Name: efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

نشكر الدكتور كارل د. بورتنر (NIEHS) علي مساعدته في تحليل النظام. وقد حظي هذا البحث بدعم برنامج البحوث داخل المعهد الوطني للعلوم الصحية البيئية ، والمعاهد الوطنية للصحة ، Z01-101585 إلى AMJ.

1. اعداد الطبقة السفلية المؤهلة لغشاء القبو-لوحات مغلفه
<ol><li>الذوبان ببطء في مصفوفة غشاء الطابق السفلي المؤهلة hESC (انظر جدول المواد) الحل في 4 درجه مئوية لمده لا تقل عن 2-3 h أو بين عشيه وضحيها لتجنب تشكيل هلام.</li>
	<li>لاعداد الطابق السفلي غشاء مصفوفة المغلفة لوحات ، وتمييع مصفوفة في DME...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Rosler, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions.">Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).</li><li>Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+xeno-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).</li><li>Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Characterization and culture of human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+derivation+of+primitive+neural+stem+cells+and+generation+of+brain+subtype+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).</li><li>Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Neurogenesis+in+the+Hippocampus:+From+Stem+Cells+to+Behavior.">Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior.</a> Cell. 167 (4), 897-914 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative.">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).</li><li>Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clump+passaging+and+expansion+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+on+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells.">Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-colony+type+monolayer+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).</li><li>Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-myosin+contractility+is+responsible+for+the+reduced+viability+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).</li><li>Ohgushi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+and+cell+state+responsible+for+dissociation-induced+apoptosis+in+human+pluripotent+stem+cells.">Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).</li><li>Pakzad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+a+ROCK+inhibitor+in+extracellular+matrix+supports+more+undifferentiated+growth+of+feeder-free+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+upon+passaging.">Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Jeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLIS3+Transcriptionally+Activates+WNT+Genes+to+Promote+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+Posterior+Neural+Progenitors.">GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors.</a> Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+with+biological+and+epigenetic+characteristics+similar+to+those+of+mouse+ESCs.">Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).</li><li>Saha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-engineered+substrates+for+improved+human+pluripotent+stem+cell+culture+under+fully+defined+conditions.">Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).</li><li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+small+molecule+inhibitor+cocktail+supports+long-term+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells.">An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells.</a> Nature Communications. 2, 167 (2011).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+a+core+signaling+regulatory+mechanism+for+pluripotent+stem+cell+survival+and+self-renewal+by+small+molecules.">Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible,+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pure+and+expandable+PSA-NCAM-positive+neural+precursors+from+human+ESC+and+iPSC-derived+neural+rosettes.">Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes.</a> PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).</li><li>Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+FGF2+and+BMP+controls+the+self-renewal,+dormancy+and+differentiation+of+rat+neural+stem+cells.">Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).</li><li>Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+that+induces+human+embryonic+stem+cells+to+differentiate+into+neural+cells+in+vitro.">An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro.</a> Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li></ol>

ومن المعايير الهامه لفحص المخدرات والعلاج بالخلايا الجذعية الطرق القابلة للتطوير والكفاءة للتفريق بين الhescs والسلالات المختلفة وتوليد اعداد كافيه من الخلايا المتمايزة. وقد نشرت مختلف طرق تمرير خليه واحده, في الخلايا التي يتم استزراعها في وجود مثبطات الصخور أو غيرها من الجزيئات الصغيرة ?...

الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) لديها القدرة علي التفريق في الطبقات الجرثومية الاوليه الثلاث ، والتي تفرق بعد ذلك إلى مختلف السلالات خلايا السلف متعددة القوي. هذه السلالات تؤدي فيما بعد إلى جميع أنواع الخلايا في جسم الإنسان. وقد حولت نظم الثقافة في المختبر القدرة علي دراسة تطور الاجنه البشرية واستخدمت كاداه قيمه للحصول علي رؤى جديده حول كيفيه تنظيم هذه العمليات علي المستويين البيولوجي والجزيئي. المثل ، فان دراسات الخلايا الجذعية مستحث المستحثة (iPSCs) المتولدة من أعاده برمجه الخلايا الجسدية المعزولة عن المرضي البشريين توفر رؤى جديده للامراض المختلفة. الاضافه إلى ذلك ، يمكن للبروجنتور والخلايا المتمايزة المستمدة من hescs ان تكون مفيده للبحوث التي تنطوي علي العلاج بالخلايا الجذعية وفحص المخدرات1،2،3،4.
يمكن ان يكون مستحثا hESCs للتمييز في خلايا السلف العصبية (NPCs) ، والتي هي خلايا متعددة الإمكانات مع قدره واسعه التجديد الذاتي. فيما بعد, هذا خلايا يستطيع كنت ميزت داخل خليه عصبيه, [استروستس], و [اوليجوندروسايتس]5,6. كما تقدم NPCs نظاما خلويا للدراسات المختبرية لبيولوجيا النمو العصبي والامراض العصبية المختلفة. ومع ذلك ، فان أساليب الثقافة نوع مستعمره الحالية التي تنطوي علي hescs وتمايزها في npcs غير فعاله وغالبا ما تنطوي علي الزراعة وكذلك الجسم الجنيني (EB) وتشكيل الوردة5،7،8،9. وتظهر هذه البروتوكولات معدلات بقاء اقل وتمايزا عفويا وتستغرق وقتا أطول.
المعروض هنا هو نظام ثقافة محسنه وقويه التي هي قابله للتطوير بسهوله ويستخدم عاليه الكثافة خليه واحده ثقافة نوع من hESCs10. وساهم ادراج مثبطات روه-كيناز (روك) في تعزيز كفاءه البقاء علي قيد الحياة بشكل كبير اثناء ثقافة الخلية الواحدة من النوع hesc10و11و12و13و14. في هذا النظام الثقافي ، يمكن الحفاظ علي الhescs بسهوله وتوسيعها. الاضافه إلى ذلك ، يقدم البروتوكول طريقه فعاله لتوليد npcs من ثقافة نوع خليه واحده من hescs ، الذي يسمح لإنتاج npcs نقيه للغاية. تثبيط BMP/tgfβ/اكتيسين مسارات الإشارات مع مثبطات ألك بكفاءة للحث علي التمايز من نوع واحد من الخلايا hescs في npcs15،16، والتي يمكن ان يسببها بعد ذلك للتمييز في السلالات العصبية وظيفية ، مثل الخلايا العصبية الدوبامين و astrocytes
وباختصار ، فان بروتوكول ثقافة نوع خليه واحده باستخدام hESCs يقدم نموذجا جذابا لدراسة التفريق بين هذه الخلايا في مختلف السلالات ، بما في ذلك NPCs. هذا البروتوكول هو قابل للتطوير بسهوله ، التالي مناسبه لتوليد خلايا للبحوث التي تنطوي علي العلاج التجديدي وفحص المخدرات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm m-dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>338-AC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (-Vit A)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z100065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>DAMON/ICE</td>
			<td>428-6759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS 10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cell freezing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-16A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF8</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1569601</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine supplement, 100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 (WA09) human embryonic stem cell line</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin b-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hESC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHH</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z200617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemdiff Neural Progenitor medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5833</td>
			<td>NPC expansion medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells

التفريق في المختبر من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) قد حولت القدرة علي دراسة التنمية البشرية علي المستويين البيولوجي والجزيئي وتوفير الخلايا لاستخدامها في التطبيقات التجديدية. النهج القياسية للثقافة hESC باستخدام ثقافة نوع مستعمره للحفاظ علي Hesc غير متمايزة والجسم الجنيني (EB) وتشكيل الوردة للتمييز في طبقات جرثوميه مختلفه غير فعاله وتستغرق وقتا طويلا. المقدمة هنا هو أسلوب ثقافة خليه واحده باستخدام hESCs بدلا من ثقافة من نوع مستعمره. هذا الأسلوب يسمح الحفاظ علي السمات المميزة لل hESCs غير متمايزة ، بما في ذلك التعبير عن علامات Hescs علي مستويات مماثله لنوع مستعمره hESCs. الاضافه إلى ذلك ، يقدم البروتوكول طريقه فعاله للجيل الخلايا العصبية (المجلس الوطني لنواب الشعب) من نوع خليه واحده hESCs التي تنتج NPCs في غضون أسبوع 1. هذه الخلايا تعبر كثيرا عن الجينات علامة المجلس الوطني ويمكن التفريق في أنواع مختلفه من الخلايا العصبية ، بما في ذلك الخلايا العصبية الدوبامين و astrocytes. هذا النظام الثقافة خليه واحده لل hESCs سيكون مفيدا في التحقيق في أليات الجزيئية لهذه العمليات ، ودراسات لبعض الامراض ، وشاشات اكتشاف المخدرات.

المعروض هنا هو بروتوكول محسن للحفاظ علي وتوسيع ثقافة نوع خليه واحده من hESCs وتمايزها كفاءه في خلايا السلف العصبية ، والتي تميز في وقت لاحق إلى مختلف السلالات العصبية المصب ، بما في ذلك الخلايا العصبية والاستروسيتيه.
تظهر الصور المتباينة للمرحلة التمثيلية شكل الخلية في خطوات...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

المعروض هنا هو بروتوكول لتوليد ثقافة خليه واحده من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والتمايز اللاحقة في خلايا السلف العصبية. البروتوكول بسيط وقوي وقابل للتطوير ومناسب للكشف عن المخدرات وتطبيقات الطب التجديدي.

كفاءه التمايز العصبي باستخدام ثقافة خليه واحده من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

يمكن أن يتم حث الخلايا الجذعية الجنينية البشرية على التفريق في الخلايا السلف العصبية وبعد ذلك إلى الخلايا العصبية الفلكية و oligodendrocyte. ومع ذلك ، فإن طريقة ثقافة النوع للخلايا الجذعية الجنينية البشرية وتمايزها إلى خلايا السلف العصبي غير فعالة للغاية ومفتوحة في نظام الثقافة المشتركة في الجسم الحي هنا نقدم نظامًا ثقافيًا محسنًا وقويًا قابلًا للتطوير بسهولة باستخدام ثقافة نوع الخلايا الفردية عالية الكثافة مع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. توفر ثقافة نوع الخلية المفردة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية نظامًا سريعًا وفعالًا لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم التمايز متعدد الخطوات على طول الأنساب المختلفة والمتميزة ، بما في ذلك الخلايا السلف العصبية وتمايزها اللاحق إلى أنساب عصبية إضافية.تبدأ من خلال إعداد الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المؤهلة مصفوفة الصفائح المغلفة. ذوبان ببطء في الطابق السفلي غشاء مصفوفة حل في أربع درجات مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات على الأقل أو بين عشية وضحاها. عندما ذاب، وتمييع المصفوفة في بارد DMEM/F-12 إلى 2٪ مزيج جيدا، ومعطف كل بئر من لوحة ستة جيدا مع ملليلتر واحد من محلول مخفف.احتضان الصفائح المغلفة في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات على الأقل أو في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. لتمرير الثقافات المغذية الخالية من نوع مستعمرة H9 الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي تزرع على مصفوفة غشاء الطابق السفلي، وتفطن المتوسطة من الآبار وتغسل مرة واحدة مع ملليلتر واحد من DPBS. إضافة ملليلتر واحد من حل Dispase لكل بئر واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.إزالة Dispase وغسل بلطف الخلايا مرة واحدة مع ملليلتر اثنين من DMEM / F-12. بعد غسل, إزالة المتوسطة وإضافة ملليلتر اثنين من DMEM/F-12 إلى كل بئر. فصل بلطف المستعمرات عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ونقلها إلى أنبوب 15 ملليلتر.جهاز طرد مركزي الأنبوب في 370 مرات ز لمدة دقيقتين. استلهم الوسط. ثم افصل كريات الخلية في خلايا مفردة عن طريق إضافة ميليلترين من حل مفرزة الخلية واحتضانها عند درجة مئوية 37 لمدة 10 دقائق.كرر الطرد المركزي وإزالة حل مفرزة. Resuspend الخلايا في mTeSR-1 الإنسان ESC المتوسطة عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. لتكييف نوع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مستعمرة لثقافة نوع خلية واحدة، لوحة ما يقرب من 1.5 إلى 2 مليون خلية في كل بئر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي لوحة المغلفة في مليلتر اثنين من mTeSR-1 التي تحتوي على 10 مثبطات الصخور الدقيقة.بعد 24 ساعة، استبدل الوسط بمع طازج mTeSR-1 بدون مثبط روك. السماح للخلايا أن تنمو كنوع خلية واحدة لمدة ثلاثة أيام تغيير المتوسطة يوميا. في اليوم الرابع، افصل الخلايا في حل مفرزة وإعادة لوحة لهم كما هو موضح سابقا.بعد إعادة الاعتماد على الخلايا واحتضانها وفقًا لاتجاهات المخطوطة، قم بنقل الأجسام الجنينية الصغيرة إلى أنبوب 15 ملليلتر، واتركها تستقر إلى الأسفل، وإزالة الوسط بلطف مع ماصة. نقلها إلى المتوسط EB والسماح لهم لتوسيع في أطباق مرفق منخفضة لمدة سبعة أيام. للحث على الخلية السلف العصبية أو التمايز المجلس الوطني للصحافة، فصل الخلايا الفردية نوع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مع ملليلتر واحد من حل مفرزة واحتضان لهم في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة دقيقتين في 370 مرات ز. إزالة مفرزة حل فائقة. ثم إعادة تعليق الخلايا في DMEM/F-12.لوحة الخلايا على مصفوفة غشاء الطابق السفلي المغلفة ستة لوحة جيدا في كثافة مرتين 10 إلى الخلايا الخامسة في البئر في مليلتر اثنين من mTeSR-1 مع 10 مثبطات الصخور الدقيقة. بعد 24 ساعة، استبدل الوسيطة الثقافية بوسيط تحريضي عصبي مكمّل بأخرى من دورسومورفين الصغيرة وخمسة ميكرومولار SB431542. تغيير المتوسط كل يومين خلال الأيام الأربعة الأولى من الحث العصبي، ثم كل يوم حتى يتم التوصل إلى التقاء في اليوم السابع.بعد سبعة أيام من الحث العصبي، افصل الخلايا عن طريق إضافة ملليلتر واحد من حل مفرزة واحتضانها لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية. الطرد المركزي الخلايا في 370 مرات ز وإزالة مفرزة حل متراكب. إضافة ملليلتر واحد من توسيع المجلس الوطني للصحافة المتوسطة والماصات بلطف الخلايا صعودا وهبوطا إلى resuspend.ثم لوحة واحدة مرات 10 إلى الخلايا الخامسة في بئر في مليلترين من توسيع المجلس الوطني للصحافة المتوسطة على مصفوفة غشاء الطابق السفلي المغلفة ستة آبار. مرور الخلايا عند الضرورة عندما تصل الثقافات 90٪ التقاء إضافة 10 مثبطات الصخور الدقيقة خلال أول ثلاثة إلى أربعة مقاطع. تغيير الوسط كل يومين أثناء التوسع.لإعداد لوحات مغلفة من قبل منظمة التحرير الفلسطينية، تمييع محلول مخزون منظمة التحرير الفلسطينية في برنامج تلفزيوني أو الماء إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام لكل ملليلتر، ثم اخلط جيداً، ثم غطي كل بئر من صفيحة سداسية الآبار مع ملليلتر واحد من المحلل. احتضان لوحات لمدة ساعتين على الأقل في 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. بعد ذلك، يغسل كل جيدا مع برنامج تلفزيوني وعلى الفور بعد معطف كل بئر مع ملليلتر واحد من محلول اللامينيين التي أعدت وفقا لتوجيهات المخطوطة.حافظ على الأطباق عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. لتمييز NPCs في الخلايا العصبية الدوبامين، لوحة الخلايا في الأطباق المغلفة في منظمة التحرير الفلسطينية في توسيع المجلس الوطني للصحافة المتوسطة في كثافة حوالي 50٪ بعد 24 ساعة، وتغيير المتوسطة إلى DA1 وتغيير المتوسطة كل يومين بعد ذلك. لتمرير الثقافات عندما تصل إلى التقاء، فصل الخلايا مع ملليلتر واحد من حل مفرزة واحتضانها لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية.ثم الطرد المركزي لهم في 370 مرات ز وإزالة مفرزة حل متراكب. إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من DA1 المتوسطة وطبقة مرة واحدة 10 مرات إلى الخلايا الخامسة في مليلترين من المتوسط على لوحات منظمة التحرير الفلسطينية المغلفة الستة آبار. لتمييز NPCs إلى الخلايا الفلكية، لوحة الخلايا على لوحات laminin منظمة التحرير الفلسطينية وPP توسيع المتوسطة في كثافة 50٪ تغيير المتوسطة إلى الأستروcyte المتوسطة بعد 24 ساعة، والمرور الخلايا كما وصف سابقا.عندما تم تكييف نوع مستعمرة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لثقافة نوع الخلية واحدة، وجد أن الخلايا كانت قادرة على الحفاظ على كثافة عالية، ثم بسهولة وكفاءة subcultureed عندما تم الوصول إلى التقاء. احتفظت هذه الخلايا بخصائص دورة الخلية النموذجية من نوع مستعمرة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مثل مرحلة G1 قصيرة ونسبة عالية من الخلايا في المرحلة S. كما أكد التحليل الكمي PCR أنها تعبر عن علامات ESC عند مستويات مماثلة لتلك التي من خلايا نوع المستعمرة.وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن الخلايا الوحيدة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية كانت قادرة على تشكيل أجسام جنينية تحتوي على خلايا من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث: إندودم، ميسوديرم، وميكوديرم. ثم ثبت أن الخلايا الواحدة من نوع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية تختلف بكفاءة إلى NPCs كما هو مبين من خلال فقدان الشكل النموذجي للخلايا الجذعية الجنينية البشرية وظهور مورفولوجيا المجلس الوطني للصحافة. وقد دعم التمايز زيادة التعبير عن علامات NPC المميزة وتم تأكيده بواسطة تحليل الكبت بالمناعة وFACS.كما أظهر التحليل نفسه أن أكثر من 90٪ من الخلايا تلطخت إيجابية لبروتينات SOX1 و PAX6 و NCAM. وعلاوة على ذلك، كانت قادرة على التمييز بين NPCs المشتقة في الخلايا العصبية الدوبامين والخلايا الفلكية كما هو مبين من قبل ظهور المورفورولوجيا المميزة والتعبير عن علامات النسب محددة. عند محاولة هذا الإجراء، من الضروري أن لوحة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في كثافة عالية من أجل الحفاظ على صحة, غير متمايزة الإنسان زرع الخلايا الجذعية الجنينية.يوفر هذا البروتوكول منصة لإنتاج بسيط وقوي وقابل للتطوير من الخلايا السلف والمتمايزة التي ستكون قابلة للتطوير للدراسة الأساسية ، وشاشة الدواء ، والتطبيق في الطب العصبي.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

التمايز العصبي للماوس الخلايا الجذعية الجنينية في المصل خالية أحادي الطبقة الثقافة

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

طريقة سريعة وفعالة لتنقية خلايا الأديم المولدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

زراعة متعددة القدرات البشرية والعصبية الخلايا الجذعية في نظام زراعة الخلايا المغلقة للبحوث الأساسية وقبل السريرية

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

تنظيم جينية من القلب تمايز الخلايا الجذعية الجنينية والأنسجة

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

التمايز كفاءة الخلايا الجذعية المحفزة لNKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; البنكرياس أسلاف

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

تحليل الناجم عن حمض الريتينويك العصبية تمايز الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الهيئات مضغي اثنين وثلاثة الأبعاد

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

التفريق بين الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث أو الجنينية البشرية سريعة وموجهة

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

فوتوكونفيرسيون خلية واحدة في معيشة سليمة الزرد

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

فعالة وقابلة للتمايز الموجهة متوافقة سريرياً القرنية حوفي طلائي الخلايا الجذعية من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...