Name: generation of transgenic rats using a lentiviral vector approach
Uploaded: 2020-05-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach at JoVE.com

この研究は、ポーランド科学財団のチームテックコアファシリティプラスプログラム内のANIMODプロジェクトによって支援され、欧州連合(EU)がWKに対して欧州地域開発基金の下で共同出資しました。

ウイルスベクターの生産と適用は、バイオセーフティレベル2ガイドラインに従い、ポーランド環境省によって承認されました。以下に記載されているすべての実験動物の手順は、地方倫理委員会によって承認されました。動物は安定した温度(21-23 °C)および湿気(50-60%)で個別に換気されたケージに収容された12時間/12時間の明暗サイクルの下で水と食べ物へのアドリビタムアクセスで。
<p c...

<ol>
	<li>Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+genomics+on+research+in+the+rat.">Impact of genomics on research in the rat.</a> Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).</li><li>Tarkowski, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+mouse+chimeras+developed+from+eggs+fused+in+vitro.">Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro.</a> National Cancer Institute Monographs. 11, 51-71 (1963).</li><li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei.">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li><li>Gill, T. J., Smith, G. J., Wissler, R. W., Kunz, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rat+as+an+Experimental+Animal.">The Rat as an Experimental Animal.</a> Science. 245 (4915), 269-276 (1989).</li><li>Aitman, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+prospects+in+rat+genetics:+a+community+view.">Progress and prospects in rat genetics: a community view.</a> Nature Genetics. 40 (5), 516-522 (2008).</li><li>Hammer, R. E., Maika, S. D., Richardson, J. A., Tang, J. P., Taurog, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+inflammatory+disease+in+transgenic+rats+expressing+HLA-B27+and+human+beta+2m:+an+animal+model+of+HLA-B27-associated+human+disorders.">Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders.</a> Cell. 63 (5), 1099-1112 (1990).</li><li>Mullins, J. J., Peters, J., Ganten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fulminant+hypertension+in+transgenic+rats+harbouring+the+mouse+Ren-2+gene.">Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene.</a> Nature. 344 (6266), 541-544 (1990).</li><li>Menoret, S., Remy, S., Usal, C., Tesson, L., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgenic+Rats+by+Microinjection+of+Short+DNA+Fragments.">Generation of Transgenic Rats by Microinjection of Short DNA Fragments.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 81-92 (2010).</li><li>Tesson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+modifications+of+the+rat+genome.">Transgenic modifications of the rat genome.</a> Transgenic Research. 14 (5), 531-546 (2005).</li><li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+rats:+Technical+aspects+and+models.">Transgenesis in rats: Technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li><li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors.">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+by+lentiviral+vectors:+lack+of+gene+silencing+in+mammalian+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos.">Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2140-2145 (2002).</li><li>Koza, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+TDP-43+depletion+affects+activity-dependent+plasticity.">Neuronal TDP-43 depletion affects activity-dependent plasticity.</a> Neurobiology of Disease. 130, 104499 (2019).</li><li>Scherr, M., Battmer, K., Blomer, U., Ganser, A., Grez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+lentiviral+vector+particle+numbers+by+real-time+PCR.">Quantitative determination of lentiviral vector particle numbers by real-time PCR.</a> Biotechniques. 31 (3), 520 (2001).</li><li>Canseco, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+efficiency+during+gestation+and+the+influence+of+co-transfer+of+non-manipulated+embryos+on+production+of+transgenic+mice.">Gene transfer efficiency during gestation and the influence of co-transfer of non-manipulated embryos on production of transgenic mice.</a> Transgenic Research. 3 (1), 20-25 (1994).</li><li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+rats:+technical+aspects+and+models.">Transgenesis in rats: technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li><li>Armstrong, D. T., Opavsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superovulation+of+immature+rats+by+continuous+infusion+of+follicle-stimulating+hormone.">Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone.</a> Biology of Reproduction. 39 (3), 511-518 (1988).</li><li>Popova, E., Krivokharchenko, A., Ganten, D., Bader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+PMSG-+and+FSH-induced+superovulation+for+the+generation+of+transgenic+rats.">Comparison between PMSG- and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats.</a> Molecular Reproduction and Development. 63 (2), 177-182 (2002).</li><li>Johnson, L. W., Moffatt, R. J., Bartol, F. F., Pinkert, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+embryo+transfer+protocols+for+mice.">Optimization of embryo transfer protocols for mice.</a> Theriogenology. 46 (7), 1267-1276 (1996).</li><li>van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirally+generated+eGFP-transgenic+rats+allow+efficient+cell+tracking+in+vivo.">Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo.</a> Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Lentiviral+Vectors+to+Obtain+Transgenic+Rats.">The Use of Lentiviral Vectors to Obtain Transgenic Rats.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 109-125 (2010).</li></ol>

トランスジェニック技術の進歩により、げっ歯類モデルは生物医学研究において非常に貴重なツールとなっています。彼らは、生体内で遺伝子型-表現型の関係を研究する機会を提供する。ここでは、プロ核注射による従来のトランスジェネシスに対して広く利用可能な代替手段を提示する。レンチウイルス遺伝子導入の使用は、ウイルスベクターを透明帯下に注入することができるので、要...

長年にわたり、ラットやマウスなどの実験室のげっ歯類は、ヒトの生理学的および病理学的状態をモデル化するために使用されてきました。動物研究は、他の手段では達成できなかった発見につながっています。当初、遺伝学的研究は、人間の状態を密接に模倣すると考えられている自然発生障害および型の解析に焦点を当てた1.遺伝子工学的手法の開発により、特定の遺伝子の導入または欠失が望ましい表現型を得ることが可能となった。そのため、遺伝子導入動物の生成は、生物における遺伝子機能の研究を可能にする現代研究の基礎技術として認識されている。
遺伝子導入動物技術は、実験発生学と分子生物学の成果を組み合わせて可能になりました。1960年代、ポーランドの発生学者A.K.タルコフスキは、開発初期段階におけるマウス胚操作に関する最初の研究を発表した。さらに、分子生物学者は、動物のゲノムに外来DNAを導入するためのDNAベクター(すなわち、キャリア)を生成する技術を開発した。これらのベクターは、選択した遺伝子の伝播と、実施される研究の種類に応じて、それらの適切な修飾を可能にします。「トランスジェニック動物」という用語は、ゴードンとラドル3によって導入された。
神経生物学、生理学、薬理学、毒物学、および生物医学と医学の他の多くの分野で使用された最初の広く受け入れられた種は、ノルウェーラット、ラトゥスノルベギカス4でした。しかし、ラット胚の操作が困難であるため、家のマウスの筋肉は、遺伝子研究5で支配的な動物種となっています。このような研究におけるマウスの優位性のもう一つの理由は、この種のノックアウト動物を生成する胚性幹細胞技術の利用可能性であった。トランスジェネシスの最も一般的に使用される技術(生まれたすべての動物に対するトランスジェニック子孫の2〜10%)は、受精卵母細胞の前核へのDNA断片のマイクロインジェクションです。1990年、マウスで初めて導入されたこのアプローチは、ラット66,77に適応した。前核注入によるラットトランスジェネシスは、マウスと比較して効率8が低いことを特徴とし、これは弾性プラズマおよび前核膜9の存在に厳密に関連している。操作後の胚の生存率はマウスより40〜50%低いが、この技術は遺伝子組み換えラット10の生成における標準と考えられている。効率的な導入遺伝子導入と注入された接合の高い生存率を保証できる代替アプローチが検討されている。
安定したトランスジーン発現と子孫への伝達の重要な決定要因は、宿主細胞ゲノムへの統合である。レンチウイルス(LV)は、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができるという特徴があります。異種遺伝子を胚に組み込むツールとしての使用は、高効率の11であることが判明し、トランスジェニック個体は、組み込まれたDNA断片の安定な発現によって特徴付けられる。レンチウイルスベクター,の有効性は、マウス12、13、ラット12、14、および他の,13種11の遺伝子改変について確認されている。14この方法では、LV懸濁液は、2つの前核の段階で胚の透明帯下に注入される。この技術は、オイレンマが影響を受けないので、本質的に胚の100%生存を保証する。高品質で比較的集中度の高いLVサスペンションの製造は、重要な要素です。しかし、LV懸濁液の低濃度は、繰り返し注射11によって克服することができ、これは膜の集積に影響を与えずに卵表面でのウイルス粒子の量を増加させる。膜領域への反復注射を受けた胚はさらに発達し、トランスジェニック子孫は生殖細胞系列を介してトランスジーンを伝達することができる。レンチウイルストランスジェネシスによるトランスジェニックラット生成の効率は、80%12までも12高くすることができる。
ここでは、HIV-1由来組換えレンチウイルスの産生について、胞性口内炎ウイルス(VSV)Gエンベロープタンパク質を擬似タイプ型にした。第二世代のパッケージングシステムVSV疑似型の使用は、ウイルス粒子の広い感染性を決定し、超遠心分離および凍結保存によって濃縮することができる非常に安定したベクターの生産を可能にする。滴下検証後、ベクターはアルビノウィスターラットジゴテへのトランスジーンデリバリーの車両として使用する準備ができています。一連の注射の後、胚は一晩培養され、母親を育てるために2細胞段階で移すことができる。この時点で、2 つの代替アプローチのいずれかを検討できます。標準的な手順は、胎児のレシピエントとして疑似妊娠女性を利用する。しかし、精管切除された男性と交配した後に妊娠率が低い場合、胚は、暗い毛皮の色を有する肥沃な雄ラット(例えば、ブラウンノルウェー[BN]ラット)と交配している妊娠中のウィスター/スプレイグ・ドーリー(SD)メスに移植することができる。毛皮の色は、移された操作された胚に由来する子孫から自然妊娠からの子孫の区別を可能にする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1208px;" width="1209">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">7500 Real Time PCR System</td>
			<td style="width:186px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:354px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Aerrane (isoflurane)</td>
			<td style="width:186px;">Baxter</td>
			<td style="width:354px;">FDG9623</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Atipam 5 mg/ml</td>
			<td>Eurovet Animal Health BV</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5-10 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15</td>
			<td style="width:186px;">Harvard Apparatus Limited</td>
			<td style="width:354px;">30-0039</td>
			<td style="width:172px;">injection capillary</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bupivacaine 25 mg/ml</td>
			<td>Advanz Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.25% in&#160; 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Butomidor 10 mg/ml (butorphanol&#160; tartrate)</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm</td>
			<td style="width:186px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:354px;">627160</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:496px;">CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm</td>
			<td style="width:186px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:354px;">628160</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">CellTram Oil</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">5176 000.025</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml</td>
			<td>cp-pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin&#160;</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>150 IU/ ml ml 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">D6048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">DNase, RNase-free</td>
			<td style="width:186px;">A&#38;A Biotechnology</td>
			<td style="width:354px;">1009-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES-005-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid)&#160;</td>
			<td style="width:186px;">ADDGENE</td>
			<td style="width:354px;">14888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">FemtoJet</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">4i /5252 000.013</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">F9665-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Folligon, Pregnant Mare&#8217;s Serum Gonadotropin&#160;</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>125 IU/ml in .9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEK 293T cells&#160;</td>
			<td style="width:186px;">ATCC</td>
			<td style="width:354px;">ATCC CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase from Bovine Testis&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272-30MG</td>
			<td>0.5 mg/ml in M2 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Inverted Microscope&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Zeiss</td>
			<td style="width:354px;">Axiovert 200</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine 100mg/ml</td>
			<td>Biowet Pulawy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Paraffin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M16 medium EmbryoMax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MR-016-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Magnesium Chloride 1M</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">63069-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Microforge</td>
			<td style="width:186px;">Narishige</td>
			<td style="width:354px;">MF-900</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl 0.9%</td>
			<td>POLPHARMA OTC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sterile, 5ml ampules</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Operation microscope&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Inami Ophthalmic Instruments</td>
			<td style="width:354px;">Deca-21</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors&#160; (delta R8.2 plasmid)</td>
			<td style="width:186px;">ADDGENE</td>
			<td style="width:354px;">12263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,),</td>
			<td style="width:186px;">Polysciences, Inc</td>
			<td style="width:354px;">23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Penicilin-streptomycin</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">806552-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Puller&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:354px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Reflex Clip Applier/Reflex Clips</td>
			<td style="width:186px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:354px;">500345/500346</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads</td>
			<td style="width:186px;">B.Braun Surgical</td>
			<td style="width:354px;">1048029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:186px;">Olympus</td>
			<td style="width:354px;">SZX16</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Sewing Thread</td>
			<td>B.Braun&#160;</td>
			<td>C1048040</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:186px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:354px;">4334973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tolfedine 4% (tolfenamic acid)</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">TransferMan NK2</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">N/A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Trypsin EDTA solution</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">T3924-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:186px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:354px;">Optima L-100 XP&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">VacuTip</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">5175108.000</td>
			<td style="width:172px;">holders capillary</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vita-POS</td>
			<td>Ursapharm</td>
			<td>N/A</td>
			<td>eye ointment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Warming Plate</td>
			<td style="width:186px;">Semic</td>
			<td style="width:354px;">N/A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Watchmaker Forceps</td>
			<td style="width:186px;">VWR</td>
			<td>470018-868</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of transgenic rats using a lentiviral vector approach

トランスジェニック動物モデルは、現代の生物医学研究にとって基本的に重要です。初期のマウスまたはラット胚への外来遺伝子の組み込みは、生物における遺伝子機能解析にとって非常に貴重なツールです。標準的な遺伝子導入法は、受精卵母細胞の原核に外来DNA断片をマイクロ注入することに基づいている。この技術はマウスで広く使用されていますが、他の動物種では比較的非効率的で技術的に要求が厳しいままです。この遺伝子は、レンチウイルス感染を介して1細胞段階の胚に導入することもできるので、特により困難な胚構造を有する種または株において、標準的な前核注射に代わる効果的な代替手段を提供する。このアプローチでは、レンチウイルスベクターを含む懸濁液を受精ラット胚の腹腔内空間に注入し、技術的に要求が少なく、成功率が高い。レンチウイルスベクターは、トランス遺伝子をゲノムに効率的に組み込み、安定なトランスジェニックラインの生成を決定することが示された。いくつかの制限(例えば、バイオセーフティレベル2要件、DNA断片サイズ制限)にもかかわらず、レンチウイルストランスジェネシスは迅速かつ効率的なトランスジェネシス法である。さらに、異なる支配的な毛皮の色を有する肥沃な男性株と交配される雌ラットを使用して、偽妊娠の里親を生成する代わりとして提示される。

本明細書に記載のプロトコルを用いて、Syn-TDP-43-eGFP構築物を運んだレンチウイルスベクターが産生され(物理LV力計=3.48x 10 8/μL)、次いで1細胞段胚下天注射に使用することができた。2つの目に見える前核を有する胚のみが処置に供された。ウイルス懸濁液の注射回数を実験的に決定した。高い移植効率とトランスジェニック子孫の同時欠如は、成功したトランスダクションのためのウ?...

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Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach

本稿は、ザイゴテのペリビテリン空間へのウイルス懸濁液の複数の注射を用いたラット胚におけるレンチウイルストランスジェネシスの方法論を提供することを目的とする。異なる支配的な毛皮の色を持つ肥沃な男性株と交配される雌ラットは、偽妊娠の里親を生成するために使用されます。

レンチウイルスベクターアプローチによるトランスジェニックラットの生成

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is ...

トランスジェニック動物は、生物の遺伝子機能の研究を可能にする現代の生物医学研究の基礎です。遺伝子改変の様々な方法が動物実験に適用されている。ここでは、ラット胚のゲノムへの導入遺伝子の組み込みのためのツールとしてレンチウイルスベクターを用いた広くアクセス可能で効果的な技術を提示する。ヒト絨毛性ゴナドトロピン投与後、5週齢のウィスター雌ラットを1対1で性的に肥沃な3〜10ヶ月のウィスターオスと交尾する。翌朝8時から10時.m時に、膣プラグの有無をメスに確認し、交配プラグを持つ女性から卵管を10.mまでに収穫する。あらかじめ温めたM2培地を含むコレクション皿に。すべての卵性が採取されたら、牛の精巣からヒアルロニダーゼのミリリットル当たり0.5ミリグラムを補った事前に温められたM2培地を含む35ミリメートル皿に組織を移し、皿を立体顕微鏡の下に置きます。卵管の壁を開くために細かい鉗子を使用し、胚が解放されるまでアンペアを押します。cumulus細胞からの胚の放出を容易にするために、口で作動する吸引器管に接続されたガラス伝達ピペットを使用して、胚を上下に穏やかにピペット化する。すべての胚が放出されたら、新鮮なM2培地で細胞を数回洗浄してヒアルロンジダーゼおよび細胞残骸を除去する。胚を60ミリメートル皿の鉱物油で覆われた平衡化されたM16培地の個々の50マイクロリットルの滴に移す。その後、注入するまで5%の二酸化炭素雰囲気を有する加湿37度摂氏インキュベーターに皿を入れます。一細胞段階胚の透明帯下でのレンチウイルスベクターマイクロインジェクションの場合、ピペットプーラーを使用してフィラメントを用いたマイクロインジェクションホウケイ酸ガラス毛細血管を調製する。フィラメントが変更されるか、新しいガラスキャピラリーが使用されるたびに、ランプテストを実行して最適なパラメータを設定します。次に、マイクロローダーチップを使用して、バイオセーフティ層流フードの下でマイクロインジェクションピペットあたり解凍したレンチウイルス溶液の約2マイクロリットルをロードします。60ミリメートルのペトリ皿から蓋の中央にM2培地の100マイクロリットルの滴を追加します。ミネラルオイルで媒体を覆い、保持ピペットとウイルスがマイクロマニピュレータにマイクロインジェクション毛細管をロードして取り付けます。マイクロインジェクション皿を逆顕微鏡の下に置き、15〜20個の1細胞段階胚をマイクロインジェクション皿のM2ドロップに移します。保持ピペットで1つの胚を捕獲し、400倍の倍率とガラス毛細管を使用して、ウイルスが送達された後、一瞬、ソナ透明体の下の毛細管を保持する腹腔内空間に透明帯下のレンチウイルス溶液を注入する。すべての胚が注入されたら、細かいピペットを使用して注入された細胞を培養皿に戻し、その注入まで培養インキュベーターに皿を戻します。胚移植のために里親を準備するために、精管切除された男性と性的に成熟したスプレイグ・ドーリーの女性を仲間にし、翌朝女性に膣プラグをチェックする。実行可能なプラグを持つ麻酔をかけた雌のペダル反射への応答の欠如を確認した後、動物の目に軟膏を適用し、各動物の後ろから毛皮を剃る。手術用顕微鏡下の加熱パッドのきれいな表面に、最初のラットを起こしやすい位置に置きます。下背部に小さな穴を開けて無菌ドレープでラットを覆い、腰椎柱に平行に約2センチメートルの皮膚切開を行います。鋭利なはさみを使用して腹壁に切り傷を付け、鉗子を使用して卵巣脂肪パッドをつかむ。腹腔から卵巣と卵管を0.9%塩化ナトリウム浸しガーゼの一部に引き出します。M2培地、空気の3つの気泡、および胚を転写毛細管にロードする。マイクロシザーを使用して、インファンディブラムとアンプラの間の卵管に小さな切開を行い、切開管に移管ピペットの先端を挿入します。胚と気泡を卵管に静かに排出し、鈍い鉗子を使用して生殖管を腹腔に戻します。腹壁をポリグリコール酸吸収性縫合糸で縫合し、創傷クリップで皮膚切開を閉じ、動物を完全な再発まで監視する温暖化プレートのきれいなケージに入れます。潜在的な仲間を精管切除するには、実証されているように手術のために雄のラットを準備した後、70%エタノールと外科スクラブを使用して精巣の上に皮膚を消毒する。腹部を静かに押して陰嚢嚢の精巣を露出させ、ラットを手術部位の上に小さな穴で無菌ドレープで覆い、陰嚢はさみを使用して嚢の真ん中に0.5センチメートルの切開を行います。慎重に精巣を左に押し、精巣と正中線の間の精巣を単一の血管を持つ白い管として見つけます。時計職人の鉗子を使用して、陰嚢嚢からゆっくりと蒸気を引き出し、鉗子で容器を保持し、細かいはさみを使用してダクトから1センチメートルの断片を取り除きます。ちょうど実証したように2番目の精巣の手順を繰り返し、ポリグリコール酸吸収性縫合糸で皮膚を閉じます。その後、完全な再実行まで監視と温暖化プレート上のきれいなケージにラットを置きます。単一胚を複数回注入したこの代表的な実験では、2回注射された胚から8匹のラットが生まれ、そのうちの3匹が遺伝子導入を担うことが確認された。創設者の一人は、子孫にトランスジーンを転送しませんでしたし、3人の里親女性が各実験セットアップに使用されました。選択されたアプローチは、中枢神経系全体の1つのプロモーターにおけるニューロンシナプスの制御下でTDP-43-eGFP融合タンパク質を発現する安定したトランスジェニックラット株の生成を可能にした。レンチウイルス系トランスジェネシスは、定量PCRによって示されるように、トランスジーンの単一コピー挿入をもたらした。この方法を他のレンチウイルスベクターに使用した場合、約90%の生存率が観察された。前核注射を生き延びた胚の割合は有意に低かった。全体として、これらの結果は、妊娠中の女性ラットが同等の効率を持つ里親として使用できることを示唆している。特に、マイクロインジェクションの個々のラウンドについて分析された数値データは、移植の有効性が1つの胚への注射の数に直接依存し、間接的にウイルス負荷に依存することを示した。レンチウイルスベクターの使用は、遺伝子導入遺伝子のゲノム統合および伝達を保証し、複数の皮下注射が行われる場合でも、マイクロ操作胚の高い生存率を促進する。この手順は、他の種に効果的に適用され得るし、従来のトランスジェネシスの代替と考えることができる。

Research

JoVE Journal

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