Name: efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Vi takker Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) for hans hjælp til FACS-analysen. Denne forskning blev støttet af det Intramural forsknings program af National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, Z01-ES-101585 til AMJ.

1. fremstilling af hESC-kvalificerede kælder membran matrix-belagte plader
<ol><li>Tø langsomt den hESC-kvalificerede kælder membran matrix (Se tabel over materialer) opløsning ved 4 °c i mindst 2 – 3 timer eller natten for at undgå dannelse af en gel.</li>
	<li>For at forberede kælder membran matrix-belagte plader, fortyndet matrix i kold DMEM/F12 til en 2% endelig koncentration. Bland godt og pels hver brønd af en 6 brønd plade med 1 mL af den fortyndede matrix opløsning.</li>
	<li>Inkube...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Rosler, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions.">Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).</li><li>Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+xeno-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).</li><li>Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Characterization and culture of human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+derivation+of+primitive+neural+stem+cells+and+generation+of+brain+subtype+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).</li><li>Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Neurogenesis+in+the+Hippocampus:+From+Stem+Cells+to+Behavior.">Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior.</a> Cell. 167 (4), 897-914 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative.">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).</li><li>Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clump+passaging+and+expansion+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+on+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells.">Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-colony+type+monolayer+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).</li><li>Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-myosin+contractility+is+responsible+for+the+reduced+viability+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).</li><li>Ohgushi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+and+cell+state+responsible+for+dissociation-induced+apoptosis+in+human+pluripotent+stem+cells.">Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).</li><li>Pakzad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+a+ROCK+inhibitor+in+extracellular+matrix+supports+more+undifferentiated+growth+of+feeder-free+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+upon+passaging.">Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Jeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLIS3+Transcriptionally+Activates+WNT+Genes+to+Promote+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+Posterior+Neural+Progenitors.">GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors.</a> Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+with+biological+and+epigenetic+characteristics+similar+to+those+of+mouse+ESCs.">Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).</li><li>Saha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-engineered+substrates+for+improved+human+pluripotent+stem+cell+culture+under+fully+defined+conditions.">Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).</li><li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+small+molecule+inhibitor+cocktail+supports+long-term+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells.">An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells.</a> Nature Communications. 2, 167 (2011).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+a+core+signaling+regulatory+mechanism+for+pluripotent+stem+cell+survival+and+self-renewal+by+small+molecules.">Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible,+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pure+and+expandable+PSA-NCAM-positive+neural+precursors+from+human+ESC+and+iPSC-derived+neural+rosettes.">Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes.</a> PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).</li><li>Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+FGF2+and+BMP+controls+the+self-renewal,+dormancy+and+differentiation+of+rat+neural+stem+cells.">Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).</li><li>Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+that+induces+human+embryonic+stem+cells+to+differentiate+into+neural+cells+in+vitro.">An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro.</a> Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li></ol>

Skalerbare og effektive metoder til differentiering af hESCs i forskellige nedstamningens og generering af et tilstrækkeligt antal differentierede celler er vigtige kriterier for lægemiddel screening og stamcelleterapi. Forskellige enkelt-celle forbipasserende metoder er blevet offentliggjort, hvor cellerne dyrkes i nærværelse af rock inhibitor eller andre små molekyler til at forbedre overlevelsen, men de endelige produkter af disse dyrkningsmetoder er koloni type hESCs17,<sup cla...

Humane embryonale stamceller (hESCs) har potentialet til at differentiere sig til de tre primære kimlag, som derefter differentieres i forskellige Multipotente progenitorcellelager. Disse nedstamningens efterfølgende give anledning til alle celletyper i den menneskelige krop. In vitro hESC kultur systemer har forvandlet evnen til at studere menneskelige embryonale udvikling og har tjent som et værdifuldt redskab til at opnå ny indsigt i, hvordan disse processer er reguleret på det biologiske og molekylære niveau. Tilsvarende undersøgelser af inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) genereret fra omprogrammering somatiske celler isoleret fra humane patienter giver ny indsigt i forskellige sygdomme. Desuden kan progenitorceller og differentierede celler afledt af hESCs være nyttige for forskning, der involverer stamcelleterapi og Drug screening1,2,3,4.
hESCs kan induceres til at differentiere sig i neurale stamceller (NPC'er), som er multi potentielle celler med en omfattende selv fornyelseskapacitet. Efterfølgende kan disse celler differentieres i neuroner, astrocytter, og oligodendrocytter5,6. NPCs tilbyder også et cellulært system til in vitro-studier af neuroudviklingsmæssige biologi og forskellige neurologiske sygdomme. Men, nuværende koloni type kultur metoder, der involverer hESCs og deres differentiering i NPCs er ineffektive og involverer ofte coculture samt embryo OID krop (EB) og Rosette dannelse5,7,8,9. Disse protokoller udviser lavere overlevelsesrater og spontan differentiering og er mere tidskrævende.
Præsenteret her er et forbedret og robust kultur system, der er let skalerbar og bruger høj densitet enkelt celletype kultur af hESCs10. Inddragelsen af Roh-kinase (rock) inhibitor bidrog til signifikant forbedret overlevelse effektivitet under enkelt celletype kultur af hesc10,11,12,13,14. I dette kultur system kan hESCs nemt vedligeholdes og udvides. Hertil kommer, at protokollen præsenterer en effektiv metode til at generere NPCs fra enkelt-celletype kultur af hESCs, som tillader produktion af meget rene NPC'er. hæmning af BMP/tgfβ/Activity signalering veje med ALK-hæmmere effektivt fremkalde differentiering af enkelt celletype hESCs i NPCs15,16, som derefter kan blive induceret til at differentiere sig til funktionelle neurale lineages, såsom dopaminerge neuroner og astrocytter.
Kort sagt, den enkelt-celletype kultur protokol ved hjælp af hESCs tilbyder en attraktiv model til at studere differentieringen af disse celler i forskellige lineages, herunder NPCs. Denne protokol er let skalerbar og derfor egnet til at generere celler til forskning, der involverer regenerativ terapi og Drug screening.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm m-dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>338-AC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (-Vit A)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z100065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>DAMON/ICE</td>
			<td>428-6759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS 10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cell freezing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-16A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF8</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1569601</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine supplement, 100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 (WA09) human embryonic stem cell line</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin b-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hESC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHH</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z200617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemdiff Neural Progenitor medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5833</td>
			<td>NPC expansion medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells

In vitro-differentiering af humane embryonale stamceller (hESCs) har ændret evnen til at studere menneskelig udvikling på både biologiske og molekylære niveauer og forudsat celler til brug i regenerativ applikationer. Standard tilgange til hESC kultur ved hjælp af koloni type kultur til at opretholde udifferentierede hESCs og embryo OID krop (EB) og Rosette dannelse for differentiering i forskellige kimlag er ineffektive og tidskrævende. Præsenteret her er en enkelt cellekultur metode ved hjælp af hESCs i stedet for en koloni-type kultur. Denne metode gør det muligt at vedligeholde de karakteristiske træk ved udifferentierede Hesc'er, herunder udtryk for hESC-markører på niveauer, der kan sammenlignes med koloni typen hESCs. Hertil kommer, at protokollen præsenterer en effektiv metode til neurale progenitorcelle (NPC) generation fra enkelt celletype hESCs, der producerer NPCs inden for 1 uge. Disse celler udtrykker meget flere NPC-markørgener og kan differentiere sig i forskellige neurale celletyper, herunder dopaminerge neuroner og astrocytter. Dette encellet kultur system til hESCs vil være nyttigt til at undersøge de molekylære mekanismer i disse processer, undersøgelser af visse sygdomme, og Drug Discovery skærme.

Præsenteret her er en forbedret protokol for vedligeholdelse og udvidelse af enkelt celletype kultur af hESCs og deres effektive differentiering i neurale stamceller, som efterfølgende differentierer i forskellige downstream neurale lineages, herunder dopaminerge neuroner og astrocytter.
Repræsentative fasekontrast billeder viser celle morfologi på forskellige trin under tilpasningen af koloni type hESCs til enkelt celle typen kultur (figur 1A...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Præsenteret her er en protokol til generering af en enkelt cellekultur af humane embryonale stamceller og deres efterfølgende differentiering i neurale progenitorceller. Protokollen er enkel, robust, skalerbar og egnet til lægemiddel screening og regenerativ medicin applikationer.

Effektiv neurale differentiering ved hjælp af enkelt cellekultur af humane embryonale stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Menneskelige embryonale stamceller kan induceres til at differentiere i neurale progenitor celler og efterfølgende i neuron astrocyt og oligodendrocyte. Men typekulturmetode for menneskelige embryonale stamceller og deres differentiering i neurale progenitorceller er meget ineffektiv og åben in vivo co-culture system Her præsenterer vi et forbedret og robust kultursystem, der er let skalerbart ved hjælp af høj densitet encelletypekultur med menneskelige embryonale stamceller. Enkelt celletype kultur af menneskelige embryonale stamceller giver et hurtigt og effektivt system til at studere de molekylære mekanismer, der regulerer multi-trins differentiering langs forskellige og forskellige differentierede slægter, herunder neurale progenitor celler og deres efterfølgende differentiering i yderligere neurale slægter.Begynd med at forberede menneskelige embryonale stamceller kvalificeret kælder membran matrix belagt plader. Langsomt tø kælderen membran matrix løsning ved fire grader Celsius i mindst to til tre timer eller natten over. Når den optøes, fortyndes matrixen i kold DMEM/F-12 til 2% godt, og pels hver brønd af en seks-brønd plade med en milliliter af den fortyndede opløsning.Inkuber de belagte plader ved stuetemperatur i mindst tre timer eller ved fire grader Celsius natten over. At passage af feeder-fri kulturer af koloni type H9 menneskelige embryonale stamceller dyrket på kælderen membran matrix, aspirere mediet fra brøndene og vask én gang med en milliliter DPBS. Tilsæt en milliliter Dispase opløsning til hver brønd og inkubere pladen ved 37 grader Celsius i 20 minutter.Fjern Dispase og vask forsigtigt cellerne én gang med to milliliter DMEM/F-12. Efter vask, fjerne medium og tilsæt to milliliter DMEM/F-12 til hver brønd. Løsn forsigtigt kolonierne ved at pipettere op og ned og overføre dem til et 15 milliliterrør.Centrifuge røret ved 370 gange g i to minutter. Aspirere mediet. Derefter adskilles cellepillerne i enkelte celler ved at tilføje to milliliter celleløsning og inkubere dem ved 37 grader Celsius i 10 minutter.Centrifugeringsopløsningen gentages, og afmonteres. Resuspend cellerne i mTeSR-1 humane ESC medium ved forsigtigt pipettering op og ned. For at tilpasse kolonitypen menneskelige embryonale stamceller til en enkelt celletypekultur, plade ca. 1,5 til to millioner celler i hver brønd af kælderen membran matrix belagt plade i to milliliter mTeSR-1 indeholdende 10 mikromolar ROCK-hæmmer.Efter 24 timer udskiftes mediet med frisk mTeSR-1 uden ROCK-hæmmer. Lad cellerne vokse som en enkelt celletype i tre dage, hvor mediet ændres dagligt. På den fjerde dag skal cellerne adskilles i løsrivelsesopløsningen og omdiske dem som tidligere beskrevet.Efter resuspending og inkubering af cellerne i henhold til manuskriptet retninger, overføre de små embryonale organer til en 15 milliliter rør, lad dem bosætte sig til bunden, og forsigtigt fjerne mediet med en pipette. Overfør dem til EB medium og give dem mulighed for at udvide i lav vedhæftet fil retter i syv dage. For at fremkalde neurale progenitor celle eller NPC differentiering, dissociate enkelt celle type menneskelige embryonale stamceller med en milliliter løsrivelse løsning og inkubere dem ved 37 grader Celsius i 10 minutter.Centrifuge cellerne i to minutter ved 370 gange g. Fjern afmontereopløsningen supernatant. Derefter resuspend cellerne i DMEM/F-12.Plade cellerne på en kælder membran matrix belagt seks-brønd plade på en tæthed på to gange 10 til den femte celler pr brønd i to milliliter mTeSR-1 med 10 micromolar ROCK hæmmer. Efter 24 timer erstattes kulturmediet med neuralinduktionsmedium suppleret med et mikromolar Dorsomorphin og fem mikromolar SB431542. Skift mediet hver anden dag i løbet af de første fire dage af neurale induktion, så hver dag indtil sammenløb er nået på dag syv.Efter syv dages neural induktion, adskille cellerne ved at tilføje en milliliter udstationering løsning og inkubere dem i 10 minutter ved 37 grader Celsius. Centrifuge cellerne ved 370 gange g og fjern løsrivelsesopløsningen supernatant. Tilføj en milliliter NPC ekspansionsmedium og forsigtigt pipette cellerne op og ned til resuspend.Derefter plade en gange 10 til den femte celler pr brønd i to milliliter NPC ekspansionsmedium på kælderen membran matrix belagt seks-brønd plader. Passage cellerne efter behov, når kulturer når 90% sammenløbet tilføje 10 mikromolar ROCK hæmmer i løbet af de første tre til fire passager. Skift mediet hver anden dag under udvidelsen.For at forberede PLO laminin-belagte plader, fortyndes PLO lageropløsningen i PBS eller vand til en endelig koncentration på 10 mikrogram pr. milliliter, bland godt, og pels derefter hver brønd af en seks-brøndplade med en milliliter af opløsningen. Inkuber pladerne i mindst to timer ved 37 grader Celsius eller natten over ved fire grader Celsius. Dernæst vaskes hver brønd med PBS og umiddelbart efter pels hver brønd med en milliliter laminin opløsning udarbejdet i henhold til manuskriptet retninger.Hold pladerne på fire grader Celsius i op til en uge. For at differentiere NPC'er i dopaminerge neuroner skal cellerne i PLO laminin-belagte retter i NPC-ekspansionsmedium med en tæthed på ca. 50% efter 24 timer, ændre mediet til DA1 og ændre mediet hver anden dag derefter. Til passage kulturer, når de når sammenløbet, adskille cellerne med en milliliter udstationering løsning og inkubere dem i 10 minutter ved 37 grader Celsius.Derefter centrifuge dem ved 370 gange g og fjern løsrivelsesopløsningen supernatant. Cellerne opslævens i en milliliter DA1-medium og plade en gange 10 til de femte celler i to milliliter medium på PLO laminin-belagte seks-brøndplader. Hvis du vil differentiere NPC'erne i astrocytter, skal cellerne på PLO laminin-pladerne og NPC-udvidelsesmediet med en massetæthed på 50 % ændre mediet til astrocytmediet efter 24 timer og passage af cellerne som tidligere beskrevet.Når koloni type menneskelige embryonale stamceller blev tilpasset til den enkelt celle type kultur, blev det konstateret, at cellerne var i stand til at blive opretholdt på høj tæthed, så let og effektivt subkultureret, når sammenløbet blev nået. Disse celler bevarede cellecyklusegenskaberne, der er typiske for embryonale stamceller af kolonitypen, såsom en kort G1-fase og en høj andel af celler i S-fasen. Kvantitativ PCR-analyse bekræftede også, at de udtrykker ESC-markører på et niveau, der kan sammenlignes med niveauet for kolonitypeceller.Desuden blev det vist, at encellede menneskelige embryonale stamceller var i stand til at danne embryoid organer, der indeholder celler fra alle tre kimlag:endoderm, mesoderm, og ectoderm. Det blev derefter påvist, at encellede embryonale stamceller effektivt differentieret i NPC'er som angivet ved tab af typisk human embryonal stamcellemorfologi og udseende af NPC morfologi. Differentiering blev understøttet af det øgede udtryk for signatur NPC-markører og bekræftet af immunstaining og FACS-analyse.Den samme analyse viste også, at mere end 90% af cellerne farves positiv for SOX1, PAX6 og NCAM proteiner. Endvidere var de afledte NPC'er i stand til at differentiere sig til dopaminerge neuroner og astrocytter som angivet ved fremkomsten af karakteristiske morfologier og ekspression af afstamningsspecifikke markører. Når man forsøger denne procedure, er det vigtigt at plade de menneskelige embryonale stamceller med høj tæthed for at opretholde en sund, udifferentieret menneskelige embryonale stamceller kultur.Denne protokol giver en platform for enkel, robust og skalerbar produktion af stamfader og differentieret celle, der vil være skalerbar til grundlæggende undersøgelse, narkotika skærm, og anvendelse i neurodegenerative medicin.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Neural Differentiering af Mouse Embryonale stamceller i Serumfrit monolagskultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

En hurtig og effektiv metode til rensning af endoderm celler Genereret fra menneskelige embryonale stamceller

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Dyrkning Menneskelig pluripotente og neurale stamceller i en Lukket Cell Culture System for Basic og Prækliniske Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk forordning af Cardiac Differentiering af embryonale stamceller og væv

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storstilet produktion af cardiomyocytter fra menneskelige pluripotente stamceller Ved hjælp af en meget reproducerbar lille molekyle-Based Differentiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effektiv Differentiering af pluripotente stamceller til NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pankreatisk progenitorer

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Analyse af retinoidsyre-induceret Neural Differentiation af muse embryonale stamceller i to og tre-dimensionelle embryoide legemer

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hurtig, instrueret differentiering af retinale Pigment epitel celler fra menneskelige embryonale eller induceret pluripotente stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt zebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv og skalerbar styret differentiering af klinisk kompatibel hornhinde Limbal epitelial stamceller fra humane pluripotente stamceller

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...