Name: generation of transgenic rats using a lentiviral vector approach
Uploaded: 2020-05-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach at JoVE.com

Este estudo foi apoiado pelo projeto ANIMOD dentro do programa Team Tech Core Facility Plus da Fundação para a Ciência Polonesa, co-financiado pela União Europeia no âmbito do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional para a WK.

A produção e aplicação de vetores virais estava de acordo com as diretrizes do Nível 2 de Biossegurança e foi aprovada pelo Ministério do Meio Ambiente polonês. Todos os procedimentos experimentais em animais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê Deética Local. Os animais foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente a uma temperatura estável (21-23 °C) e umidade (50-60%) com acesso a ad libitum à água e alimentos sob um ciclo de luz/escuridão de 12 h/12 h.
1. Produ?...

<ol>
	<li>Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+genomics+on+research+in+the+rat.">Impact of genomics on research in the rat.</a> Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).</li><li>Tarkowski, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+mouse+chimeras+developed+from+eggs+fused+in+vitro.">Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro.</a> National Cancer Institute Monographs. 11, 51-71 (1963).</li><li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei.">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li><li>Gill, T. J., Smith, G. J., Wissler, R. W., Kunz, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rat+as+an+Experimental+Animal.">The Rat as an Experimental Animal.</a> Science. 245 (4915), 269-276 (1989).</li><li>Aitman, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+prospects+in+rat+genetics:+a+community+view.">Progress and prospects in rat genetics: a community view.</a> Nature Genetics. 40 (5), 516-522 (2008).</li><li>Hammer, R. E., Maika, S. D., Richardson, J. A., Tang, J. P., Taurog, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+inflammatory+disease+in+transgenic+rats+expressing+HLA-B27+and+human+beta+2m:+an+animal+model+of+HLA-B27-associated+human+disorders.">Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders.</a> Cell. 63 (5), 1099-1112 (1990).</li><li>Mullins, J. J., Peters, J., Ganten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fulminant+hypertension+in+transgenic+rats+harbouring+the+mouse+Ren-2+gene.">Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene.</a> Nature. 344 (6266), 541-544 (1990).</li><li>Menoret, S., Remy, S., Usal, C., Tesson, L., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgenic+Rats+by+Microinjection+of+Short+DNA+Fragments.">Generation of Transgenic Rats by Microinjection of Short DNA Fragments.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 81-92 (2010).</li><li>Tesson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+modifications+of+the+rat+genome.">Transgenic modifications of the rat genome.</a> Transgenic Research. 14 (5), 531-546 (2005).</li><li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+rats:+Technical+aspects+and+models.">Transgenesis in rats: Technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li><li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors.">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+by+lentiviral+vectors:+lack+of+gene+silencing+in+mammalian+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos.">Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2140-2145 (2002).</li><li>Koza, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+TDP-43+depletion+affects+activity-dependent+plasticity.">Neuronal TDP-43 depletion affects activity-dependent plasticity.</a> Neurobiology of Disease. 130, 104499 (2019).</li><li>Scherr, M., Battmer, K., Blomer, U., Ganser, A., Grez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+lentiviral+vector+particle+numbers+by+real-time+PCR.">Quantitative determination of lentiviral vector particle numbers by real-time PCR.</a> Biotechniques. 31 (3), 520 (2001).</li><li>Canseco, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+efficiency+during+gestation+and+the+influence+of+co-transfer+of+non-manipulated+embryos+on+production+of+transgenic+mice.">Gene transfer efficiency during gestation and the influence of co-transfer of non-manipulated embryos on production of transgenic mice.</a> Transgenic Research. 3 (1), 20-25 (1994).</li><li>Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+rats:+technical+aspects+and+models.">Transgenesis in rats: technical aspects and models.</a> Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li><li>Armstrong, D. T., Opavsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superovulation+of+immature+rats+by+continuous+infusion+of+follicle-stimulating+hormone.">Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone.</a> Biology of Reproduction. 39 (3), 511-518 (1988).</li><li>Popova, E., Krivokharchenko, A., Ganten, D., Bader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+PMSG-+and+FSH-induced+superovulation+for+the+generation+of+transgenic+rats.">Comparison between PMSG- and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats.</a> Molecular Reproduction and Development. 63 (2), 177-182 (2002).</li><li>Johnson, L. W., Moffatt, R. J., Bartol, F. F., Pinkert, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+embryo+transfer+protocols+for+mice.">Optimization of embryo transfer protocols for mice.</a> Theriogenology. 46 (7), 1267-1276 (1996).</li><li>van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirally+generated+eGFP-transgenic+rats+allow+efficient+cell+tracking+in+vivo.">Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo.</a> Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Lentiviral+Vectors+to+Obtain+Transgenic+Rats.">The Use of Lentiviral Vectors to Obtain Transgenic Rats.</a> Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 109-125 (2010).</li></ol>

Os avanços nas tecnologias transgênicas tornaram os modelos de roedores uma ferramenta inestimável na pesquisa biomédica. Eles oferecem a oportunidade de estudar relações genótipo-fenótipo in vivo. Aqui, apresentamos uma alternativa amplamente disponível para transgênese convencional por injeções pronucleares. O uso da transdução do gene lentiviral ignora a necessidade de exigir microinjeções porque vetores virais podem ser injetados sob a zona pellucida. Essa abordagem não afeta a integridade do embriã...

Por muitos anos, roedores de laboratório, como ratos e camundongos, têm sido usados para modelar condições fisiológicas e patológicas humanas. A pesquisa em animais levou a descobertas que eram inatingíveis por qualquer outro meio. Inicialmente, estudos genéticos se concentraram na análise de distúrbios e fenótipos de ocorrência espontânea que são considerados para imitar de perto a condição humana1. O desenvolvimento de métodos de engenharia genética permitiu a introdução ou exclusão de genes específicos para obter um fenótipo desejado. Portanto, a geração de animais transgênicos é reconhecida como uma técnica fundamental na pesquisa moderna que permite estudos da função genética em organismos vivos.
A tecnologia animal transgênica tornou-se possível através de uma combinação de realizações em embriologia experimental e biologia molecular. Na década de 1960, o embriologista polonês A. K. Tarkowski publicou o primeiro trabalho sobre manipulação de embriões de camundongos durante os estágios iniciais do desenvolvimento2. Além disso, biólogos moleculares desenvolveram técnicas para gerar vetores de DNA (ou seja, portadores) para a introdução entre outros de DNA estranho no genoma do animal. Esses vetores permitem a propagação de genes selecionados e sua modificação apropriada, dependendo do tipo de pesquisa que é realizada. O termo "animal transgênico" foi introduzido por Gordon e Ruddle3.
A primeira espécie amplamente aceita que foi usada em neurobiologia, fisiologia, farmacologia, toxicologia e muitos outros campos das ciências biológicas e médicas foi o rato norueguês Rattus norvegicus4. No entanto, devido à dificuldade em manipular embriões de ratos, o rato musculus da casa tornou-se a espécie animal dominante na pesquisa genética5. Outra razão para a primazia do camundongo em tal pesquisa foi a disponibilidade de tecnologia de células-tronco embrionárias para gerar animais eliminados para esta espécie. A técnica mais utilizada de transgênese (2-10% dos descendentes transgênicos em relação a todos os animais nascidos) é a microinjeção de fragmentos de DNA em um pronúcleo de um oócito fertilizado. Em 1990, essa abordagem, que foi introduzida pela primeira vez em camundongos, foi adaptada para ratos6,7. A transgênese de ratos por injeção pronuclear é caracterizada pela menor eficiência8 em relação aos camundongos, o que está estritamente relacionado com a presença de plasma elástico emembranaspronuclear9 . Embora a sobrevivência dos embriões após a manipulação seja 40-50% menor do que em camundongos, essa técnica é considerada um padrão na geração de ratos geneticamente modificados10. Abordagens alternativas que podem garantir a incorporação transgênica eficiente e maiores taxas de sobrevivência de zigotes injetados têm sido investigadas.
O principal determinante da expressão transgênica estável e transmissão à prole é sua integração ao genoma celular hospedeiro. Os lentivírus (LVs) têm a característica distinta de serem capazes de infectar células divisórias e não divisórias. Seu uso como ferramenta para a incorporação de genes heterólogos em embriões provou ser altamente eficiente11, e os indivíduos transgênicos são caracterizados pela expressão estável do fragmento de DNA incorporado. A eficácia dos vetores lentivirais foi confirmada para a modificação genética de camundongos12,13, ratos12,14, e outras espécies11. Neste método, a suspensão lv é injetada sob a zona pellucida do embrião na fase de dois pronucleis. Esta técnica essencialmente garante 100% de sobrevivência dos embriões porque o oolema permanece inalterado. A produção de suspensões lv de alta qualidade e relativamente altamente concentradas são fatores cruciais. No entanto, concentrações mais baixas de suspensões de LV podem ser superadas por injeções repetidas11, o que aumenta a quantidade de partículas virais na superfície do ovo, sem afetar a integração da membrana. Embriões que são submetidos a injeções repetidas no espaço perivitelline desenvolvem-se ainda mais, e descendentes transgênicos podem transmitir o transgene através da germinação. A eficiência da geração transgênica de ratos por transgênese lentiviral pode ser de até 80%12.
Aqui, descrevemos a produção de lentivírus recombinante derivado do HIV-1 que foi pseudodigitado com proteína envelope de estomatite vesicular (VSV) G. O uso do pseudotipo VSV de segunda geração determina a ampla infectividade das partículas virais e permite a produção de vetores altamente estáveis que podem ser concentrados por ultracentrifugação e criopreservação. Após a verificação do título, os vetores estão prontos para serem usados como um veículo para a entrega de transgênicos em zigotes de rato Albino Wistar. Após uma série de injeções, os embriões podem ser cultivados durante a noite e transferidos no estágio de duas células para mães adotivas. Neste ponto, uma das duas abordagens alternativas pode ser considerada. O procedimento padrão utiliza fêmeas pseudográvidas como receptores de embriões. No entanto, quando a taxa de gravidez é baixa após o acasalamento com machos vasectomizados, os embriões podem ser implantados em fêmeas grávidas wistar/sprague-dawley (SD) que são acasaladas com ratos machos férteis com uma cor de pele escura (por exemplo, ratos da Noruega Marrom [BN)." A cor da pele permite a distinção da prole da gravidez natural de descendentes que se originam dos embriões manipulados transferidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1208px;" width="1209">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">7500 Real Time PCR System</td>
			<td style="width:186px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:354px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Aerrane (isoflurane)</td>
			<td style="width:186px;">Baxter</td>
			<td style="width:354px;">FDG9623</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Atipam 5 mg/ml</td>
			<td>Eurovet Animal Health BV</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5-10 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Borosilicate glass capillaries with filament GC100TF-15</td>
			<td style="width:186px;">Harvard Apparatus Limited</td>
			<td style="width:354px;">30-0039</td>
			<td style="width:172px;">injection capillary</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bupivacaine 25 mg/ml</td>
			<td>Advanz Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.25% in&#160; 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Butomidor 10 mg/ml (butorphanol&#160; tartrate)</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm</td>
			<td style="width:186px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:354px;">627160</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:496px;">CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 60-mm</td>
			<td style="width:186px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:354px;">628160</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">CellTram Oil</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">5176 000.025</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml</td>
			<td>cp-pharma</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin&#160;</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>150 IU/ ml ml 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">D6048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">DNase, RNase-free</td>
			<td style="width:186px;">A&#38;A Biotechnology</td>
			<td style="width:354px;">1009-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EmbryoMax Filtered Light Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES-005-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Envelope protein coding plasmid for lentiviral vectors (VSVg plasmid)&#160;</td>
			<td style="width:186px;">ADDGENE</td>
			<td style="width:354px;">14888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">FemtoJet</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">4i /5252 000.013</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">F9665-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Folligon, Pregnant Mare&#8217;s Serum Gonadotropin&#160;</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>N/A</td>
			<td>125 IU/ml in .9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEK 293T cells&#160;</td>
			<td style="width:186px;">ATCC</td>
			<td style="width:354px;">ATCC CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase from Bovine Testis&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272-30MG</td>
			<td>0.5 mg/ml in M2 medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Inverted Microscope&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Zeiss</td>
			<td style="width:354px;">Axiovert 200</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine 100mg/ml</td>
			<td>Biowet Pulawy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Paraffin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8042-47-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M16 medium EmbryoMax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MR-016-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Magnesium Chloride 1M</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">63069-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Microforge</td>
			<td style="width:186px;">Narishige</td>
			<td style="width:354px;">MF-900</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl 0.9%</td>
			<td>POLPHARMA OTC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sterile, 5ml ampules</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Operation microscope&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Inami Ophthalmic Instruments</td>
			<td style="width:354px;">Deca-21</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Packaging system coding plasmid for lentiviral vectors&#160; (delta R8.2 plasmid)</td>
			<td style="width:186px;">ADDGENE</td>
			<td style="width:354px;">12263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">PEI reagent (Polyethylenimine, Mw ~ 25,000,),</td>
			<td style="width:186px;">Polysciences, Inc</td>
			<td style="width:354px;">23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Penicilin-streptomycin</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">806552-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Puller&#160;</td>
			<td style="width:186px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:354px;">P-97</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Reflex Clip Applier/Reflex Clips</td>
			<td style="width:186px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:354px;">500345/500346</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Safil, polyglycolic acid, braided, coated, absorbable threads</td>
			<td style="width:186px;">B.Braun Surgical</td>
			<td style="width:354px;">1048029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:186px;">Olympus</td>
			<td style="width:354px;">SZX16</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Sewing Thread</td>
			<td>B.Braun&#160;</td>
			<td>C1048040</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:186px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:354px;">4334973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tolfedine 4% (tolfenamic acid)</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:496px;">TransferMan NK2</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">N/A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Trypsin EDTA solution</td>
			<td style="width:186px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:354px;">T3924-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:186px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:354px;">Optima L-100 XP&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">VacuTip</td>
			<td style="width:186px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:354px;">5175108.000</td>
			<td style="width:172px;">holders capillary</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vita-POS</td>
			<td>Ursapharm</td>
			<td>N/A</td>
			<td>eye ointment</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:496px;">Warming Plate</td>
			<td style="width:186px;">Semic</td>
			<td style="width:354px;">N/A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Watchmaker Forceps</td>
			<td style="width:186px;">VWR</td>
			<td>470018-868</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of transgenic rats using a lentiviral vector approach

Modelos animais transgênicos são fundamentalmente importantes para a pesquisa biomédica moderna. A incorporação de genes estrangeiros em embriões de camundongos ou ratos primitivos é uma ferramenta inestimável para a análise da função genética em organismos vivos. O método de transgênese padrão é baseado na microinjeção de fragmentos de DNA estranho susceptante em um pronúcleo de um oócito fertilizado. Esta técnica é amplamente utilizada em camundongos, mas permanece relativamente ineficiente e tecnicamente exigente em outras espécies animais. O transgene também pode ser introduzido em embriões em estágio unicelular através de infecção lentiviral, fornecendo uma alternativa eficaz às injeções pronuclears padrão, especialmente em espécies ou cepas com uma estrutura de embriões mais desafiadora. Nesta abordagem, uma suspensão que contém vetores lentivirais é injetada no espaço perivitelline de um embrião de rato fertilizado, que é tecnicamente menos exigente e tem uma taxa de sucesso maior. Os vetores lentivirais mostraram incorporar eficientemente o transgene no genoma para determinar a geração de linhas transgênicas estáveis. Apesar de algumas limitações (por exemplo, requisitos de Biossegurança Nível 2, limites de tamanho do fragmento de DNA), a transgênese lentiviral é um método de transgênese rápida e eficiente. Além disso, o uso de ratos fêmeas que são acasalados com uma cepa masculina fértil com uma cor de pele dominante diferente é apresentado como uma alternativa para gerar mães adotivas pseudográvidas.

Utilizando-se o protocolo descrito aqui, foram produzidos vetores lentivirais que carregavam o construto Syn-TDP-43-eGFP (título de LV físico = 3,4 x 108/μL) e, em seguida, poderiam ser utilizados para injeções subzonais de embriões em estágio de célula. Apenas embriões com duas pronucéis visíveis foram submetidos ao procedimento. O número de injeções de suspensões virais foi determinado experimentalmente. Alta eficiência de implantação e falta simultânea de descendentes transgênicos foram ...

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Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach

Este artigo tem como objetivo fornecer a metodologia para transgênese lentiviral em embriões de ratos usando múltiplas injeções de uma suspensão do vírus no espaço de perivitelline zigogote. Ratos fêmeas que são acasalados com uma cepa masculina fértil com uma cor de pele dominante diferente é usado para gerar mães adotivas pseudográvidas.

Geração de ratos transgênicos usando uma abordagem vetorial lentiviral

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is ...

Animais transgênicos são fundamentais para a pesquisa biomédica moderna, pois permitem estudos da função genética em organismos vivos. Vários métodos de modificações genéticas têm sido aplicados em estudos em animais. Aqui, apresentamos uma técnica amplamente acessível e eficaz que utiliza vetores lentivirais como ferramenta de incorporação transgênica no genoma de um embrião de rato.Após a administração de gonadotropina coriônica humana, mate cinco semanas de idade Wistar ratos fêmeas um-para-um com sexualmente fértil machos Wistar de três a 10 meses de idade. Às oito às 10.m da manhã seguinte, verifique as fêmeas para a presença de um plugue vaginal e colde os ovidutos das fêmeas com um plugue de acasalamento por no máximo 10.m.em um prato de coleta contendo meio M2 pré-aquecido. Quando todos os ovidutos tiverem sido coletados, transfira os tecidos para um prato de 35 milímetros contendo meio M2 pré-aquecido complementado com 0,5 miligramas por mililitro de hialuronidase de testículos bovinos e coloque o prato sob um microscópio estéreo. Use fórceps finos para abrir as paredes do oviduto e pressione a ampulla até que os embriões sejam libertados.Para facilitar a liberação dos embriões das células cumulus, use uma pipeta de transferência de vidro conectada a um tubo aspirador operado pela boca para in pipeta suavemente os embriões para cima e para baixo. Quando todos os embriões tiverem sido liberados, lave as células algumas vezes em meio M2 fresco para remover a hialuronidase e detritos celulares. Transfira os embriões para 50 gotas de microliter individuais de meio M16 pré-equilibrado coberto por óleo mineral em um prato de 60 milímetros.Em seguida, coloque o prato em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius com uma atmosfera de dióxido de carbono de 5% até sua injeção. Para microinjeção vetorial lentiviral sob a zona pellucida dos embriões de estágio de uma célula, use um puxador de pipeta para preparar capilares de vidro borossilicato de microinjeção com um filamento. Depois de cada vez que o filamento é alterado ou um novo capilar de vidro é usado, execute um teste de rampa para definir os parâmetros ideais.Em seguida, use uma ponta de microcarregador para carregar aproximadamente dois microliters de solução lentiviral recém-descongelada por pipeta de microinjeção sob uma capa de fluxo laminar de biossegurança. Adicione uma gota de 100 microliter de m2 médio ao centro da tampa de uma placa de Petri de 60 milímetros. Cubra o meio com óleo mineral e monte a pipeta de retenção e o vírus carregou capilar de microinjeção em um micromanipulador.Coloque o prato de microinjeção sob um microscópio invertido e transfira de 15 a 20 embriões de estágio de uma célula para a gota M2 no prato de microinjeção. Capture um embrião com a pipeta de retenção e use a ampliação 400 vezes e o capilar de vidro para injetar a solução lentiviral sob a zona pellucida no espaço perivitelline segurando o capilar sob a zona pellucida por um momento após a entrega do vírus. Quando todos os embriões forem injetados, use uma pipeta fina para devolver as células injetadas ao prato de cultura e devolver o prato à incubadora de cultura celular até sua implantação.Para preparar as mães adotivas para a transferência de embriões, mate fêmeas sexualmente maduras de Sprague-Dawley com machos vasectomizados e verifique as fêmeas na manhã seguinte para um plugue vaginal. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal nas fêmeas anestesiadas com um plugue viável, aplique pomada nos olhos do animal e raspe a pele da parte de trás de cada animal. Coloque o primeiro rato na posição propensa em uma superfície limpa em uma almofada de aquecimento sob um microscópio cirúrgico.Cubra o rato com uma cortina estéril com um pequeno orifício cortado sobre a parte inferior das costas e faça uma incisão de pele de aproximadamente dois centímetros paralela à coluna vertebral lombar. Use uma tesoura afiada para fazer um corte na parede abdominal e use fórceps para agarrar uma almofada de gordura ovariana. Puxe o ovário e oviduto para fora da cavidade abdominal em um pedaço de gaze encharcada de cloreto de sódio de 0,9%.Carregue m2 médio, três bolhas de ar, e os embriões em uma transferência capilar. Use microscisores para fazer uma pequena incisão no oviduto entre o infundibulum e ampulla e inserir a ponta da pipeta de transferência na incisão. Expulse suavemente os embriões e bolhas de ar para dentro do oviduto, em seguida, use fórceps contundentes para colocar o trato reprodutivo de volta na cavidade abdominal.Suturar a parede abdominal com suturas absorvíveis de ácido poliglicólico e fechar a incisão da pele com clipes de ferida e colocar o animal em uma gaiola limpa em uma placa de aquecimento com monitoramento até a recumbência total. Para vasectomizar potenciais companheiros, depois de preparar o rato macho para cirurgia como demonstrado, use 70% de etanol e um esfoliante cirúrgico para desinfetar a pele sobre os testículos. Pressione suavemente o abdômen para expor os testículos no saco escrotal e cubra o rato com uma cortina estéril com um pequeno orifício sobre o local cirúrgico e use uma tesoura escrotal para fazer uma incisão de 0,5 centímetros no meio do saco.Empurre cuidadosamente o testífero para a esquerda e localize os vasos deferimento entre os testíferos e a linha média como um duto branco com um único vaso sanguíneo. Use fórceps para puxar suavemente os vasos aferir do saco escrotal e segurar o vaso com fórceps, use uma tesoura fina para remover um fragmento de um centímetro do duto. Repita o procedimento para o segundo teste como apenas demonstrado e feche a pele com suturas absorvíveis de ácido poliglicólico.Em seguida, coloque o rato em uma gaiola limpa em uma placa de aquecimento com monitoramento até a recumbência total. Neste experimento representativo em que embriões únicos foram injetados várias vezes, oito ratos nasceram de embriões que foram injetados duas vezes, três dos quais foram confirmados para transportar o transgene. Um dos fundadores não transferiu o transgene para a prole e três fêmeas adotivas foram usadas para cada configuração experimental.A abordagem escolhida permitiu a geração de linhas de ratos transgênicos estáveis que expressavam a proteína de fusão TDP-43-eGFP sob o controle da sinapse neuronal em um promotor em todo o sistema nervoso central. A transgênese baseada em lentivírus resultou em uma única inserção de cópia do transgêgênio, como demonstrado pelo PCR quantitativo. Quando este método foi utilizado para outros vetores lentivirais, observou-se uma taxa de sobrevivência de aproximadamente 90%.A porcentagem de embriões que sobreviveram às injeções pronucleares foi significativamente menor. No geral, esses resultados sugerem que ratos gestantes podem ser usados como mães adotivas com uma eficiência comparável. Notavelmente, os dados numéricos analisados para rodadas individuais de microinjeção indicaram que a eficácia da implantação dependia diretamente do número de injeções em um embrião e indiretamente na carga viral.O uso de vetores lentivirais garante a integração genômica e a transmissão do transgênico e facilita uma alta taxa de sobrevivência dos embriões micromanípulos mesmo quando múltiplas injeções subdérmicas são realizadas. Este procedimento pode ser efetivamente aplicado a outras espécies e pode ser considerado uma alternativa para a transgênese convencional.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A Cre-Lox Abordagem Recombinação P para Detecção de fusão celular In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Bioengenharia

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Pele a tatuagem como uma nova abordagem para a Campanha de Vacinação de DNA

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Geração de cisalhamento Adesão Mapa Usando SynVivo Networks microvasculares sintético

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Caracterização de Sistemas Complexos Usando o Projeto de Experimentos Abordagem: Transient Protein Expression em tabaco como um Estudo de Caso

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipid Bilayer Vesicle Geração Usando Microfluidic jateamento

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Duplo Emulsion Geração de utilizar um dispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS) Co-Axial Flow Foco

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Geração de células de camundongo Airway epiteliais derivados de ESC Usando descelularizado Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: Uma abordagem poderosa, não-invasiva para investigar o metabolismo energético celular

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

In Silico Modeling Method for Computational Aquatic Toxicology of Endocrine Disruptors: A Software-Based Approach Using QSAR Toolbox

No método de modelagem silico para Toxicologia aquática computacional de Disruptores endócrinos: uma abordagem baseada em software usando o QSAR Toolbox

Computational analyses of toxicological processes enables high-throughput screening of chemical substances and prediction of their endpoints in biological ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

Enxerto projetado por tecido para reconstrução circunferencial do Esôfago em Ratos

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...