Mäusen, gilt diese Technik als Standard bei der Erzeugung genetisch veränderter Ratten10. Es wurden alternative Ansätze untersucht, die eine effiziente Transgenintegration und höhere Überlebensraten von injizierten Zygoten gewährleisten können.
Der Schlüsselfaktor für eine stabile Transgenexpression und Übertragung auf Nachkommen ist seine Integration in das Wirtszellgenom. Lentiviren (LVs) haben das Unterscheidungsmerkmal, dass sie sowohl teilende als auch nicht trennende Zellen infizieren können. Ihre Verwendung als Werkzeug für die Aufnahme heterologer Gene in Embryonen erwies sich als hocheffizient11, und transgene Individuen zeichnen sich durch eine stabile Expression des eingebauten DNA-Fragments aus. Die Wirksamkeit von lentiviralen Vektoren wurde für die genetische Veränderung von Mäusen12,13, Ratten12,14und anderen Arten11bestätigt. Bei dieser Methode wird die LV-Suspension im Stadium von zwei Vorkernen unter die Zona pellucida des Embryos injiziert. Diese Technik garantiert im Wesentlichen ein 100%-Überleben der Embryonen, da das Oolemma nicht betroffen bleibt. Entscheidend ist die Herstellung hochwertiger und relativ hochkonzentrierter LV-Aufhängungen. Niedrigere Konzentrationen von LV-Suspensionen können jedoch durch wiederholte Injektionen überwunden werden11, was die Menge an Viruspartikeln an der Eioberfläche erhöht, ohne die Membranintegration zu beeinträchtigen. Embryonen, die wiederholten Injektionen in den Perivitelline-Raum ausgesetzt sind, entwickeln sich weiter, und transgene Nachkommen können das Transgen durch die Keimbahn übertragen. Die Effizienz der transgenen Rattenerzeugung durch lentivirale Transgenese kann bis zu 80%12betragen.
Hier beschreiben wir die Produktion von HIV-1-abgeleitetem rekombinantem Lentivirus, das pseudotypisiert mit vesikulärem Stomatitisvirus (VSV) G-Hüllprotein war. Der Einsatz des Verpackungssystems VSV-Pseudotyp der zweiten Generation bestimmt die große Infektiosität von Viruspartikeln und ermöglicht die Produktion hochstabiler Vektoren, die durch Ultrazentrifugation und Kryopreservede konzentriert werden können. Nach der Titer-Verifizierung sind die Vektoren bereit, als Vehikel für die Transgenabgabe in Albino Wistar Rattenzygoten verwendet zu werden. Nach einer Reihe von Injektionen können die Embryonen über Nacht kultiviert und im Zwei-Zellen-Stadium an Pflegemütter übertragen werden. An dieser Stelle kann einer von zwei alternativen Ansätzen in Betracht gezogen werden. Das Standardverfahren verwendet pseudoschwangere Weibchen als Embryo-Empfänger. Wenn die Schwangerschaftsrate nach der Paarung mit vasectomisierten Männchen niedrig ist, können die Embryonen jedoch in schwangere Wistar/Sprague-Dawley (SD) Weibchen implantiert werden, die mit fruchtbaren männlichen Ratten mit einer dunklen Fellfarbe gepaart sind (z. B. Brown Norway [BN] Ratten). Die Farbe des Fells ermöglicht die Unterscheidung von Nachkommen von natürlicher Schwangerschaft von Nachkommen, die aus den übertragenen manipulierten Embryonen stammen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1208px;" width="1209">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">7500 Real Time PCR System</td>
			<td style="width:186px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:354px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Aerrane (isoflurane)</td>
			<td style="width:186px;">Baxter</td>
			<td style="width:354px;">FDG9623</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Atipam 5 mg/ml</td>
			<td>Eurovet Animal Health BV</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5-10 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15</td>
			<td style="width:186px;">Harvard Apparatus Limited</td>
			<td style="width:354px;">30-0039</td>
			<td style="width:172px;">injection capillary</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bupivacaine 25 mg/ml</td>
			<td>Advanz Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.25% in&#160; 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Butomidor 10 mg/ml (butorphanol&#160; tartrate)</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm</td>
			<td style="width:186px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:354px;">627160</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:496px;">CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm</td>
			<td style="width:186px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:354px;">628160</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">CellTram Oil</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">5176 000.025</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml</td>
			<td>cp-pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin&#160;</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>150 IU/ ml ml 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">D6048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">DNase, RNase-free</td>
			<td style="width:186px;">A&#38;A Biotechnology</td>
			<td style="width:354px;">1009-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES-005-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid)&#160;</td>
			<td style="width:186px;">ADDGENE</td>
			<td style="width:354px;">14888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">FemtoJet</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">4i /5252 000.013</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">F9665-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Folligon, Pregnant Mare&#8217;s Serum Gonadotropin&#160;</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>125 IU/ml in .9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEK 293T cells&#160;</td>
			<td style="width:186px;">ATCC</td>
			<td style="width:354px;">ATCC CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase from Bovine Testis&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272-30MG</td>
			<td>0.5 mg/ml in M2 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Inverted Microscope&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Zeiss</td>
			<td style="width:354px;">Axiovert 200</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine 100mg/ml</td>
			<td>Biowet Pulawy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Paraffin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M16 medium EmbryoMax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MR-016-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Magnesium Chloride 1M</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">63069-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Microforge</td>
			<td style="width:186px;">Narishige</td>
			<td style="width:354px;">MF-900</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl 0.9%</td>
			<td>POLPHARMA OTC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sterile, 5ml ampules</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Operation microscope&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Inami Ophthalmic Instruments</td>
			<td style="width:354px;">Deca-21</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors&#160; (delta R8.2 plasmid)</td>
			<td style="width:186px;">ADDGENE</td>
			<td style="width:354px;">12263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,),</td>
			<td style="width:186px;">Polysciences, Inc</td>
			<td style="width:354px;">23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Penicilin-streptomycin</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">806552-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Puller&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:354px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Reflex Clip Applier/Reflex Clips</td>
			<td style="width:186px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:354px;">500345/500346</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads</td>
			<td style="width:186px;">B.Braun Surgical</td>
			<td style="width:354px;">1048029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:186px;">Olympus</td>
			<td style="width:354px;">SZX16</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Sewing Thread</td>
			<td>B.Braun&#160;</td>
			<td>C1048040</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:186px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:354px;">4334973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tolfedine 4% (tolfenamic acid)</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">TransferMan NK2</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">N/A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Trypsin EDTA solution</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">T3924-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:186px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:354px;">Optima L-100 XP&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">VacuTip</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">5175108.000</td>
			<td style="width:172px;">holders capillary</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vita-POS</td>
			<td>Ursapharm</td>
			<td>N/A</td>
			<td>eye ointment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Warming Plate</td>
			<td style="width:186px;">Semic</td>
			<td style="width:354px;">N/A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Watchmaker Forceps</td>
			<td style="width:186px;">VWR</td>
			<td>470018-868</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of transgenic rats using a lentiviral vector approach

Transgene Tiermodelle sind für die moderne biomedizinische Forschung von grundlegender Bedeutung. Die Einbindung fremder Gene in frühe Maus- oder Rattenembryonen ist ein unschätzbares Werkzeug für die Genfunktionsanalyse in lebenden Organismen. Die Standard-Transgenese-Methode basiert auf der Mikroinjektion fremder DNA-Fragmente in einen Pronukle einer befruchteten Oozyte. Diese Technik ist bei Mäusen weit verbreitet, bleibt aber bei anderen Tierarten relativ ineffizient und technisch anspruchsvoll. Das Transgen kann auch über eine Lentiviralinfektion in einzellige Embryonen eingebracht werden, was eine wirksame Alternative zu standardpronuklearen Injektionen darstellt, insbesondere bei Arten oder Stämmen mit einer anspruchsvolleren Embryostruktur. Bei diesem Ansatz wird eine Suspension, die lentivirale Vektoren enthält, in den Perivitelinraum eines befruchteten Rattenembryons injiziert, der technisch weniger anspruchsvoll ist und eine höhere Erfolgsrate hat. Es wurde gezeigt, dass Lentivirale Vektoren das Transgen effizient in das Genom integrieren, um die Erzeugung stabiler transgener Linien zu bestimmen. Trotz einiger Einschränkungen (z. B. Anforderungen an die Biosicherheitsstufe 2, Grenzwerte für die Größe von DNA-Fragmenten) ist die lentivirale Transgenese eine schnelle und effiziente Transgenesemethode. Zusätzlich wird die Verwendung weiblicher Ratten, die mit einem fruchtbaren männlichen Stamm mit einer anderen dominanten Fellfarbe gepaart sind, als Alternative zur Erzeugung pseudoschwangerer Pflegemütter dargestellt.

Unter Verwendung des hier beschriebenen Protokolls wurden lentivirale Vektoren hergestellt, die das Syn-TDP-43-eGFP-Konstrukt trugen (physikalischer LV-Titer = 3,4 x 108/L) und konnten dann für subzonale Injektionen im Einzellstadium des Embryos verwendet werden. Nur Embryonen mit zwei sichtbaren Vorkernen wurden dem Verfahren unterzogen. Die Anzahl der Injektionen von viralen Suspensionen wurde experimentell bestimmt. Eine hohe Implantationseffizienz und ein gleichzeitiger Mangel an transgenen Nachkommen wur...

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Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach

Dieser Artikel zielt darauf ab, die Methodik für die lentivirale Transgenese bei Rattenembryonen unter Verwendung mehrerer Injektionen einer Virussuspension in den zygoten Perivitelline-Raum bereitzustellen. Weibliche Ratten, die mit einem fruchtbaren männlichen Stamm mit einer anderen dominanten Fellfarbe gepaart werden, werden verwendet, um pseudoschwangere Pflegemütter zu erzeugen.

Generierung transgener Ratten mit einem Lentiviral Vector Ansatz

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is ...

Transgene Tiere sind für die moderne biomedizinische Forschung von grundlegender Bedeutung, da sie Studien über die Genfunktion in lebenden Organismen ermöglichen. In Tierstudien wurden verschiedene Methoden genetischer Veränderungen angewandt. Hier präsentieren wir eine weithin zugängliche und effektive Technik, die lentivirale Vektoren als Werkzeug für die transgene Aufnahme in das Genom eines Rattenembryons verwendet.Nach der verabreichung des menschlichen Choriongonadotropins paaren Sichte fünf Wochen alte Wistar-Frauenratten eins zu eins mit sexuell fruchtbaren drei bis zehn Monate alten Wistar-Männchen. Um acht bis zehn .m am nächsten Morgen die Weibchen auf das Vorhandensein eines Vaginalsteckers überprüfen und die Eileiter von den Weibchen mit einem Paarungsstecker spätestens 10 a.m ernten.in eine Sammelschale mit vorgewärmten M2-Medium. Wenn alle Eileiter gesammelt sind, übertragen Sie das Gewebe in eine 35-Millimeter-Schale mit vorgewärmten M2-Medium, ergänzt mit 0,5 Milligramm pro Milliliter Hyaluronidase aus Rinderhoden, und legen Sie die Schale unter ein Stereomikroskop. Verwenden Sie feine Zangen, um die Wände des Eileiters zu öffnen und drücken Sie die Ampulla, bis die Embryonen befreit sind.Um die Freisetzung der Embryonen aus den Cumuluszellen zu erleichtern, verwenden Sie eine Glastransferpipette, die mit einem mundbetätigten Saugrohr verbunden ist, um die Embryonen sanft nach oben und unten zu pipetten. Wenn alle Embryonen freigesetzt wurden, waschen Sie die Zellen ein paar Mal in frischem M2-Medium, um die Hyaluronidase und Zellablagerungen zu entfernen. Übertragen Sie die Embryonen in einzelne 50 Mikroliter Tropfen vorädierten M16-Mediums, das mit Mineralöl bedeckt ist, in einer 60-Millimeter-Schale.Dann legen Sie die Schale in einen befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator mit einer 5% Kohlendioxid-Atmosphäre bis zu ihrer Injektion. Für lentivirale Vektormikroinjektion unter der Zona pellucida der einzelligen Stadium Embryonen, verwenden Sie einen Pipettenabzieher, um Mikroinjektion Borosilikat Glaskapillaren mit einem Filament vorzubereiten. Führen Sie nach jedem Wechsel des Filaments oder einer neuen Glaskapillare einen Rampentest durch, um die optimalen Parameter festzulegen.Als nächstes verwenden Sie eine Mikroladerspitze, um etwa zwei Mikroliter frisch aufgetauter lentiviraler Lösung pro Mikroinjektionspipette unter eine biosicherheitslaminare Durchflusshaube zu laden. Fügen Sie einen 100-Mikroliter-Tropfen M2-Medium in die Mitte des Deckels von einer 60-Millimeter-Petrischale hinzu. Bedecken Sie das Medium mit Mineralöl und montieren Sie die Haltepipette und die virusgeladene Mikroinjektionskapillare auf einen Mikromanipulator.Legen Sie die Mikroinjektionsschale unter ein invertiertes Mikroskop und übertragen Sie 15 bis 20 einzellige Embryos in den M2-Tropfen in der Mikroinjektionsschale. Erfassen Sie einen Embryo mit der Haltepipette und verwenden Sie die 400-fache Vergrößerung und die Glaskapillare, um die lentivirale Lösung unter der Zona pellucida in den Perivitellineraum zu injizieren, der die Kapillare unter der Zona pellucida für einen Moment hält, nachdem das Virus geliefert wurde. Wenn alle Embryonen injiziert wurden, verwenden Sie eine feine Pipette, um die injizierten Zellen an die Kulturschale zurückzugeben und die Schale bis zu ihrer Implantation an den Zellkultur-Inkubator zurückzugeben.Um die Pflegemütter auf den Embryotransfer vorzubereiten, paaren Sie geschlechtsreife Sprague-Dawley-Weibchen mit vasectomisierten Männchen und überprüfen Sie die Weibchen am nächsten Morgen auf einen Vaginalstecker. Nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf Pedalreflexe bei den anästhesierten Weibchen mit einem lebensfähigen Stecker bestätigt haben, tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf und rasieren Sie das Fell von der Rückseite jedes Tieres. Legen Sie die erste Ratte in der anfälligen Position auf einer sauberen Oberfläche auf einem Heizkissen unter einem chirurgischen Mikroskop.Bedecken Sie die Ratte mit einem sterilen Vorhang mit einem kleinen Loch über den unteren Rücken geschnitten und machen Sie einen etwa zwei Zentimeter großen Hautschnitt parallel zur Lendenwirbelsäule. Verwenden Sie scharfe Schere, um einen Schnitt in der Bauchwand zu machen und verwenden Sie Zangen, um ein Eierstockfettpad zu greifen. Ziehen Sie den Eierstock und das Eileiter aus der Bauchhöhle auf ein Stück 0,9% Natriumchlorid getränkte Gaze.Laden Sie M2 Medium, drei Luftblasen und die Embryonen in eine Transferkapillare. Verwenden Sie Mikroscheren, um einen kleinen Schnitt in das Eileiter zwischen dem Infundibulum und Ampulla zu machen und legen Sie die Spitze der Transferpipette in den Schnitt. Vertreibt die Embryonen und Luftblasen vorsichtig in das Eileiter, und setzt dann die stumpfe Zange ein, um den Fortpflanzungstrakt wieder in die Bauchhöhle zu legen.Die Bauchwand mit polyglykolsäureabsorbierbaren Nähten bedecken und den Hautschnitt mit Wundklammern schließen und das Tier in einen sauberen Käfig auf eine wärmende Platte mit Überwachung bis zur vollen Resümee legen. Um potenzielle Partner zu vasectomisieren, nachdem sie die männliche Ratte wie gezeigt auf eine Operation vorbereitet haben, verwenden Sie 70% Ethanol und ein chirurgisches Peeling, um die Haut über den Hoden zu desinfizieren. Drücken Sie vorsichtig den Bauch, um die Hoden im Skrotalsack freizulegen und die Ratte mit einem sterilen Vorhang mit einem kleinen Loch über der operationsischen Stelle zu bedecken und verwenden Sie eine Skrotalschere, um einen 0,5-Zentimeter-Schnitt in der Mitte des Sacks zu machen.Schieben Sie den Hoden vorsichtig nach links und lokalisieren Sie die Vas enzwischen den Hoden und der Mittellinie als weißen Kanal mit einem einzigen Blutgefäß. Verwenden Sie die Zange des Uhrmachers, um die Vas deferens sanft aus dem Skrotalsack zu ziehen und das Gefäß mit Zangen zu halten, verwenden Sie eine feine Schere, um ein ein Zentimeter Fragment aus dem Kanal zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang für den zweiten Testis, wie gerade gezeigt, und schließen Sie die Haut mit polyglykolsäure resorbierbaren Nähten.Dann legen Sie die Ratte in einen sauberen Käfig auf einer wärmenden Platte mit Überwachung bis zur vollen Recumbency. In diesem repräsentativen Experiment, bei dem einzelne Embryonen mehrfach injiziert wurden, wurden acht Ratten aus Embryonen geboren, die zwei Mal injiziert wurden, von denen drei bestätigt wurden, um das Transgen zu tragen. Eine der Gründerinnen übertrug das Transgen nicht auf Nachkommen und drei Pflegeweibchen wurden für jedes Versuchsaufbau verwendet.Der gewählte Ansatz ermöglichte die Erzeugung stabiler transgener Rattenlinien, die das TDP-43-eGFP-Fusionsprotein unter der Kontrolle der neuronalen Synapse in einem Promotor im gesamten zentralnervösen System ausdrückten. Die Lentivirus-basierte Transgenese führte zu einer einzigen Kopie des Transgens, wie die quantitative PCR zeigt. Wenn diese Methode für andere lentivirale Vektoren verwendet wurde, wurde eine überlebenslange Rate von etwa 90% beobachtet.Der Anteil der Embryonen, die die pronuklearen Injektionen überlebten, war deutlich geringer. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass schwangere weibliche Ratten als Pflegemütter mit einer vergleichbaren Effizienz verwendet werden können. Insbesondere zeigten die numerischen Daten, die für einzelne Mikroinjektionsrunden analysiert wurden, dass die Wirksamkeit der Implantation direkt von der Anzahl der Injektionen in einen Embryo und indirekt von der Viruslast abhing.Der Einsatz von lentiviralen Vektoren garantiert die genomische Integration und Übertragung des Transgens und ermöglicht eine hohe Überlebensrate der mikromanipulierten Embryonen, selbst wenn mehrere subdermale Injektionen durchgeführt werden. Dieses Verfahren kann effektiv auf andere Arten angewendet werden und kann als Alternative für die konventionelle Transgenese betrachtet werden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

Ein Cre-Lox P Rekombination Ansatz für den Nachweis von Cell Fusion In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Forschung

Biotechnik

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Haut Tätowieren als einen neuartigen Ansatz für DNA Vaccine Lieferung

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Erzeugung von Scherhaft Karte Mit SynVivo Synthetische mikrovaskuläre Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Charakterisierung komplexer Systeme Mit dem Design of Experiments Ansatz: Transient Protein Expression in Tabak als Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Doppelemulsion Erstellung Mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS) Co-Axial Flow Fokus Geräte-

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Die Erzeugung von ESC-derived Maus Airway epithelialen Zellen unter Verwendung von Dezellularisierte Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: Eine starke, nicht-invasive Ansatz zur zellulären Energiestoffwechsel untersuchen

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

In Silico Modeling Method for Computational Aquatic Toxicology of Endocrine Disruptors: A Software-Based Approach Using QSAR Toolbox

Computational analyses of toxicological processes enables high-throughput screening of chemical substances and prediction of their endpoints in biological ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...