Name: generation of transgenic rats using a lentiviral vector approach
Uploaded: 2020-05-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach at JoVE.com

이 연구는 폴란드 과학 재단의 팀 테크 코어 시설 플러스 프로그램 내 ANIMOD 프로젝트에 의해 지원되었으며, 유럽 지역 개발 기금에서 WK에 따라 유럽 연합 (EU)이 공동 으로 자금을 지원했습니다.

바이러스 벡터의 생산 및 적용은 생물 안전 성 수준 2 지침에 따라 폴란드 환경부의 승인을 받았습니다. 아래에 설명된 모든 실험 동물 절차는 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 동물은 안정된 온도(21-23°C)와 습도(50-60%)에서 개별적으로 통풍이 잘 되는 케이지에 보관되었습니다. 12 시간 / 12 h / 12 h 의 빛 / 어두운 주기에서 물과 음식에 대한 광고 리비텀 액세스.
1. 렌티 바?...

<ol>
	<li>Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+genomics+on+research+in+the+rat.">Impact of genomics on research in the rat.</a> Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).</li><li>Tarkowski, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+mouse+chimeras+developed+from+eggs+fused+in+vitro.">Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro.</a> National Cancer Institute Monographs. 11, 51-71 (1963).</li><li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei.">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li><li>Gill, T. J., Smith, G. J., Wissler, R. W., Kunz, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rat+as+an+Experimental+Animal.">The Rat as an Experimental Animal.</a> Science. 245 (4915), 269-276 (1989).</li><li>Aitman, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+prospects+in+rat+genetics:+a+community+view.">Progress and prospects in rat genetics: a community view.</a> Nature Genetics. 40 (5), 516-522 (2008).</li><li>Hammer, R. E., Maika, S. D., Richardson, J. A., Tang, J. P., Taurog, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+inflammatory+disease+in+transgenic+rats+expressing+HLA-B27+and+human+beta+2m:+an+animal+model+of+HLA-B27-associated+human+disorders.">Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders.</a> Cell. 63 (5), 1099-1112 (1990).</li><li>Mullins, J. J., Peters, J., Ganten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fulminant+hypertension+in+transgenic+rats+harbouring+the+mouse+Ren-2+gene.">Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene.</a> Nature. 344 (6266), 541-544 (1990).</li><li>Menoret, S., Remy, S., Usal, C., Tesson, L., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgenic+Rats+by+Microinjection+of+Short+DNA+Fragments.">Generation of Transgenic Rats by Microinjection of Short DNA Fragments.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 81-92 (2010).</li><li>Tesson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+modifications+of+the+rat+genome.">Transgenic modifications of the rat genome.</a> Transgenic Research. 14 (5), 531-546 (2005).</li><li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+rats:+Technical+aspects+and+models.">Transgenesis in rats: Technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li><li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors.">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+by+lentiviral+vectors:+lack+of+gene+silencing+in+mammalian+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos.">Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2140-2145 (2002).</li><li>Koza, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+TDP-43+depletion+affects+activity-dependent+plasticity.">Neuronal TDP-43 depletion affects activity-dependent plasticity.</a> Neurobiology of Disease. 130, 104499 (2019).</li><li>Scherr, M., Battmer, K., Blomer, U., Ganser, A., Grez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+lentiviral+vector+particle+numbers+by+real-time+PCR.">Quantitative determination of lentiviral vector particle numbers by real-time PCR.</a> Biotechniques. 31 (3), 520 (2001).</li><li>Canseco, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+efficiency+during+gestation+and+the+influence+of+co-transfer+of+non-manipulated+embryos+on+production+of+transgenic+mice.">Gene transfer efficiency during gestation and the influence of co-transfer of non-manipulated embryos on production of transgenic mice.</a> Transgenic Research. 3 (1), 20-25 (1994).</li><li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+rats:+technical+aspects+and+models.">Transgenesis in rats: technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superovulation+of+immature+rats+by+continuous+infusion+of+follicle-stimulating+hormone.">Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone.</a> Biology of Reproduction. 39 (3), 511-518 (1988).</li><li>Popova, E., Krivokharchenko, A., Ganten, D., Bader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+PMSG-+and+FSH-induced+superovulation+for+the+generation+of+transgenic+rats.">Comparison between PMSG- and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats.</a> Molecular Reproduction and Development. 63 (2), 177-182 (2002).</li><li>Johnson, L. W., Moffatt, R. J., Bartol, F. F., Pinkert, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+embryo+transfer+protocols+for+mice.">Optimization of embryo transfer protocols for mice.</a> Theriogenology. 46 (7), 1267-1276 (1996).</li><li>van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirally+generated+eGFP-transgenic+rats+allow+efficient+cell+tracking+in+vivo.">Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo.</a> Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Lentiviral+Vectors+to+Obtain+Transgenic+Rats.">The Use of Lentiviral Vectors to Obtain Transgenic Rats.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 109-125 (2010).</li></ol>

형질전환 기술의 발전으로 설치류 모델은 생물 의학 연구에서 귀중한 도구로 만들었습니다. 그(것)들은 생체 내에서 유전자형 표현형 관계를 공부하는 기회를 제공합니다. 여기서, 우리는 핵 주사에 의한 종래의 종래의 기진에 대해 널리 이용 가능한 대안을 제시한다. 렌티 바이러스 유전자 전달의 사용은 바이러스 벡터가 조나 pellucida의 밑에 주입될 수 있기 때문에 까다로운 미세 주입을 위한 필...

몇 년 동안, 실험실 설치류, 쥐와 쥐 등, 인간의 생리 및 병 적 조건을 모델링 하는 데 사용 되었습니다. 동물 연구는 다른 방법으로 는 달성 할 수없는 발견으로 이어졌다. 처음에, 유전 학문은 인간 상태를 밀접하게 모방하기 위하여 여겨지는 자발적으로 생기는 무질서 및 표현형의 분석에 집중했습니다1. 유전 공학 방법의 발달은 특정 유전자의 소개 또는 삭제가 원하는 표현형을 얻기 위하여 허용했습니다. 따라서, 형질전환 동물의 생성은 살아있는 유기체에 있는 유전자 기능의 연구를 허용하는 현대 연구에서 근본적인 기술로 인식되고 있습니다.
형질전환 동물 기술은 실험적인 발생학과 분자 생물학에 있는 성과의 조합을 통해 가능하게 되었습니다. 1960년대에 폴란드의 배아학자 A. K. Tarkowski는 발달2의초기 단계에서 마우스 배아 조작에 대한 첫 번째 작업을 발표했습니다. 추가적으로, 분자 생물학자는 동물의 게놈으로 외국 DNA의 interalia 소개를 위한 DNA 벡터 (즉, 운반대)를 생성하는 기술을 개발했습니다. 이들 벡터는 수행되는 연구의 유형에 따라 선택된 유전자의 전파 및 이들의 적절한 변형을 허용한다. 용어 "형질 전환 동물"고든과 러들 에 의해 도입되었다3.
신경생물학, 생리학, 약리학, 독성학 및 생물 의학의 많은 다른 분야에서 사용된 첫번째 널리 받아들여진 종은 노르웨이 쥐, Rattus norvegicus4이었습니다. 그러나, 쥐 배아 조작의 어려움 때문에, 하우스 마우스 근육은 유전 연구에서 지배적 인 동물 종되고있다5. 이러한 연구에서 마우스의 우위를 지키기 위한 또 다른 이유는 이 종에 대한 녹아웃 동물을 생성하는 배아 줄기 세포 기술의 가용성이었다. 형질 전환의 가장 일반적으로 사용되는 기술 (모든 태어난 동물에 비해 형질 전환 자손의 2-10 %)은 수정 된 난모 세포의 pronucleus로 DNA 조각의 미세 주입입니다. 1990년에, 마우스에서 처음 소개된 이 접근은, 쥐6,,7를위해 적응되었습니다. 쥐의 투과성 은 탄성 플라즈마 및 프로핵막의 존재와 엄격하게 관련이 있는 마우스에 비해 낮은 효율8을 특징으로한다(9) 조작 후 배아의 생존율은 마우스보다 40-50% 낮지만, 이 기술은 유전자 변형 쥐10의생성에서 표준으로 간주된다. 주입된 zygotes의 능률적인 이식 유전자 통합 및 더 높은 생존율을 보장할 수 있는 대안적인 접근은 조사되었습니다.
자손에게 안정된 이식 유전자 발현 및 전달의 주요 결정요인은 숙주 세포 게놈으로의 통합이다. 렌티바이러스(LV)는 분할 세포와 비분할 세포를 모두 감염시킬 수 있는 독특한 특징을 가지고 있습니다. 이종 유전자를 배아에 통합하기 위한 도구로 사용하는 것은 매우 효율적인것으로 입증되었으며,형질전환 개인은 통합된 DNA 단편의 안정적인 발현을 특징으로 한다. 렌티바이러스 벡터의 효능은 마우스12,13,쥐12,,14,및 기타 종11의유전자 변형에 대해 확인되었다., 이 방법에서, LV 현탁액은 2개의 전구핵의 단계에서 배아의 조나 펠루시다 아래에 주입된다. 이 기술은 oolemma가 영향을 받지 않는 남아 있기 때문에 본질적으로 배아의 100% 생존을 보장합니다. 고품질 및 상대적으로 고농축 LV 서스펜션의 생산은 중요한 요소입니다. 그러나, LV 현탁액의 낮은 농도는반복주사(11)에의해 극복될 수 있으며, 이는 막 통합에 영향을 미치지 않는 동안 계란 표면에서 바이러스 입자의 양을 증가시킨다. 연막선 공간으로 반복 주사를 행하는 배아는 더 발전하고, 형질전환 자손은 생식선을 통해 이식유전자를 전달할 수 있다. 렌티바이러스 트랜스제네틱에 의한 형질전환 쥐 생성의 효율은 80%12로높을 수 있다.
여기에서, 우리는 VEIDStomatitis 바이러스 (VSV) G 봉투 단백질로 가성형이 된 HIV-1 유래 재조합 렌티바이러스의 생산을 기술한다. 2 세대 포장 시스템 VSV 의사 유형의 사용은 바이러스 입자의 광범위한 감염성을 결정하고 초원심분리 및 냉동 보존에 의해 집중 될 수있는 매우 안정적인 벡터의 생산을 허용합니다. 역가 검증 후, 벡터는 알비노 위스타 래트 접합체로의 트랜스유전자 전달을 위한 비차량으로서 사용될 준비가 되어 있다. 일련의 주사 후, 배아는 하룻밤 배양하고 어머니를 육성하기 위해 2 세포 단계에서 옮길 수 있습니다. 이 시점에서 두 가지 대체 방법 중 하나를 고려할 수 있습니다. 표준 절차는 태아 수령인으로 의사 임신 여성을 이용합니다. 그러나, vasectomized 수컷과 교배 후에 임신 비율이 낮을 때, 태아는 어두운 모피 색깔을 가진 비옥한 수컷 쥐와 교배되는 임신 한 Wistar/Sprague-Dawley (SD) 암컷으로 이식될 수 있습니다 (예를 들면, 갈색 노르웨이 [BN] 쥐). 모피의 색상은 옮겨진 조작 된 배아에서 유래 한 자손에서 자연 임신에서 자손을 구별 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1208px;" width="1209">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">7500 Real Time PCR System</td>
			<td style="width:186px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:354px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Aerrane (isoflurane)</td>
			<td style="width:186px;">Baxter</td>
			<td style="width:354px;">FDG9623</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Atipam 5 mg/ml</td>
			<td>Eurovet Animal Health BV</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5-10 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15</td>
			<td style="width:186px;">Harvard Apparatus Limited</td>
			<td style="width:354px;">30-0039</td>
			<td style="width:172px;">injection capillary</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bupivacaine 25 mg/ml</td>
			<td>Advanz Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.25% in&#160; 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Butomidor 10 mg/ml (butorphanol&#160; tartrate)</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm</td>
			<td style="width:186px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:354px;">627160</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:496px;">CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm</td>
			<td style="width:186px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:354px;">628160</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">CellTram Oil</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">5176 000.025</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml</td>
			<td>cp-pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin&#160;</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>150 IU/ ml ml 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">D6048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">DNase, RNase-free</td>
			<td style="width:186px;">A&#38;A Biotechnology</td>
			<td style="width:354px;">1009-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES-005-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid)&#160;</td>
			<td style="width:186px;">ADDGENE</td>
			<td style="width:354px;">14888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">FemtoJet</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">4i /5252 000.013</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">F9665-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Folligon, Pregnant Mare&#8217;s Serum Gonadotropin&#160;</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>125 IU/ml in .9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEK 293T cells&#160;</td>
			<td style="width:186px;">ATCC</td>
			<td style="width:354px;">ATCC CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase from Bovine Testis&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272-30MG</td>
			<td>0.5 mg/ml in M2 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Inverted Microscope&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Zeiss</td>
			<td style="width:354px;">Axiovert 200</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine 100mg/ml</td>
			<td>Biowet Pulawy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Paraffin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M16 medium EmbryoMax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MR-016-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Magnesium Chloride 1M</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">63069-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Microforge</td>
			<td style="width:186px;">Narishige</td>
			<td style="width:354px;">MF-900</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl 0.9%</td>
			<td>POLPHARMA OTC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sterile, 5ml ampules</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Operation microscope&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Inami Ophthalmic Instruments</td>
			<td style="width:354px;">Deca-21</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors&#160; (delta R8.2 plasmid)</td>
			<td style="width:186px;">ADDGENE</td>
			<td style="width:354px;">12263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,),</td>
			<td style="width:186px;">Polysciences, Inc</td>
			<td style="width:354px;">23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Penicilin-streptomycin</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">806552-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Puller&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:354px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Reflex Clip Applier/Reflex Clips</td>
			<td style="width:186px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:354px;">500345/500346</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads</td>
			<td style="width:186px;">B.Braun Surgical</td>
			<td style="width:354px;">1048029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:186px;">Olympus</td>
			<td style="width:354px;">SZX16</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Sewing Thread</td>
			<td>B.Braun&#160;</td>
			<td>C1048040</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:186px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:354px;">4334973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tolfedine 4% (tolfenamic acid)</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">TransferMan NK2</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">N/A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Trypsin EDTA solution</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">T3924-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:186px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:354px;">Optima L-100 XP&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">VacuTip</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">5175108.000</td>
			<td style="width:172px;">holders capillary</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vita-POS</td>
			<td>Ursapharm</td>
			<td>N/A</td>
			<td>eye ointment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Warming Plate</td>
			<td style="width:186px;">Semic</td>
			<td style="width:354px;">N/A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Watchmaker Forceps</td>
			<td style="width:186px;">VWR</td>
			<td>470018-868</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of transgenic rats using a lentiviral vector approach

형질전환 동물 모델은 현대 생물 의학 연구에 근본적으로 중요합니다. 초기 마우스 또는 쥐 배아에 외국 유전자의 통합은 살아있는 유기체에 있는 유전자 기능 분석을 위한 귀중한 공구입니다. 표준 트랜스제네시스 방법은 수정된 난모세포의 프로핵으로 외래 DNA 단편을 미세 주입하는 것을 기반으로 합니다. 이 기술은 마우스에서 널리 사용되지만 다른 동물 종에서 상대적으로 비효율적이고 기술적으로 요구되는 상태로 남아 있습니다. 이식 유전자는 또한 lentiviral 감염을 통해 1 세포 단계 태아로 소개될 수 있습니다, 표준 pronuclear 주입에 효과적인 대안을 제공하, 특히 더 도전적인 배아 구조물을 가진 종 또는 긴장에서. 이 접근법에서, 렌티바이러스 벡터를 포함하는 현탁액은 기술적으로 덜 까다롭고 더 높은 성공률을 가지고 있는 수정된 쥐 배아의 perivitelline 공간으로 주입된다. 렌티바이러스 벡터는 안정적인 형질전환 라인의 생성을 결정하기 위해 게놈 내로 이식유전자를 효율적으로 통합하는 것으로 나타났다. 몇 가지 제한에도 불구하고 (예를 들어, 생물 안전성 수준 2 요구 사항, DNA 단편 크기 제한), 렌티바이러스 트랜스제네시스는 신속하고 효율적인 트랜스제네시스 방법이다. 추가적으로, 다른 지배적인 모피 색깔을 가진 비옥한 남성 긴장과 결합되는 암컷 쥐를 사용하여 의사 임신 수양 어머니를 생성하는 대안으로 제출됩니다.

본 원에 기재된 프로토콜을 사용하여, Syn-TDP-43-eGFP 구제를 운반한 렌티바이러스 벡터를 생산하였다(물리적 LV 이터 = 3.4 x 10 8/μL) 이어서 1단계 배아 서브구역 주사에 사용될 수 있었다.8 두 개의 눈에 보이는 전핵구를 가진 배아만 시술을 받았다. 바이러스 현탁액의 주사 수는 실험적으로 결정되었다. 높은 이식 효율과 형질전환 자손의 동시 부족은 성공적인 형질 전환에 대한 바이러스 입?...

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Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach

이 문서는 접합체 perivitelline 공간으로 바이러스 현탁액의 다중 주사를 사용하여 쥐 배아에 있는 lentiviral transgenesis를 위한 방법론을 제공하는 것을 작정입니다. 다른 지배적 인 모피 색상과 비옥한 남성 균주와 교교 여성 쥐는 의사 임신 수양 어머니를 생성하는 데 사용됩니다.

렌티바이러스 벡터 접근법을 이용한 형질전환 쥐 생성

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is ...

트랜스제닉 동물은 살아있는 유기체에서 유전자 기능의 연구를 허용하기 때문에 현대 생물 의학 연구의 기본입니다. 동물 연구에서 다양한 유전자 변형 방법이 적용되었습니다. 여기서, 우리는 쥐 배아의 게놈으로 유전자 통합을 위한 공구로 렌즈티바이러스 벡터를 사용하는 널리 접근가능하고 효과적인 기술을 제시합니다.인간의 융냉성 생식선 호르몬 관리 후, 5 주 된 Wistar 여성 쥐 1 대 1을 성적으로 비옥한 3 ~10 개월 된 Wistar 남성으로 짝짓기. 8~10a.m. 다음날 아침, 암컷에게 질 플러그의 존재를 확인하고 10 a.m 이상짝 짓기 플러그를 가진 암컷에게서 oviducts를 수확하십시오.미리 데워진 M2 배지가 포함된 컬렉션 접시에 넣습니다. 모든 난소가 수집되면, 전워진 M2 배지를 함유한 35mm 접시에 소변 고환에서 히알루로니다아제 밀리리터당 0.5밀리그램으로 보충하여 스테레오 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 미세 한 집게를 사용하여 배반의 벽을 열고 배아가 풀려날 때까지 암풀라를 누릅니다.적혈구로부터 배아의 방출을 용이하게하기 위해, 입으로 작동하는 아스피러 튜브에 연결된 유리 이송 파이펫을 사용하여 배아를 위아래로 부드럽게 피펫하십시오. 모든 배아가 방출되면, 히알루로니다제와 세포 이물질을 제거하기 위해 신선한 M2 배지에서 세포를 몇 번 세척한다. 60mm 접시에 미네랄 오일로 덮여 미리 평형 M16 매체의 개별 50 마이크로 리터 방울로 배아를 전송.그런 다음 접시를 주입 할 때까지 5 %의 이산화탄소 대기와 가습 된 섭씨 37도 인큐베이터에 넣습니다. 1세포 단계 배아의 조나 펠루시다 하에서 렌티바이러스 벡터 미세 주입의 경우 파이펫 풀러를 사용하여 필라멘트가 있는 미세 주입 보로실리케이트 유리 모세혈관을 준비합니다. 필라멘트가 변경되었거나 새 유리 모세관을 사용할 때마다 램프 테스트를 실행하여 최적의 매개 변수를 설정합니다.다음으로, 마이크로로더 팁을 사용하여 생물 안전 라미나르 유동 후드 아래에 미세 주입 파이펫 당 약 2 개의 새로 해동 된 렌즈티바이러스 용액을 적재하십시오. 60mm 페트리 접시에서 뚜껑 중앙에 100 마이크로리터 드롭을 추가합니다. 미네랄 오일로 매체를 덮고 지주 파이펫과 마이크로 조작기에 미세 주입 모세관을 탑재하십시오.마이크로 주입 접시를 반전 된 현미경 아래에 놓고 15 ~ 20 개의 1 세포 단계 배아를 미세 주입 접시의 M2 드롭으로 옮기. 포획 파이펫으로 하나의 배아를 캡처하고 400배감과 유리 모세관을 사용하여 조나 펠루시다 하에서 렌티바이러스 용액을 주사하여 바이러스가 전달된 후 잠시 동안 조나 펠루시다 아래에 모세혈관을 들고 있는 인식 공간에 주입한다. 모든 배아가 주입되었을 때, 주입된 세포를 배양 접시에 반환하고 이식될 때까지 세포 배양 배양 인큐베이터로 접시를 되돌려 주세요.배아 전이를 위해 수양 모를 준비하기 위해, 혈관질이 있는 남성과 성적으로 성숙한 스프라그-Dawley 암컷을 짝짓기하고 다음 아침 에 암컷에게 질 플러그를 확인하십시오. 실행 가능한 플러그를 가진 마취 된 여성의 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 동물의 눈에 연고를 적용하고 각 동물의 뒷면에서 모피를 면도. 수술 현미경의 밑에 가열 패드에 깨끗한 표면에 있는 경향이 있는 위치에 첫번째 쥐를 놓습니다.쥐를 허리에 잘라 작은 구멍으로 멸균 커튼으로 덮고 요추 척추 기둥과 평행한 약 2 센티미터 피부 절개를합니다. 날카로운 가위를 사용하여 복벽에 자르고 집게를 사용하여 난소 지방 패드를 잡습니다. 난소와 배란을 복강에서 꺼내서 0.9%의 염화나트륨에 담근 거즈를 넣습니다.M2 배지, 공기 의 세 거품 및 배아를 이송 모세관으로 로드합니다. 미수부를 사용하여 인펀디불룸과 암풀라 사이의 oviduct에 작은 절개를 하고 이송 파이펫의 끝을 절개에 삽입합니다. 배아와 기포를 oviduct로 부드럽게 추방한 다음 무딘 집게를 사용하여 생식 기관을 복강으로 다시 배치합니다.폴리 글리콜산 흡수 봉합사복으로 복벽을 봉합하고 상처 클립으로 피부 절개를 닫고 동물이 완전한 재조정이 끝날 때까지 모니터링하여 따뜻한 접시에 깨끗한 케이지에 놓습니다. 잠재적 인 동료를 혈관질, 입증 된 대로 수술을 위해 남성 쥐를 준비 한 후, 70 %에탄올과 고환을 통해 피부를 소독하는 수술 스크럽을 사용합니다. 복부를 부드럽게 눌러 음낭낭의 고환을 노출시키고 수술 부위에 작은 구멍이있는 멸균 드레이프로 쥐를 덮고 음낭 중간에 0.5 센티미터 절개를 만듭니다.조심스럽게 왼쪽으로 고환을 밀어 하나의 혈관과 흰색 덕트로 고환과 중간선 사이의 vas deferens를 찾습니다. 워치메이커의 집게를 사용하여 음로 낭에서 꽃병을 부드럽게 당기고 배를 집게로 잡고 미세 가위를 사용하여 덕트에서 1센티미터 조각을 제거합니다. 단지 입증된 대로 두 번째 고환에 대한 절차를 반복하고 폴리 글리콜산 흡수 봉합사로 피부를 닫습니다.그런 다음 쥐를 완전한 재조정이 될 때까지 모니터링하여 온난화 접시에 깨끗한 케이지에 넣습니다. 단일 배아를 여러 번 주입한 이 대표적인 실험에서는 8마리의 쥐가 두 번 주사된 배아로부터 태어났으며, 그 중 3마리는 트랜스진을 운반하는 것으로 확인되었다. 창립자 중 한 명은 자손에게 트랜스진을 옮기지 않았고 각 실험 용 설정에 3 명의 위탁 여성이 사용되었습니다.선택된 접근법은 중추 신경계 전반에 걸쳐 하나의 프로모터에서 신경 시냅스의 통제 하에 TDP-43-eGFP 융합 단백질을 발현하는 안정적인 형질전환 쥐 라인의 생성을 허용했다. 렌티바이러스 계의 전염은 정량적 PCR에 의해 입증된 바와 같이 트랜스진의 단일 카피 삽입을 초래했다. 이 방법이 다른 렌티바이러스 벡터에 사용될 때, 약 90%의 생존율이 관찰되었다.비핵화 주사에서 살아남은 배아의 비율은 현저히 낮았다. 전반적으로, 이 결과는 임신한 여성 쥐가 비교 가능한 효율성을 가진 수양 어머니로 사용될 수 있다는 것을 건의합니다. 특히, 미세 주입의 개별 라운드를 위해 분석된 수치 데이터는 이식의 효과가 1개의 태아로 의한 주사 수에 직접적으로 의존하고 바이러스 부하에 간접적으로 의존한다는 것을 표시했습니다.렌티바이러스 벡터의 사용은 트랜스진의 게놈 통합 및 전송을 보장하고 다중 피하 주사가 수행되는 경우에도 미세 조작 된 배아의 높은 생존율을 용이하게한다. 이 절차는 다른 종에 효과적으로 적용될 수 있고 전통적인 전염을 위한 대안으로 간주될 수 있습니다.

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