Name: efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-01-18T13:00:00
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Wir danken Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) für seine Unterstützung bei der FACS-Analyse. Diese Forschung wurde durch das Intramural Research Program des National Institute of Environmental Health Sciences, der National Institutes of Health, Z01-ES-101585 bis AMJ unterstützt.

1. Herstellung von hESC-qualifizierten Basement Membrane Matrix-beschichteten Platten
<ol><li>Langsam die hESC-qualifizierte Kellermembranmatrix (siehe Materialtabelle)bei 4 °C mindestens 2–3 h oder über Nacht auftauen, um die Bildung eines Gels zu vermeiden.</li>
	<li>Zur Herstellung von Kellermembran-Matrix-beschichteten Platten die Matrix in kalter DMEM/F12 auf eine Endkonzentration von 2% verdünnen. Gut mischen und jeden Brunnen einer 6-Well-Platte mit 1 ml der verdünnten Matrixlösung beschi...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Rosler, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions.">Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).</li><li>Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+xeno-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).</li><li>Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Characterization and culture of human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+derivation+of+primitive+neural+stem+cells+and+generation+of+brain+subtype+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).</li><li>Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Neurogenesis+in+the+Hippocampus:+From+Stem+Cells+to+Behavior.">Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior.</a> Cell. 167 (4), 897-914 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative.">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).</li><li>Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clump+passaging+and+expansion+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+on+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells.">Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-colony+type+monolayer+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).</li><li>Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-myosin+contractility+is+responsible+for+the+reduced+viability+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).</li><li>Ohgushi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+and+cell+state+responsible+for+dissociation-induced+apoptosis+in+human+pluripotent+stem+cells.">Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).</li><li>Pakzad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+a+ROCK+inhibitor+in+extracellular+matrix+supports+more+undifferentiated+growth+of+feeder-free+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+upon+passaging.">Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Jeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLIS3+Transcriptionally+Activates+WNT+Genes+to+Promote+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+Posterior+Neural+Progenitors.">GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors.</a> Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+with+biological+and+epigenetic+characteristics+similar+to+those+of+mouse+ESCs.">Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).</li><li>Saha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-engineered+substrates+for+improved+human+pluripotent+stem+cell+culture+under+fully+defined+conditions.">Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).</li><li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+small+molecule+inhibitor+cocktail+supports+long-term+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells.">An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells.</a> Nature Communications. 2, 167 (2011).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+a+core+signaling+regulatory+mechanism+for+pluripotent+stem+cell+survival+and+self-renewal+by+small+molecules.">Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible,+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pure+and+expandable+PSA-NCAM-positive+neural+precursors+from+human+ESC+and+iPSC-derived+neural+rosettes.">Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes.</a> PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).</li><li>Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+FGF2+and+BMP+controls+the+self-renewal,+dormancy+and+differentiation+of+rat+neural+stem+cells.">Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).</li><li>Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+that+induces+human+embryonic+stem+cells+to+differentiate+into+neural+cells+in+vitro.">An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro.</a> Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li></ol>

Skalierbare und effiziente Methoden zur Differenzierung von hESCs in verschiedene Linien und die Erzeugung einer ausreichenden Anzahl differenzierter Zellen sind wichtige Kriterien für das Arzneimittelscreening und die Stammzelltherapie. Verschiedene einzellige Passmethoden wurden veröffentlicht, bei denen Zellen in Gegenwart von ROCK-Hemmern oder anderen kleinen Molekülen kultiviert werden, um das Überleben zu verbessern, aber die Endprodukte dieser Kulturmethoden sind Kolonietyp hESCs17...

Menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) haben das Potenzial, sich in die drei primären Keimschichten zu differenzieren, die sich dann in verschiedene multipotente Vorläuferzelllinien differenzieren. Diese Abstammungen führen in der Folge zu allen Zelltypen im menschlichen Körper. In-vitro-hESC-Kultursysteme haben die Fähigkeit, die menschliche embryonale Entwicklung zu untersuchen, verändert und als wertvolles Instrument gedient, um neue Erkenntnisse darüber zu erhalten, wie diese Prozesse auf biologischer und molekularer Ebene reguliert werden. In ähnlicher Weise liefern Studien mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), die aus der Reprogrammierung sammatischer Zellen, die von menschlichen Patienten isoliert wurden, generiert wurden, neue Einblicke in verschiedene Krankheiten. Darüber hinaus können Vorläufer und differenzierte Zellen, die aus hESCs gewonnen werden, für die Forschung mit Stammzelltherapie und Arzneimittelscreening1,2,3,4nützlich sein.
hESCs können induziert werden, um sich in neuronale Vorläuferzellen (NPCs) zu differenzieren, die Multipotentialzellen mit einer umfangreichen Selbsterneuerungskapazität sind. Anschließend können diese Zellen in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten 5,6unterschieden werden. NPCs bieten auch ein zelluläres System für In-vitro-Studien der Neuroentwicklungsbiologie und verschiedeneneurologische Erkrankungen. Die derzeitigen Koloniekulturmethoden, die hESCs und ihre Differenzierung in NPCs beinhalten, sind jedoch ineffizient und beinhalten häufig Kokultur sowie Embryoidenkörper (EB) und Rosettenbildung5,7,8,9. Diese Protokolle weisen niedrigere Überlebensraten und spontane Differenzierung auf und sind zeitaufwändiger.
Hier wird ein verbessertes und robustes Kultursystem vorgestellt, das leicht skalierbar ist und eine einzellige Kultur mit hoher Dichte von hESCs10verwendet. Die Einbeziehung von Rohkinase (ROCK) Inhibitor trug zur deutlich verbesserten Überlebenseffizienz während der einzelzelligen Typkultur von hESC10,11,12,13,14. In diesem Kultursystem können hESCs einfach gewartet und erweitert werden. Darüber hinaus stellt das Protokoll eine effiziente Methode zur Generierung von NPCs aus einer einzelligen Typkultur von hESCs dar, die die Produktion von hochreinen NPCs ermöglicht. Hemmung von BMP/TGF/Activin-Signalwegen mit ALK-Inhibitoren induziert effizient die Differenzierung von einzelligen HESCs in NPCs15,16, die dann induziert werden können, um sich in funktionelle neuroale Leitungen wie dopaminerische Neuronen zu differenzieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Einzelzelltypkulturprotokoll mit hESCs ein attraktives Modell bietet, um die Differenzierung dieser Zellen in verschiedene Linien, einschließlich NPCs, zu untersuchen. Dieses Protokoll ist leicht skalierbar und daher für die Erzeugung von Zellen für die Forschung mit regenerativer Therapie und Arzneimittelscreening geeignet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm m-dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>338-AC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (-Vit A)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z100065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>DAMON/ICE</td>
			<td>428-6759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS 10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cell freezing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-16A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF8</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1569601</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine supplement, 100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 (WA09) human embryonic stem cell line</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin b-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hESC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHH</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z200617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemdiff Neural Progenitor medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5833</td>
			<td>NPC expansion medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells

Die In-vitro-Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) hat die Fähigkeit verändert, die menschliche Entwicklung sowohl auf biologischer als auch auf molekularer Ebene zu untersuchen, und Zellen für den Einsatz in regenerativen Anwendungen bereitgestellt. Standardansätze für die hESC-Kultur, die Koloniekultur verwendet, um undifferenzierte hESCs und embryoiden Körper (EB) und Rosettenbildung zur Differenzierung in verschiedene Keimschichten aufrechtzuerhalten, sind ineffizient und zeitaufwändig. Hier wird eine Einzelzellkulturmethode vorgestellt, die hESCs anstelle einer Koloniekultur verwendet. Diese Methode ermöglicht die Aufrechterhaltung der charakteristischen Merkmale undifferenzierter hESCs, einschließlich der Expression von hESC-Markern auf Ebenen, die mit Kolonietyp-hESCs vergleichbar sind. Darüber hinaus stellt das Protokoll eine effiziente Methode für die Generierung von neuronalen Vorläuferzellen (NPC) aus einzelligen hESCs dar, die NPCs innerhalb einer Woche produziert. Diese Zellen exprimieren in hohem Maße mehrere NPC-Markergene und können sich in verschiedene neuronale Zelltypen differenzieren, einschließlich dopaminergen Neuronen und Astrozyten. Dieses einzellige Kultursystem für hESCs wird nützlich sein, um die molekularen Mechanismen dieser Prozesse, Studien zu bestimmten Krankheiten und Drogenentdeckungs-Screens zu untersuchen.

Hier wird ein verbessertes Protokoll zur Erhaltung und Erweiterung der einzelligen Typkultur von hESCs und deren effizienter Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt, die sich anschließend in verschiedene nachgeschaltete neuronale Linien differenzieren. einschließlich dopaminergen Neuronen und Astrozyten.
Repräsentative Phasenkontrastbilder zeigen die Zellmorphologie in verschiedenen Schritten während der Anpassung von Kolonietyp hESCs an die einzellige Typkultur (<strong ...

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Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer einzelzelligen Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen und deren anschließende Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt. Das Protokoll ist einfach, robust, skalierbar und eignet sich für Arzneimittelscreenings und anwendungen in der regenerativen Medizin.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Menschliche embryonale Stammzellen können induziert werden, um sich in neuronale Vorläuferzellen und anschließend in Neuronenastrozyten und Oligodendrozyten zu differenzieren. Die Typkulturmethode für menschliche embryonale Stammzellen und ihre Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen sind jedoch sehr ineffizient und offen in vivo Kokultursystem Hier präsentieren wir ein verbessertes und robustes Kultursystem, das mit einer hochdichten Einzelzellkultur mit menschlichen embryonalen Stammzellen leicht skalierbar ist. Die Einzelzelltypkultur menschlicher embryonaler Stammzellen bietet ein schnelles und effizientes System zur Untersuchung der molekularen Mechanismen, die die mehrstufige Differenzierung entlang verschiedener und unterschiedlicher differenzierter Linien regulieren, einschließlich neuronaler Vorläuferzellen und ihrer anschließenden Differenzierung in zusätzliche neuronale Linien.Beginnen Sie mit der Vorbereitung menschlicher embryonaler Stammzellen qualifizierter Kellermembranmatrix-Beschichtete Platten. Die Kellermembranmatrixlösung bei vier Grad Celsius mindestens zwei bis drei Stunden oder über Nacht langsam auftauen. Beim Auftauen die Matrix in kaltem DMEM/F-12 bis 2% gut mischen und jeden Brunnen einer Sechs-Well-Platte mit einem Milliliter der verdünnten Lösung beschichten.Die beschichteten Platten bei Raumtemperatur mindestens drei Stunden oder bei vier Grad Celsius über Nacht inkubieren. Um die feederfreien Kulturen der Kolonie Typ H9 menschliche embryonale Stammzellen auf Kellermembranmatrix wachsen, aspirieren Sie das Medium aus den Brunnen und waschen einmal mit einem Milliliter DPBS. Fügen Sie einen Milliliter Dispase-Lösung zu jedem Brunnen und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten.Entfernen Sie die Dispase und waschen Sie die Zellen einmal mit zwei Milliliter DMEM/F-12. Nach dem Waschen das Medium entfernen und jeweils zwei Milliliter DMEM/F-12 zu jedem Brunnen hinzufügen. Lösen Sie die Kolonien vorsichtig, indem Sie auf und ab pfeifen und in ein 15-Milliliter-Rohr übertragen.Zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 mal g für zwei Minuten. Aspirieren Sie das Medium. Dann dissoziieren Sie die Zellpellets in einzelne Zellen, indem Sie zwei Milliliter Zellablösung hinzufügen und sie bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren.Wiederholen Sie die Zentrifugation und entfernen Sie die Ablösungslösung. Setzen Sie die Zellen in mTeSR-1 menschliches ESC-Medium durch sanftes Pipettieren nach oben und unten aus. Um die kolonientypisierten menschlichen embryonalen Stammzellen an eine einzelne Zelltypkultur anzupassen, platten etwa 1,5 bis zwei Millionen Zellen in jeden Brunnen der Kellermembranmatrix-beschichteten Platte in zwei Milliliter mTeSR-1 mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren.Ersetzen Sie das Medium nach 24 Stunden ohne ROCK-Hemmer durch frischen mTeSR-1. Lassen Sie die Zellen drei Tage lang als Einzelzellentyp wachsen und das Medium täglich ändern. Am vierten Tag die Zellen in Ablösungslösung dissoziieren und wie zuvor beschrieben neu plattieren.Nach dem Aufsetzen und Inkubieren der Zellen gemäß den Manuskriptanweisungen, übertragen Sie die kleinen embryonalen Körper auf ein 15-Milliliter-Rohr, lassen Sie sie sich auf den Boden setzen und entfernen Sie das Medium vorsichtig mit einer Pipette. Übertragen Sie sie in EB Medium und lassen Sie sie in Low Attachment Geschirr für sieben Tage zu erweitern. Um eine neuronale Vorläuferzelle oder NPC-Differenzierung zu induzieren, dissoziieren Sie die einzelnen zelligen menschlichen embryonalen Stammzellen mit einem Milliliter Ablösungslösung und inkubieren sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Zentrifugieren Sie die Zellen für zwei Minuten bei 370 mal g. Entfernen Sie den Ablösungslösungsüberstand. Setzen Sie dann die Zellen in DMEM/F-12 wieder aus.Die Zellen auf einer Kellermembranmatrix mit einer Dichte von zwei mal 10 bis fünf Zellen pro Brunnen in zwei Milliliterm mTeSR-1 mit 10 mikromolarem ROCK-Inhibitor beschichtet. Ersetzen Sie nach 24 Stunden das Kulturmedium durch ein neuronales Induktionsmedium, ergänzt durch ein Mikromolar Dorsomorphin und fünf Mikromolar SB431542. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag während der ersten vier Tage der neuronalen Induktion, dann jeden Tag, bis der Zusammenfluss an Tag sieben erreicht ist.Nach sieben Tagen neuronaler Induktion dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie einen Milliliter Ablösungslösung hinzufügen und sie 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 370 mal g und entfernen Sie die Ablösungslösung Überstand. Fügen Sie einen Milliliter NPC-Erweiterungsmedium hinzu und pipetten Sie die Zellen vorsichtig nach oben und unten, um sie wieder aufzuhängen.Dann Platte ein mal 10 bis die fünften Zellen pro Brunnen in zwei Milliliter NPC-Ausdehnungsmedium auf der Kellermembran Matrix beschichtet sechs-Well-Platten. Durchfluss der Zellen bei Bedarf, wenn Kulturen 90% Konfluenz erreichen, die 10 mikromolareN ROCK-Inhibitoren während der ersten drei bis vier Passagen hinzufügen. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag während der Erweiterung.Zur Herstellung von PLO-Laminin-beschichteten Platten die PLO-Lagerlösung in PBS oder Wasser auf eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter verdünnen, gut mischen und dann jeden Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte mit einem Milliliter der Lösung beschichten. Die Teller mindestens zwei Stunden bei 37 Grad Celsius oder über Nacht bei vier Grad Celsius bebrüten. Als nächstes waschen Sie jeden Brunnen mit PBS und sofort nach dem Beschichten jeden Brunnen mit einem Milliliter Laminin-Lösung nach den Manuskriptrichtungen vorbereitet.Bewahren Sie die Teller bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius auf. Um NPCs in dopaminerge Neuronen zu differenzieren, die Zellen in PLO-Laminin-beschichteten Schalen in NPC-Erweiterungsmedium mit einer Dichte von ca. 50% nach 24 Stunden zu verschichten, das Medium auf DA1 zu ändern und das Medium danach jeden zweiten Tag zu ändern. Um Kulturen zu durchdringen, wenn sie die Koninfluenza erreichen, dissoziieren Sie die Zellen mit einem Milliliter Ablösungslösung und inkubieren Sie sie für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius.Zentrifugieren Sie sie dann bei 370 mal g und entfernen Sie die Ablösungslösung Überstand. Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter DA1-Medium und Platte ein mal 10 bis fünf In zwei Milliliter Medium auf den PLO-Laminin-beschichteten Sechs-Brunnen-Platten aus. Um die NPCs in Astrozyten zu differenzieren, die Zellen auf den PLO-Lamininplatten und dem NPC-Ausdehnungsmedium mit einer Dichte von 50 % zu verplatten, verändern Sie das Medium zu das Astrozytenmedium nach 24 Stunden und durchgehen die Zellen wie zuvor beschrieben.Als die menschlichen embryonalen Stammzellen des Kolonietyps an die Einzelzelltypkultur angepasst wurden, wurde festgestellt, dass die Zellen mit hoher Dichte gehalten und dann leicht und effizient subkultiviert werden konnten, wenn die Konfluenz erreicht wurde. Diese Zellen behielten die Zellzykluseigenschaften bei, die typisch für menschliche embryonale Stammzellen vom Kolonietyp sind, wie z. B. eine kurze G1-Phase und ein hoher Zellanteil in der S-Phase. Quantitative PCR-Analysen bestätigten auch, dass sie ESC-Marker in Konzentrationen ausdrücken, die mit denen von Kolonie-Typ-Zellen vergleichbar sind.Darüber hinaus wurde gezeigt, dass einzelne menschliche embryonale Stammzellen embryonale Körper bilden konnten, die Zellen aus allen drei Keimschichten enthalten: Endoderm, Mesoderm und Ektoderm. Es wurde dann gezeigt, dass einzelne zelllige menschliche embryonale Stammzellen effizient in NPCs differenziert wurden, wie durch den Verlust der typischen menschlichen embryonalen Stammzellmorphologie und das Auftreten der NPC-Morphologie angezeigt. Die Differenzierung wurde durch die erhöhte Expression von Signatur-NPC-Markern unterstützt und durch Immunfärbung und FACS-Analyse bestätigt.Die gleiche Analyse zeigte auch, dass mehr als 90% der Zellen positiv für SOX1, PAX6 und NCAM-Proteine gefärbt wurden. Darüber hinaus konnten sich die abgeleiteten NPCs in dopaminerge Neuronen und Astrozyten differenzieren, wie durch das Auftreten charakteristischer Morphologien und die Expression von linienspezifischen Markern angezeigt. Bei diesem Versuch ist es wichtig, die menschlichen embryonalen Stammzellen mit hoher Dichte zu plattieren, um eine gesunde, undifferenzierte menschliche embryonale Stammzellkultur zu erhalten.Dieses Protokoll bietet eine Plattform für die einfache, robuste und skalierbare Produktion von Vorläufer und differenzierter Zelle, die für grundlegende Studien, Arzneimittel-Screen und Anwendung in der neurodegenerativen Medizin skalierbar sein wird.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Eine schnelle und effiziente Methode zur Reinigung von Entodermzellen generiert aus humanen embryonalen Stammzellen

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Die Kultivierung humanen pluripotenten und Neurale Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystem für Grund- und Präklinische Forschung

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetische Regulation der Herz Differenzierung von embryonalen Stammzellen und Gewebe

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Vorläufern

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...