Name: generation of transgenic rats using a lentiviral vector approach
Uploaded: 2020-05-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach at JoVE.com

מחקר זה היה נתמך על ידי הפרויקט ANIMOD בתוך תוכנית צוות טק ליבה מתקן פלוס של הקרן למדע הפולני, ממומן על ידי האיחוד האירופי תחת הקרן האירופית לפיתוח האזורית למשרד שבוע.

ההפקה והיישום של וקטורים ויראליים היו בהתאם להנחיות ברמת בטיחות ברמה 2 ואושרה על-ידי משרד הסביבה הפולני. כל הליכי החיות הניסיוניים המתוארים להלן אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית. בעלי החיים שוכנו בכלובים מאווררים באופן אינדיבידואלי בטמפרטורה יציבה (21 – 23 ° c) ולחות (50 – 60%) עם גישה למים ומזו...

<ol>
	<li>Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+genomics+on+research+in+the+rat.">Impact of genomics on research in the rat.</a> Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).</li><li>Tarkowski, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+mouse+chimeras+developed+from+eggs+fused+in+vitro.">Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro.</a> National Cancer Institute Monographs. 11, 51-71 (1963).</li><li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei.">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li><li>Gill, T. J., Smith, G. J., Wissler, R. W., Kunz, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rat+as+an+Experimental+Animal.">The Rat as an Experimental Animal.</a> Science. 245 (4915), 269-276 (1989).</li><li>Aitman, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+prospects+in+rat+genetics:+a+community+view.">Progress and prospects in rat genetics: a community view.</a> Nature Genetics. 40 (5), 516-522 (2008).</li><li>Hammer, R. E., Maika, S. D., Richardson, J. A., Tang, J. P., Taurog, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+inflammatory+disease+in+transgenic+rats+expressing+HLA-B27+and+human+beta+2m:+an+animal+model+of+HLA-B27-associated+human+disorders.">Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders.</a> Cell. 63 (5), 1099-1112 (1990).</li><li>Mullins, J. J., Peters, J., Ganten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fulminant+hypertension+in+transgenic+rats+harbouring+the+mouse+Ren-2+gene.">Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene.</a> Nature. 344 (6266), 541-544 (1990).</li><li>Menoret, S., Remy, S., Usal, C., Tesson, L., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgenic+Rats+by+Microinjection+of+Short+DNA+Fragments.">Generation of Transgenic Rats by Microinjection of Short DNA Fragments.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 81-92 (2010).</li><li>Tesson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+modifications+of+the+rat+genome.">Transgenic modifications of the rat genome.</a> Transgenic Research. 14 (5), 531-546 (2005).</li><li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+rats:+Technical+aspects+and+models.">Transgenesis in rats: Technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li><li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors.">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+by+lentiviral+vectors:+lack+of+gene+silencing+in+mammalian+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos.">Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2140-2145 (2002).</li><li>Koza, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+TDP-43+depletion+affects+activity-dependent+plasticity.">Neuronal TDP-43 depletion affects activity-dependent plasticity.</a> Neurobiology of Disease. 130, 104499 (2019).</li><li>Scherr, M., Battmer, K., Blomer, U., Ganser, A., Grez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+lentiviral+vector+particle+numbers+by+real-time+PCR.">Quantitative determination of lentiviral vector particle numbers by real-time PCR.</a> Biotechniques. 31 (3), 520 (2001).</li><li>Canseco, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+efficiency+during+gestation+and+the+influence+of+co-transfer+of+non-manipulated+embryos+on+production+of+transgenic+mice.">Gene transfer efficiency during gestation and the influence of co-transfer of non-manipulated embryos on production of transgenic mice.</a> Transgenic Research. 3 (1), 20-25 (1994).</li><li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+rats:+technical+aspects+and+models.">Transgenesis in rats: technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li><li>Armstrong, D. T., Opavsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superovulation+of+immature+rats+by+continuous+infusion+of+follicle-stimulating+hormone.">Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone.</a> Biology of Reproduction. 39 (3), 511-518 (1988).</li><li>Popova, E., Krivokharchenko, A., Ganten, D., Bader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+PMSG-+and+FSH-induced+superovulation+for+the+generation+of+transgenic+rats.">Comparison between PMSG- and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats.</a> Molecular Reproduction and Development. 63 (2), 177-182 (2002).</li><li>Johnson, L. W., Moffatt, R. J., Bartol, F. F., Pinkert, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+embryo+transfer+protocols+for+mice.">Optimization of embryo transfer protocols for mice.</a> Theriogenology. 46 (7), 1267-1276 (1996).</li><li>van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirally+generated+eGFP-transgenic+rats+allow+efficient+cell+tracking+in+vivo.">Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo.</a> Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Lentiviral+Vectors+to+Obtain+Transgenic+Rats.">The Use of Lentiviral Vectors to Obtain Transgenic Rats.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 109-125 (2010).</li></ol>

ההתקדמות בטכנולוגיות הטרנסגניים הפכו דגמי מכרסמים כלי רב-ערך במחקר ביו-רפואי. הם מספקים את ההזדמנות ללמוד גנוטיפ-פנוטיפ יחסים ב vivo. כאן, אנו מציגים חלופה זמינה נרחב עבור הטרנסגנזה קונבנציונאלי על ידי באמצעות זריקות ברורות. השימוש של התמרה גנים לנטינגיזציה עוקפת את הצורך לדרוש הזרקות מיקר...

במשך שנים רבות, מכרסמים מעבדה, כגון חולדות ועכברים, נעשה שימוש כדי לעצב את התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים האנושיים. מחקר בעלי חיים הוביל לתגליות שאינן מהשגה בכל אמצעי אחר. בתחילה, מחקרים גנטיים התמקדו ניתוח של הפרעות התרחשות ספונטנית ופנוטיפים הנחשבים הדוק לחקות את המצב האנושי1. התפתחות שיטות גנטיות הנדסה אפשרה הקדמה או מחיקה של גנים ספציפיים כדי לקבל פנוטיפ הרצוי. לכן, הדור של בעלי חיים טרנסגניים מזוהה כטכניקה יסודית במחקר המודרני המאפשר מחקרים של תפקוד גנים באורגניזמים חיים.
טכנולוגיית החיות הטרנסגנית הפכה לאפשרית באמצעות שילוב של הישגים באמבריולוגיה ניסיוני ובביולוגיה מולקולרית. בשנות ה-60, הפולני embryologist א. טרקובסקי לפרסם את העבודה הראשונה על מניפולציה העובר העכבר בשלבים המוקדמים של פיתוח2. בנוסף, ביולוגים מולקולריים פיתחו טכניקות כדי ליצור וקטורים DNA (כלומר, נושאות) עבור הקדמה בין היתר של DNA זר לתוך הגנום של בעל החיים. וקטורים אלה מאפשרים את התפשטות הגנים הנבחרים ואת השינוי המתאים להם, בהתאם לסוג המחקר שנערך. המונח "חיה טרנסגניים" הוצג על ידי גורדון ורודל3.
המינים המקובלים הראשונים ששימשו לנוירוביולוגיה, פיזיולוגיה, פרמקולוגיה, טוקסיקולוגיה, ותחומים רבים אחרים של מדעים ביולוגיים ומדעי הרפואה היו החולדה הנורבגית, ראאוס נורבקוס4. עם זאת, בגלל הקושי לתמרן עוברי חולדה, עכבר הבית Mus מוסקולוס הפך להיות מינים דומיננטי בעלי חיים במחקר גנטי5. סיבה נוספת של העליונות של העכבר במחקר כזה היה הזמינות של הטכנולוגיה תא גזע מעובריים כדי ליצור חיות מהממת עבור מין זה. הטכניקה הנפוצה ביותר של טרנסגנזה (2 – 10% מהצאצאים הטרנסגניים ביחס לכל בעלי החיים הנולדים) היא המיקרו-הזרקה של שברי הדי. אנ. איי. ב-1990, גישה זו, שהוצגה לראשונה בעכברים, הותאמה לחולדות6,7. שינוי חולדה על ידי הזרקה ברורה מאופיין ביעילות נמוכה יותר8 לעומת עכברים, אשר קשורה בקפדנות לנוכחות של פלזמה אלסטי וממברנות9. למרות ההישרדות של העוברים לאחר מניפולציה היא 40-50% נמוך יותר בעכברים, טכניקה זו נחשבת תקן בדור של חולדות מהונדסים גנטית10. גישות חלופיות שיכולות להבטיח התאגדות העברה יעילה של טרנסגנים ושיעורי הישרדות גבוהים יותר של הזיטים מוזרק נחקרו.
דטרמיננטת המפתח של ביטוי הטרנסגנים יציב ושידור צאצאים הוא השילוב שלה לתוך הגנום התא המארח. לאנטי וירוסים (LVs) יש את התכונה הייחודית של להיות מסוגל להדביק את שני התאים חלוקה ושאינם מפרידים. השימוש שלהם ככלי לשילוב של גנים הטרוולוגיים לעוברים הוכחו להיות יעילים מאוד11, ואנשים הטרנסגניים מאופיינים ביטוי יציב של מקטע ה-DNA משולב. היעילות של וקטורים לונגיליים אושרה עבור השינוי הגנטי של עכברים12,13, חולדות12,14, ומינים אחרים11. בשיטה זו, ההשעיה LV מוזרק תחת הסונה ולוצידה של העובר בשלב של שתי שיטות. טכניקה זו מבטיחה ביסודו של 100% את ההישרדות של העוברים משום שהלמת אינו מושפע. הייצור של שתלים LV באיכות גבוהה ומרוכזים יחסית הם גורמים חיוניים. עם זאת, ריכוזים נמוכים יותר של השעיות LV ניתן להתגבר על ידי הזריקות חוזרות11, אשר מגדיל את כמות החלקיקים ויראלי על פני הביצה בעוד לא להשפיע על שילוב ממברנה. עוברים החשופים זריקות חוזרות לחלל perivitelline לפתח עוד, והצאצאים הטרנסגניים יכולים לשדר את הטרנסגנים דרך germline. היעילות של דור החולדה הטרנסגניים על ידי הטרנסגנזה של הנגיף יכולה להיות גבוהה כמו 80%12.
כאן, אנו מתארים את הייצור של HIV-1 נגזר רקומביננטי, וירוס שהיה פסבדו עם וירוס stomatitis vesicular (VSV) מעטפה G חלבון. השימוש של הדור השני מערכת אריזה VSV הסוג המדומה קובע את הנגועים הרחב של חלקיקים ויראלי ומאפשר ייצור של וקטורים יציבים מאוד כי ניתן להתרכז על ידי הקפאת המערכת הקריואופטית. לאחר אימות סיכוייו, הווקטורים מוכנים לשמש כרכב עבור המסירה טרנסגנטית ללבקן הזיטים חולדה וויסטאר. לאחר סדרת זריקות, העוברים יכולים להיות מתורבתים בן לילה ולהעביר בשלב שני-תאים לאמהות מאמצות. בשלב זה, ניתן לשקול אחת משתי גישות חלופיות. ההליך הסטנדרטי מנצל הנקבות pseudopregnant כנמעני העובר. עם זאת, כאשר שיעור ההריון נמוך לאחר ההזדווגות עם הזכרים עיקור העוברים יכולים להיות מושתל לתוך ההריון wistar/ספראג-דאולי (SD) נקבות כי הם הזדווג עם חולדות גברים פורה עם צבע פרווה כהה (למשל, בראון נורווגיה [BN] חולדות). הצבע של הפרווה מאפשר הבחנה של צאצאים מן ההריון הטבעי מן הצאצאים שמקורם העוברים מניפולציות הועברו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1208px;" width="1209">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">7500 Real Time PCR System</td>
			<td style="width:186px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:354px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Aerrane (isoflurane)</td>
			<td style="width:186px;">Baxter</td>
			<td style="width:354px;">FDG9623</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Atipam 5 mg/ml</td>
			<td>Eurovet Animal Health BV</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5-10 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15</td>
			<td style="width:186px;">Harvard Apparatus Limited</td>
			<td style="width:354px;">30-0039</td>
			<td style="width:172px;">injection capillary</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bupivacaine 25 mg/ml</td>
			<td>Advanz Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.25% in&#160; 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Butomidor 10 mg/ml (butorphanol&#160; tartrate)</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm</td>
			<td style="width:186px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:354px;">627160</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:496px;">CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm</td>
			<td style="width:186px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:354px;">628160</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">CellTram Oil</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">5176 000.025</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml</td>
			<td>cp-pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin&#160;</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>150 IU/ ml ml 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">D6048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">DNase, RNase-free</td>
			<td style="width:186px;">A&#38;A Biotechnology</td>
			<td style="width:354px;">1009-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES-005-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid)&#160;</td>
			<td style="width:186px;">ADDGENE</td>
			<td style="width:354px;">14888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">FemtoJet</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">4i /5252 000.013</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">F9665-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Folligon, Pregnant Mare&#8217;s Serum Gonadotropin&#160;</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>125 IU/ml in .9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEK 293T cells&#160;</td>
			<td style="width:186px;">ATCC</td>
			<td style="width:354px;">ATCC CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase from Bovine Testis&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272-30MG</td>
			<td>0.5 mg/ml in M2 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Inverted Microscope&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Zeiss</td>
			<td style="width:354px;">Axiovert 200</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine 100mg/ml</td>
			<td>Biowet Pulawy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Paraffin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M16 medium EmbryoMax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MR-016-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Magnesium Chloride 1M</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">63069-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Microforge</td>
			<td style="width:186px;">Narishige</td>
			<td style="width:354px;">MF-900</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl 0.9%</td>
			<td>POLPHARMA OTC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sterile, 5ml ampules</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Operation microscope&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Inami Ophthalmic Instruments</td>
			<td style="width:354px;">Deca-21</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors&#160; (delta R8.2 plasmid)</td>
			<td style="width:186px;">ADDGENE</td>
			<td style="width:354px;">12263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,),</td>
			<td style="width:186px;">Polysciences, Inc</td>
			<td style="width:354px;">23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Penicilin-streptomycin</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">806552-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Puller&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:354px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Reflex Clip Applier/Reflex Clips</td>
			<td style="width:186px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:354px;">500345/500346</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads</td>
			<td style="width:186px;">B.Braun Surgical</td>
			<td style="width:354px;">1048029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:186px;">Olympus</td>
			<td style="width:354px;">SZX16</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Sewing Thread</td>
			<td>B.Braun&#160;</td>
			<td>C1048040</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:186px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:354px;">4334973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tolfedine 4% (tolfenamic acid)</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">TransferMan NK2</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">N/A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Trypsin EDTA solution</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">T3924-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:186px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:354px;">Optima L-100 XP&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">VacuTip</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">5175108.000</td>
			<td style="width:172px;">holders capillary</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vita-POS</td>
			<td>Ursapharm</td>
			<td>N/A</td>
			<td>eye ointment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Warming Plate</td>
			<td style="width:186px;">Semic</td>
			<td style="width:354px;">N/A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Watchmaker Forceps</td>
			<td style="width:186px;">VWR</td>
			<td>470018-868</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of transgenic rats using a lentiviral vector approach

מודלים בעלי חיים טרנסגניים חשובים ביסודם למחקר ביו-רפואי מודרני. השילוב של גנים זרים לתוך העכבר מוקדם או עוברי חולדה הוא כלי רב-ערך עבור ניתוח תפקודי גנים אורגניזמים חיים. שיטת הטרנסגנזה הסטנדרטית מבוססת על מיקרוהזרקת דנ א שברי זר לתוך כמובן של מופרית. טכניקה זו משמשת רבות בעכברים אך נותרת בלתי יעילה יחסית ותובענית מבחינה טכנית במינים אחרים של בעלי חיים. הטרנסגנים ניתן גם להציג לתוך העוברים בשלב תא אחד דרך זיהום ויראלי, מתן חלופה יעילה הזריקות ברור סטנדרטי, במיוחד מינים או זנים עם מבנה העובר מאתגרת יותר. בגישה זו, השעיה המכילה וקטורים מוזרקים מוזרק לתוך החלל הפריבינאי של עובר חולדה מופרית, שהוא מבחינה טכנית פחות תובענית ויש לו שיעור הצלחה גבוה יותר. וקטורים לנטינגיליים הוכחו ביעילות לשלב את הטרנסגנים לתוך הגנום כדי לקבוע את הדור של קווים טרנסגניים יציבים. למרות מספר מגבלות (לדוגמה, ביובטיחות ברמה 2 דרישות, מגבלות גודל קטע ה-DNA), הטרנסלונגילוגיה היא שיטת טרנסגנזה מהירה ויעילה. בנוסף, שימוש בעכברושים נשיים שהוזדווג עם זן גברי פורה עם צבע פרווה דומיננטי שונה מוצג כחלופה להפקת אמהות pseudopregnant אומנה.

באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, וקטורים לונגיביים שנשאו את Syn-tdp-43-egfp המבנה יוצרו (הפיזי LV סיכוייו = 3.4 x 108/μl) ולאחר מכן יכול לשמש עבור העובר אחד-תאים בשלב השני זריקות subzonal. רק עוברים עם שני מראות. גלויים היו חשופים להליך מספר זריקות השעיות הנגיליות נקבעו כניסויים. יעילות השרשה גבוהה ומחס...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach at JoVE.com

Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach

מאמר זה שואפת לספק את המתודולוגיה עבור הטרנסגנזה לעדשה של עוברי החולדה באמצעות זריקות מרובות של השעיית וירוס לתוך החלל perivitelline הזיטה. חולדות נשים הזדווג עם זן גברי פורה עם צבע פרווה דומיננטי שונה משמש להפקת אמהות pseudopregnant אומנה.

הדור של חולדות הטרנסגניים באמצעות גישה וקטורית לנטינגיי

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is ...

בעלי חיים מהונדסים הם בסיסיים למחקר ביו-רפואי מודרני מכיוון שהם מאפשרים מחקרים על תפקוד גנים באורגניזמים חיים. שיטות שונות של שינויים גנטיים יישמו במחקרים בבעלי חיים. כאן, אנו מציגים טכניקה נגישה ויעילה נרחבת המשתמשת בווקטורים lentiviral ככלי לשילוב טרנסג'נדרים בגנום של עובר עכברוש.לאחר ניהול גונדוטרופין כוריוני אנושי, בן חמישה שבועות Wistar נקבה חולדות אחד לאחד עם פורה מינית שלושה עד 10 חודשים זכרים Wistar. בשעה 8 עד 10 בבוקר.m בבוקר שלמחרת, בדקו את הנקבות לנוכחות תקע וגינאלי וקצרו את האוביץ' מהנקבות עם תקע הזדווגות לא יאוחר מ-10 .m.לתוך צלחת איסוף המכילה מדיום M2 מחומם מראש. כאשר כל oviducts נאספו, להעביר את הרקמות לתוך צלחת 35 מילימטר המכיל בינוני M2 מחומם מראש בתוספת 0.5 מיליגרם למיליליטר של hyaluronidase מן האשכים bovine ולמקום את המנה תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמש מדפים עדין כדי לפתוח את הקירות של oviduct ולחץ על אמפולה עד העוברים משוחררים.כדי להקל על שחרור העוברים מתאים cumulus, להשתמש פיפטה העברת זכוכית מחובר צינור שאופה המופעל על ידי הפה בעדינות pipette העוברים למעלה ולמטה. כאשר כל העוברים שוחררו, לשטוף את התאים כמה פעמים במדיום M2 טרי כדי להסיר את hyaluronidase ופסולת הסלולר. מעבירים את העוברים ל-50 טיפות מיקרוליטר בודדות של מדיום M16 שקוויטר מראש מכוסה בשמן מינרלי בצלחת של 60 מילימטר.לאחר מכן מניחים את המנה לתוך חממה לחה 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספרה 5%פחמן דו חמצני עד הזריקה שלהם. עבור microinjection וקטור lentiviral תחת zona pellucida של עוברי שלב תא אחד, להשתמש מושך פיפטה להכין microinjection בורוזיליקט נימי זכוכית עם נימים. לאחר כל פעם נימי משתנה או נימי זכוכית חדש משמש, להפעיל בדיקת רמפה כדי להגדיר את הפרמטרים האופטימליים.לאחר מכן, השתמש בקצה microloader כדי לטעון כשני microliters של פתרון lentiviral מופשר טרי לכל פיפטה microinjection תחת מכסה המנוע זרימה למינארי biosafety. מוסיפים טיפה של 100 מיקרוליטר של מדיום M2 למרכז המכסה מצלחת פטרי 60 מ"מ. מכסים את המדיום בשמן מינרלי והר את פיפטה מחזיק ואת הנגיף טעון נימי microinjection על מיקרומניפולטור.מניחים את צלחת microinjection תחת מיקרוסקופ הפוך ולהעביר 15 עד 20 עוברי שלב תא אחד לתוך טיפת M2 בצלחת microinjection. ללכוד עובר אחד עם פיפטה מחזיק ולהשתמש הגדלה 400 פעמים נימי זכוכית להזריק את הפתרון lentiviral תחת zona pellucida לתוך החלל perivitelline מחזיק את נימי מתחת pellucida לרגע לאחר הנגיף נמסר. כאשר כל העוברים הוזרקו, השתמש פיפטה בסדר להחזיר את התאים מוזרק לצלחת התרבות ולהחזיר את המנה אינקובטור תרבות התא עד ההשתלה שלהם.כדי להכין את האמהות המאמצות להעברת העובר, חבר לנקבות ספראג-דוולי בוגרות מינית עם זכרים vasectomized ולבדוק את הנקבות למחרת בבוקר לתקע הנרתיק. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה אצל נקבות הרדמה עם תקע קיימא, להחיל משחה על העיניים של החיה לגלח את הפרווה מהגב של כל חיה. מניחים את החולדה הראשונה במצב נוטה על משטח נקי על כרית חימום תחת מיקרוסקופ כירורגי.מכסים את החולדה עם וילון סטרילי עם חור קטן לחתוך מעל הגב התחתון ולעשות חתך בעור כשני סנטימטרים במקביל לעמוד החוליות המותני. השתמש מספריים חדים כדי להפוך חתך בקיר הבטן ולהשתמש מטליות לתפוס כרית שומן השחלות. מוציאים את השחלה ואת ה-oviduct מתוך חלל הבטן אל חתיכת גזה ספוגה נתרן כלורי 0.9%.לטעון M2 בינוני, שלוש בועות אוויר, ואת העוברים לתוך נימי העברה. השתמש microscissors לעשות חתך קטן לתוך oviduct בין infundibulum ו ampulla ולהכניס את קצה פיפטה העברה לתוך החתך. לגרש בעדינות את העוברים ואת בועות האוויר לתוך oviduct, ולאחר מכן להשתמש מדפים קהה למקם את מערכת הרבייה בחזרה לתוך חלל הבטן.תפרו את דופן הבטן עם תפרים סופגים חומצה פוליגליקולית וסגרו את חתך העור עם פצעים והניחו את החיה בכלוב נקי על צלחת חימום עם ניטור עד לפציעה מלאה. כדי vasectomize בני זוג פוטנציאליים, לאחר הכנת החולדה הגברית לניתוח כפי שהוכח, להשתמש 70%אתנול קרצוף כירורגי כדי לחטא את העור על האשכים. בעדינות ללחוץ על הבטן כדי לחשוף את האשכים בעצם האשכים ולכסות את החולדה עם וילון סטרילי עם חור קטן מעל האתר הכירורגי ולהשתמש מספריים האשכים לעשות חתך 0.5 ס"מ באמצע הסק.בזהירות לדחוף את האשכים שמאלה ולאתר את vas deferens בין האשכים ואת קו האמצע כמו צינור לבן עם כלי דם אחד. השתמש במטליות של השען כדי למשוך בעדינות את האגרטלים ממק הדם ולהחזיק את הכלי במטליות, השתמש במספריים עדין כדי להסיר שבר של סנטימטר אחד מהצינור. חזור על ההליך עבור האשכים השני כפי שהוכח רק ולסגור את העור עם תפרים ספיגה חומצה פוליגליקולית.ואז למקם את החולדה לתוך כלוב נקי על צלחת התחממות עם ניטור עד חקירה מלאה. בניסוי מייצג זה, שבו הוזרקו עוברים בודדים מספר פעמים, שמונה חולדות נולדו עוברים שהוזרקו פעמיים, שלושה מהם אושרו לשאת את הטרנסג'ין. אחד המייסדים לא העביר את הטרנסג'ין וצאצאים ושלוש נקבות אומנה שימשו לכל מערך ניסיוני.הגישה שנבחרה אפשרה את הדור של קווי חולדה מהופנטים יציבים שהביעו את חלבון ההיתוך TDP-43-eGFP תחת שליטת הסינפסה העצבית במקדם אחד בכל מערכת העצבים המרכזית. טרנסג'נסיס מבוססת Lentivirus הביאה להכנסת עותק יחיד של הטרנסג'ין כפי שהוכח על ידי PCR כמותי. כאשר שיטה זו שימשה עבור וקטורים lentiviral אחרים, שיעור ההישרדות כ 90% נצפתה.אחוז העוברים ששרדו את זריקות הפרונוקלאר היה נמוך משמעותית. בסך הכל, תוצאות אלה מראות כי חולדות נקבה בהריון יכול לשמש אמהות אומנה עם יעילות דומה. יש לציין כי הנתונים המספריים שנותחו עבור סבבים בודדים של microinjection הצביעו על כך שהיעילות של ההשתלה תלויה ישירות במספר הזריקות לעובר אחד ותוך עקיפה בעומס הנגיפי.השימוש בווקטורים lentiviral מבטיח את האינטגרציה הגנומית והעברת הטרנסג'ין ומאפשר שיעור הישרדות גבוה של העוברים micromanipulated גם כאשר זריקות תת עוריות מרובות מבוצעות. הליך זה עשוי להיות מיושם ביעילות על מינים אחרים והוא יכול להיחשב חלופה transgenesis קונבנציונאלי.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

Cre-P לקס גישה רקומבינציה לצורך זיהוי של Fusion Cell In vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

עור קעקוע כגישה חדשה לאספקת חיסון ה-DNA

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

דור של שאר הידבקות מפה באמצעות רשתות כלי הדם סינטטיים SynVivo

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

אפיון של מערכות מורכבות באמצעות העיצוב של גישת ניסויים: ביטוי חלבון חלוף בטבק כמקרה מבחן

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

זוגי אמולסיה דור שימוש בהתקן זרימת פוקוס Co-הצירית polydimethylsiloxane (PDMS)

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

דור של אפיתל דרכי נשימת עכבר נגזרות ESC תאי שימוש decellularized פיגומי ריאות

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: גישה חזקה, לא פולשנית כדי לחקור את חילוף החומרים האנרגיה התאית

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

In Silico Modeling Method for Computational Aquatic Toxicology of Endocrine Disruptors: A Software-Based Approach Using QSAR Toolbox

בשיטת מידול סיליקו לרעלים מימיים לחישוביות חישובית של משבנים אנדוקרינים: גישה מבוססת תוכנה באמצעות ארגז הכלים QSAR

Computational analyses of toxicological processes enables high-throughput screening of chemical substances and prediction of their endpoints in biological ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

רקמת הנדסה לשיקום שחזור הוושט בחולדות

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...