Name: efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Nous remercions le Dr Carl D. Bortner (NIEHS) pour son aide dans l'analyse du FACS. Cette recherche a été soutenue par le Programme de recherche intra-muros de l'Institut national des sciences de la santé environnementale, les National Institutes of Health, Z01-ES-101585 à amJ.

1. Préparation des plaques enduites de matrice de membrane de sous-sol hESC-qualifiées
<ol><li>Décongeler lentement la membrane de membrane du sous-sol qualifiée par le HESC (voir Table of Materials)solution à 4 oC pendant au moins 2 à 3 h ou pendant la nuit pour éviter la formation d'un gel.</li>
	<li>Pour préparer les plaques recouvertes de matrice de membrane de sous-sol, diluez la matrice dans le DMEM/F12 froid à une concentration finale de 2%. Bien mélanger et enrober chaque puits d'une ...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Rosler, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions.">Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).</li><li>Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+xeno-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).</li><li>Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Characterization and culture of human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+derivation+of+primitive+neural+stem+cells+and+generation+of+brain+subtype+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).</li><li>Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Neurogenesis+in+the+Hippocampus:+From+Stem+Cells+to+Behavior.">Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior.</a> Cell. 167 (4), 897-914 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative.">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).</li><li>Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clump+passaging+and+expansion+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+on+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells.">Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-colony+type+monolayer+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).</li><li>Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-myosin+contractility+is+responsible+for+the+reduced+viability+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).</li><li>Ohgushi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+and+cell+state+responsible+for+dissociation-induced+apoptosis+in+human+pluripotent+stem+cells.">Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).</li><li>Pakzad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+a+ROCK+inhibitor+in+extracellular+matrix+supports+more+undifferentiated+growth+of+feeder-free+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+upon+passaging.">Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Jeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLIS3+Transcriptionally+Activates+WNT+Genes+to+Promote+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+Posterior+Neural+Progenitors.">GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors.</a> Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+with+biological+and+epigenetic+characteristics+similar+to+those+of+mouse+ESCs.">Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).</li><li>Saha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-engineered+substrates+for+improved+human+pluripotent+stem+cell+culture+under+fully+defined+conditions.">Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).</li><li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+small+molecule+inhibitor+cocktail+supports+long-term+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells.">An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells.</a> Nature Communications. 2, 167 (2011).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+a+core+signaling+regulatory+mechanism+for+pluripotent+stem+cell+survival+and+self-renewal+by+small+molecules.">Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible,+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pure+and+expandable+PSA-NCAM-positive+neural+precursors+from+human+ESC+and+iPSC-derived+neural+rosettes.">Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes.</a> PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).</li><li>Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+FGF2+and+BMP+controls+the+self-renewal,+dormancy+and+differentiation+of+rat+neural+stem+cells.">Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).</li><li>Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+that+induces+human+embryonic+stem+cells+to+differentiate+into+neural+cells+in+vitro.">An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro.</a> Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li></ol>

Des méthodes évolutives et efficaces pour la différenciation des HESC en diverses lignées et la génération d'un nombre suffisant de cellules différenciées sont des critères importants pour le dépistage des médicaments et la thérapie par cellules souches. Diverses méthodes de passage unicellulaire ont été publiées, dans lesquelles les cellules sont cultivées en présence d'inhibiteur syUP Ou d'autres petites molécules pour améliorer la survie, mais les produits finaux de ces méthodes de culture sont le...

Les cellules souches embryonnaires humaines (HESC) ont le potentiel de se différencier en trois couches germinales primaires, qui se différencient ensuite en diverses lignées cellulaires progénitrices multipotentes. Ces lignées donnent par la suite naissance à tous les types de cellules dans le corps humain. Les systèmes de culture hESC in vitro ont transformé la capacité d'étudier le développement embryonnaire humain et ont servi d'outil précieux pour obtenir de nouvelles connaissances sur la façon dont ces processus sont réglementés aux niveaux biologique et moléculaire. De même, les études sur les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) générées par la reprogrammation de cellules somatiques isolées de patients humains fournissent de nouvelles informations sur diverses maladies. En outre, l'ancêtre et les cellules différenciées dérivées des HESC peuvent être utiles pour la recherche impliquant la thérapie de cellules souches et le dépistage de drogue1,2,3,4.
Les hESC peuvent être induits pour se différencier en cellules progénitrices neurales (PNJ), qui sont des cellules multipotentielles avec une capacité d'auto-renouvellement étendue. Par la suite, ces cellules peuvent être différenciées en neurones, astrocytes, et oligodendrocytes5,6. Les PNJ offrent également un système cellulaire pour les études in vitro de la biologie neurodéveloppementale et de diverses maladies neurologiques. Cependant, les méthodes actuelles de culture de type colonie impliquant les HESC et leur différenciation en PNJ sont inefficaces et impliquent souvent la coculture ainsi que le corps embryonnaire (EB) et la formation de rosette5,7,8,9. Ces protocoles présentent des taux de survie plus faibles et une différenciation spontanée et prennent plus de temps.
Présenté ici est un système de culture amélioré et robuste qui est facilement évolutif et utilise la culture de type unicellulaire de haute densité de hESCs10. L'inclusion de l'inhibiteur de Roh-kinase (ROCK) a contribué à l'efficacité de survie sensiblement améliorée pendant la culture de type de cellule simple de hESC10,11,12,13,14. Dans ce système de culture, les HESC peuvent être facilement entretenus et étendus. En outre, le protocole présente une méthode efficace pour générer des PNJ à partir de la culture de type unicellulaire des HESC, qui permet la production de PNJ très purs. Inhibition des voies de signalisation BMP/TGMD/activine avec des inhibiteurs ALK induisent efficacement la différenciation des HCES de type unicellulaire en PNJ15,16, qui peuvent alors être induits à se différencier en lignées neuronales fonctionnelles, telles que les neurones dopaminergiques et les astrocytes.
En résumé, le protocole de culture de type unicellulaire utilisant les CSSH offre un modèle attrayant pour étudier la différenciation de ces cellules en différentes lignées, y compris les PNJ. Ce protocole est facilement évolutif et donc adapté pour générer des cellules pour la recherche impliquant la thérapie régénérative et le dépistage des médicaments.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm m-dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>338-AC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (-Vit A)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z100065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>DAMON/ICE</td>
			<td>428-6759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS 10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cell freezing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-16A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF8</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1569601</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine supplement, 100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 (WA09) human embryonic stem cell line</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin b-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hESC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHH</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z200617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemdiff Neural Progenitor medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5833</td>
			<td>NPC expansion medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells

La différenciation in vitro des cellules souches embryonnaires humaines (HESC) a transformé la capacité d'étudier le développement humain à la fois aux niveaux biologique et moléculaire et a fourni des cellules pour une utilisation dans des applications régénératrices. Les approches standard pour la culture hESC utilisant la culture de type colonie pour maintenir les HESC indifférenciés et le corps embryonnaire (EB) et la formation de rosette pour la différenciation en différentes couches germinales sont inefficaces et prennent du temps. Présenté ici est une méthode de culture unicellulaire en utilisant hESCs au lieu d'une culture de type colonie. Cette méthode permet le maintien des caractéristiques des HESC indifférenciés, y compris l'expression de marqueurs hESC à des niveaux comparables aux HESC de type colonie. En outre, le protocole présente une méthode efficace pour la génération de cellules progénitrices neurales (NPC) à partir de hESCs de type unicellulaire qui produit des PNJ dans un délai de 1 semaine. Ces cellules expriment fortement plusieurs gènes de marqueur de PNJ et peuvent se différencier en divers types de cellules neurales, y compris les neurones dopaminergiques et les astrocytes. Ce système de culture unicellulaire pour les HESC sera utile pour étudier les mécanismes moléculaires de ces processus, les études de certaines maladies et les écrans de découverte de médicaments.

Présenté ici est un protocole amélioré pour le maintien et l'expansion de la culture de type unicellulaire des HESC et leur différenciation efficace en cellules progénitrices neurales, qui se différencie par la suite en diverses lignées neuronales en aval, y compris les neurones dopaminergiques et les astrocytes.
Les images de contraste de phase représentative montrent la morphologie cellulaire à différentes étapes au cours de l'adaptation des HESC de type colonie à la culture de ...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Présenté ici est un protocole pour la génération d'une culture unicellulaire des cellules souches embryonnaires humaines et leur différenciation ultérieure en cellules progénitrices neurales. Le protocole est simple, robuste, évolutif et adapté aux applications de dépistage des médicaments et de médecine régénérative.

Différenciation neuronale efficace à l'aide de la culture monocellulaire des cellules souches embryonnaires humaines

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Les cellules souches embryonnaires humaines peuvent être induites pour se différencier en cellules progénitrices neurales et par la suite en astrocytes neuronaux et oligodendrocytes. Cependant, méthode de culture de type pour les cellules souches embryonnaires humaines et leur différenciation en cellules progénitrices neurales sont très inefficaces et ouvert in vivo système de co-culture Ici, nous présentons un système de culture améliorée et robuste qui est facilement évolutif en utilisant la culture de type cellulaire unique à haute densité avec des cellules souches embryonnaires humaines. La culture de type cellulaire unique des cellules souches embryonnaires humaines fournit un système rapide et efficace pour étudier les mécanismes moléculaires qui régulent la différenciation en plusieurs étapes le long de lignées différentes et distinctes différenciées, y compris les cellules progénitrices neurales et leur différenciation ultérieure en lignées neuronales supplémentaires.Commencez par préparer des plaques enduites de membrane de sous-sol qualifiées de cellules souches embryonnaires humaines. Décongeler lentement la solution matricielle membranaire du sous-sol à quatre degrés Celsius pendant au moins deux à trois heures ou toute la nuit. Une fois décongelée, diluer la matrice dans le froid DMEM/F-12 à 2%mélanger bien, et enrober chaque puits d’une plaque de six puits avec un millilitre de la solution diluée.Incuber les plaques enduites à température ambiante pendant au moins trois heures ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour passer les cultures sans mangeoire des cellules souches embryonnaires humaines de type H9 cultivées sur la matrice membranaire du sous-sol, aspirez le milieu des puits et lavez-les une fois avec un millilitre de DPBS. Ajouter un millilitre de solution Dispase à chaque puits et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.Retirer le Dispase et laver délicatement les cellules une fois avec deux millilitres de DMEM/F-12. Après le lavage, retirer le milieu et ajouter deux millilitres de DMEM/F-12 à chaque puits. Détachez doucement les colonies en les détachant de haut en bas et transférez-les dans un tube de 15 millilitres.Centrifuger le tube à 370 fois g pendant deux minutes. Aspirer le milieu. Dissociez ensuite les granulés cellulaires en cellules individuelles en ajoutant deux millilitres de solution de détachement cellulaire et en les incubant à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.Répétez la centrifugation et retirez la solution de détachement. Resuspendez les cellules dans mTeSR-1 milieu esc humain en pipetting doucement de haut en bas. Pour adapter les cellules souches embryonnaires humaines de type colonie à une seule culture de type cellulaire, plaquez environ 1,5 à deux millions de cellules dans chaque puits de la plaque enduite de matrice membranaire du sous-sol en deux millilitres de mTeSR-1 contenant 10 inhibiteurs rock micromolaires.Après 24 heures, remplacer le milieu par du mTeSR-1 frais sans inhibiteur rock. Permettre aux cellules de se développer comme un seul type de cellule pendant trois jours en changeant le milieu par jour. Le quatrième jour, dissocier les cellules dans la solution de détachement et les re plaquer comme décrit précédemment.Après avoir résuspendé et incubé les cellules selon les instructions manuscrites, transférez les petits corps embryonnaires dans un tube de 15 millilitres, laissez-les s’installer au fond et retirez doucement le milieu à l’aide d’une pipette. Transférez-les dans le milieu EB et laissez-les se développer dans des plats à faible fixation pendant sept jours. Pour induire la différenciation des cellules progénitrices neurales ou des PNJ, dissociez les cellules souches embryonnaires humaines de type cellule unique avec un millilitre de solution de détachement et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.Centrifuger les cellules pendant deux minutes à 370 fois g. Retirez la solution de détachement supernatant. Puis résuspendez les cellules dans DMEM/F-12.Plaquez les cellules sur une matrice membranaire du sous-sol recouverte d’une plaque de six puits à une densité de deux fois 10 à la cinquième cellule par puits en deux millilitres de mTeSR-1 avec inhibiteur rock de 10 micromolaires. Après 24 heures, remplacer le milieu de culture par un milieu d’induction neural complété par un micromolaire Dorsomorphin et cinq micromolaireS SB431542. Changez le milieu tous les deux jours pendant les quatre premiers jours de l’induction neuronale, puis tous les jours jusqu’à ce que la confluence soit atteinte au septième jour.Après sept jours d’induction neuronale, dissocier les cellules en ajoutant un millilitre de solution de détachement et en les incubant pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Centrifugez les cellules à 370 fois g et retirez le supernatant de solution de détachement. Ajouter un millilitre de milieu d’expansion NPC et pipette doucement les cellules de haut en bas pour résuspendre.Puis plaque une fois 10 à la cinquième cellules par puits en deux millilitres de milieu d’expansion NPC sur la matrice membranaire du sous-sol enduit plaques de six puits. Passer les cellules au besoin lorsque les cultures atteignent 90% confluency ajoutant 10 inhibiteurs rock micromolaire au cours des trois à quatre premiers passages. Changez le milieu tous les deux jours pendant l’expansion.Pour préparer les plaques recouvertes de laminine de l’OLP, diluer la solution de stock de l’OLP dans le PBS ou l’eau à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre, bien mélanger, puis enrober chaque puits d’une plaque de six puits d’un millilitre de la solution. Incuber les plaques pendant au moins deux heures à 37 degrés Celsius ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez chaque puits avec PBS et immédiatement après le revêtement de chaque puits avec un millilitre de solution de laminine préparé selon les instructions manuscrites.Gardez les plaques à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Pour différencier les PNJ en neurones dopaminergiques, plaquez les cellules dans les plats recouverts de laminine de l’OLP dans le milieu d’expansion du PNJ à une densité d’environ 50 % après 24 heures, changez le milieu en DA1 et changez le milieu tous les deux jours par la suite. Pour passer les cultures lorsqu’elles atteignent la confluence, dissocier les cellules avec un millilitre de solution de détachement et les incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius.Puis centrifugez-les à 370 fois g et retirez la solution de détachement supernatant. Resuspendez les cellules en un millilitre de MILIEU DA1 et plaquez une fois 10 à la cinquième cellule en deux millilitres de milieu sur les plaques de six puits recouvertes de laminine de l’OLP. Pour différencier les PNJ en astrocytes, plaquez les cellules sur les plaques de laminine de l’OLP et le milieu d’expansion du PNJ à une densité de 50 % de changer le milieu en milieu d’astrocyte après 24 heures, et passer les cellules comme décrit précédemment.Lorsque les cellules souches embryonnaires humaines de type colonie ont été adaptées à la culture de type cellulaire unique, il a été constaté que les cellules étaient capables d’être maintenues à haute densité, puis facilement et efficacement sous-cultures lorsque la confluence a été atteinte. Ces cellules ont conservé les caractéristiques du cycle cellulaire typiques des cellules souches embryonnaires humaines de type colonie, comme une courte phase G1 et une forte proportion de cellules en phase S. L’analyse quantitative du PCR a également confirmé qu’ils expriment des marqueurs ESC à des niveaux comparables à ceux des cellules de type colonie.En outre, il a été démontré que les cellules souches embryonnaires humaines à cellule unique étaient capables de former des corps embryoïdes contenant des cellules des trois couches germinales : endoderm, mésoderm et ectoderm. Il a ensuite été démontré que les cellules souches embryonnaires humaines de type cellule unique se distinguaient efficacement en PNJ, comme l’indique la perte de la morphologie des cellules souches embryonnaires humaines typiques et l’apparition de la morphologie du PNJ. La différenciation a été soutenue par l’expression accrue des marqueurs de PNJ de signature et confirmée par l’immunostaining et l’analyse de FACS.La même analyse a également montré que plus de 90% des cellules tachées positives pour SOX1, PAX6, et les protéines NCAM. En outre, les PNJ dérivés ont pu se différencier en neurones dopaminergiques et astrocytes comme indiqué par l’apparition des morphologies caractéristiques et l’expression des marqueurs spécifiques à la lignée. Lors de la tentative de cette procédure, il est essentiel de plaquer les cellules souches embryonnaires humaines à haute densité afin de maintenir une culture saine et indifférenciée des cellules souches embryonnaires humaines.Ce protocole fournit une plate-forme pour la production simple, robuste, et évolutive de l’ancêtre et de la cellule différenciée qui sera évolutive pour l’étude de base, l’écran de drogue, et l’application dans la médecine neurodegenerative.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Différenciation neurale des souris de cellules souches embryonnaires dans le sérum sans culture monocouche

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Recherche

Biologie du développement

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Une méthode rapide et efficace pour la purification des cellules endoderme Généré à partir d&#39;embryons humains Cellules souches

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

La culture pluripotentes humaines et cellules souches neurales dans un système de culture cellulaire clos pour la recherche fondamentale et préclinique

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Régulation épigénétique de Cardiac Différenciation des cellules et tissus souches embryonnaires

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Production à grande échelle de cardiomyocytes à partir pluripotentes humaines cellules souches en utilisant un petit protocole Différenciation Molecule-Based hautement reproductible

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; pancréatiques progéniteurs

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

L&#39;analyse des rétinoïque induite par l&#39;acide Neuro-Différenciation de cellules souches embryonnaires de souris en deux et trois dimensions corps embryoïdes

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion cellule unique chez le poisson zèbre Intact de la vie

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Efficace et évolutive différenciation dirigée de cliniquement compatibles cornéenne limbique épithéliales cellules souches à partir des cellules souches pluripotentes humaines

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...