Name: efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

אנו מודים לד ר קארל ד. בורטנר על עזרתו בניתוח ה-FACS. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר הפנים של המכון הלאומי למדעי הסביבה, המוסדות הלאומיים לבריאות, Z01-ES-101585 ל AMJ.

1. הכנת ממברדת מרתף מוסמכת-צלחות מצופות
<ol><li>הפשרת לאט את מטריצת קרום המרתף של hESC-מוסמך (ראה טבלת חומרים) ב -4 ° c עבור לפחות 2 – 3 h או לילה כדי למנוע היווצרות של ג'ל.</li>
	<li>כדי להכין ממברדת מרתפים לוחות מצופים, לדלל את המטריצה ב-DMEM קר/F12 2% הריכוז הסופי. מערבבים היטב ומעילים כל באר של 6 היט?...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Rosler, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions.">Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).</li><li>Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+xeno-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).</li><li>Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Characterization and culture of human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+derivation+of+primitive+neural+stem+cells+and+generation+of+brain+subtype+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).</li><li>Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Neurogenesis+in+the+Hippocampus:+From+Stem+Cells+to+Behavior.">Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior.</a> Cell. 167 (4), 897-914 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative.">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).</li><li>Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clump+passaging+and+expansion+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+on+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells.">Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-colony+type+monolayer+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).</li><li>Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-myosin+contractility+is+responsible+for+the+reduced+viability+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).</li><li>Ohgushi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+and+cell+state+responsible+for+dissociation-induced+apoptosis+in+human+pluripotent+stem+cells.">Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).</li><li>Pakzad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+a+ROCK+inhibitor+in+extracellular+matrix+supports+more+undifferentiated+growth+of+feeder-free+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+upon+passaging.">Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Jeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLIS3+Transcriptionally+Activates+WNT+Genes+to+Promote+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+Posterior+Neural+Progenitors.">GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors.</a> Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+with+biological+and+epigenetic+characteristics+similar+to+those+of+mouse+ESCs.">Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).</li><li>Saha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-engineered+substrates+for+improved+human+pluripotent+stem+cell+culture+under+fully+defined+conditions.">Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).</li><li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+small+molecule+inhibitor+cocktail+supports+long-term+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells.">An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells.</a> Nature Communications. 2, 167 (2011).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+a+core+signaling+regulatory+mechanism+for+pluripotent+stem+cell+survival+and+self-renewal+by+small+molecules.">Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible,+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pure+and+expandable+PSA-NCAM-positive+neural+precursors+from+human+ESC+and+iPSC-derived+neural+rosettes.">Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes.</a> PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).</li><li>Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+FGF2+and+BMP+controls+the+self-renewal,+dormancy+and+differentiation+of+rat+neural+stem+cells.">Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).</li><li>Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+that+induces+human+embryonic+stem+cells+to+differentiate+into+neural+cells+in+vitro.">An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro.</a> Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li></ol>

שיטות מדרגי ויעיל עבור הבידול של hESCs לתוך ליננים שונים והדור של מספר מספיק של תאים הבדיל הם קריטריונים חשובים לסינון סמים וטיפול בתאי גזע. שונים של תא יחיד שיטות העברת פורסמו, שבו התאים הם מתורבתים בנוכחות של מעכב סלע או מולקולות קטנות אחרות כדי לשפר את ההישרדות, אבל המוצרים הסופיים של שיטו...

האדם תאים גזע עובריים (hESCs) יש את הפוטנציאל להבדיל לתוך שלוש שכבות הנבט הראשי, אשר לאחר מכן להבדיל לתוך שונים מרובי עוצמה מחולל שורה של תאים. לאחר שנים אלה מעניקים את כל סוגי התאים בגוף האדם. ב מערכות התרבות hESC הפכה את היכולת ללמוד פיתוח עובריים האדם שימשו ככלי רב ערך לקבלת תובנות חדשות לגבי איך תהליכים אלה מוסדרים ברמות הביולוגי והמולקולרי. באופן דומה, מחקרים של תאי גזע פלוריטי המושרה (iPSCs) שנוצרו מתאים סומלי מחדש מבודדים מחולים אנושיים לספק תובנות הרומן לתוך מחלות שונות. בנוסף, התאים מחולל והבדיל שנגזר מ hESCs יכול להיות שימושי עבור מחקר מעורבים טיפול בתאי גזע והקרנת סמים1,2,3,4.
hESCs יכול להיות המושרה להבדיל לתוך תאים מחולל קדמון (NPCs), שהם תאים פוטנציאליים רב עם קיבולת עצמית לחידוש עצמי. לאחר מכן, תאים אלה יכולים להיות מובחנים לנוירונים, astrocytes, ו oligodendrocytes הפוך5,6. NPCs מציעים גם מערכת סלולרית ללימודי חוץ גופית של ביולוגיה נוירו-התפתחותית ומחלות נוירולוגיות שונות. עם זאת, המושבה הנוכחית סוג שיטות תרבות מעורבים hESCs והבידול שלהם לתוך npcs הם יעילים ולעתים קרובות כרוכים התרבות, כמו גם embryoid הגוף (EB) ו שושנת המערך5,7,8,9. פרוטוקולים אלה מציגים שיעורי הישרדות נמוכים יותר והבחנה ספונטנית והיא צורכת זמן רב יותר.
מוצג כאן היא מערכת תרבותית משופרת ואיתנה, כי הוא מדרגי בקלות ומשתמש בצפיפות גבוהה תא בודד התרבות סוג של hESCs10. הכללת roh-קינאז (רוק) מעכב תרמו באופן משמעותי יעילות ההישרדות במהלך התרבות סוג תא יחיד של hesc10,11,12,13,14. במערכת זו של התרבות, hESCs ניתן לשמור ולהרחיב בקלות. בנוסף, הפרוטוקול מציג שיטה יעילה להפקת npcs מתרבות סוג תא בודד של hESCs, אשר מאפשר את הייצור של npcs טהור מאוד. עיכוב של BMP/TGFβ/פעילות מסלולים איתות עם מעכבי האלק ביעילות לגרום בידול של תא יחיד סוג hESCs לתוך npcs15,16, אשר לאחר מכן יכול להיות המושרה להבדיל לתוך שורה עצבית תפקודית, כגון נוירונים מתוגיים ו astrocytes.
לסיכום, פרוטוקול התרבות סוג תא בודד באמצעות hESCs מציע מודל אטרקטיבי ללמוד את הבידול של תאים אלה לתוך הגילאים שונים, כולל NPCs. פרוטוקול זה הוא מדרגי בקלות ולכן מתאים ליצירת תאים למחקר מעורבים טיפול משובי והקרנת סמים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm m-dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>338-AC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (-Vit A)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z100065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>DAMON/ICE</td>
			<td>428-6759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS 10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cell freezing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-16A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF8</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1569601</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine supplement, 100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 (WA09) human embryonic stem cell line</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin b-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hESC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHH</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z200617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemdiff Neural Progenitor medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5833</td>
			<td>NPC expansion medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells

בבידול חוץ גופית של תאי גזע האדם העובריים (hESCs) הפכה את היכולת ללמוד התפתחות אנושית על רמות ביולוגיות ומולקולרי וסיפק תאים לשימוש ביישומים משובי. גישות סטנדרטיות עבור תרבות hESC באמצעות תרבות סוג המושבה כדי לשמור על מובחן hESCs ו embryoid הגוף (EB) ו שושנת היווצרות עבור בידול לתוך שכבות נבט שונות הם יעילים זמן רב. המוצג כאן הוא שיטת תרבות חד-תאית באמצעות hESCs במקום תרבות מסוג מושבה. שיטה זו מאפשרת תחזוקה של התכונות האופייניות של hESCs מובחן, כולל ביטוי של סמנים hESC ברמות הדומות לסוג המושבה hESCs. בנוסף, הפרוטוקול מציג שיטה יעילה תא מחולל קדמון (NPC) הדור מסוג תא יחיד hESCs המייצרת NPCs בתוך שבוע 1. תאים אלה מאוד לבטא מספר הגנים NPC סמן והוא יכול להבדיל לתוך סוגים שונים של תאים עצביים, כולל נוירונים ומיאסטאלוגיים ו astrocytes. זו מערכת התרבות היחידה עבור hESCs יהיה שימושי בחקירת מנגנונים מולקולריים של תהליכים אלה, מחקרים של מחלות מסוימות, מסכי גילוי סמים.

מוצג כאן הוא פרוטוקול משופר עבור תחזוקה והתרחבות של תרבות אחת סוג תא של hESCs והבידול יעיל שלהם לתוך תאים מחולל קדמון, אשר מבדיל לאחר מכן לתוך שונים במורד הזרם העצבי, כולל נוירונים.
תמונות חדות שלב מייצגים מציגות מורפולוגיה של תאים בשלבים שונים במהלך ההסתגלות של סוג המושבה hESCs ...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור של התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים והבידול שלהם לתוך תאים מחולל קדמון. הפרוטוקול הוא פשוט, חסון, מדרגי, ומתאים לסינון סמים וליישומים רפואת התחדשות.

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

תאי גזע עובריים אנושיים יכולים להיות מושרה כדי להבדיל לתוך תאים מולדים עצביים ולאחר מכן לתוך אסטרוציטים נוירון ו oligodendrocyte. עם זאת, שיטת תרבות סוג עבור תאי גזע עובריים אנושיים וההתבוללות שלהם לתאי ניוון עצביים הם מאוד לא יעילים ופתוחים במערכת התרבות השותף vivo כאן אנו מציגים מערכת תרבות משופרת וחזקה כי הוא מדרג בקלות באמצעות צפיפות גבוהה סוג תא יחיד תרבות עם תאי גזע עובריים אנושיים. תרבות סוג תא יחיד של תאי גזע עובריים אנושיים מספקת מערכת מהירה ויעילה לחקר המנגנונים המולקולריים המווסתים את הבידול הרב-שלבי לאורך שושלת שושלת שונה ומובחנת, כולל תאי ניוון עצביים ובידולם לאחר מכן לשושלת עצבית נוספת.התחל על ידי הכנת תא גזע עוברי אנושי מוסמך מטריצת קרום מרתף מצופה צלחות. להפשיר לאט את פתרון מטריצת קרום המרתף בארבע מעלות צלזיוס לפחות שעתיים עד שלוש שעות או לילה. כאשר מופשרים, מדללים את המטריצה ב- DMEM/F-12 קר עד 2%, ומערבבים היטב כל באר של צלחת שש בארות עם מיליליטר אחד של הפתרון המדולל.דגירה צלחות מצופות בטמפרטורת החדר לפחות שלוש שעות או בארבע מעלות צלזיוס לילה. כדי לעבור את התרבויות נטולות המאכילים של תאי גזע עובריים אנושיים מסוג H9 שגדלו על מטריצת קרום המרתף, שאפו את המדיום מה בארות ושטפו פעם אחת עם מיליליטר אחד של DPBS. מוסיפים מיליליטר אחד של פתרון Dispase לכל באר ו דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.הסר את Dispase בעדינות לשטוף את התאים פעם אחת עם שני מיליליטר של DMEM / F-12. לאחר הכביסה, להסיר את המדיום ולהוסיף שני מיליליטר של DMEM / F-12 לכל באר. ניתוק עדין של המושבות על ידי צינור למעלה ולמטה והעברתן לצינור של 15 מיליליטר.צנטריפוגה הצינור ב 370 פעמים g במשך שתי דקות. שאף את המדיום. לאחר מכן לנתק את כדורי התא לתאים בודדים על ידי הוספת שני מיליליטר של פתרון ניתוק תאים ודגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.חזור על הצנטריפוגה והסר את פתרון הניתוק. תן שוב את התאים במדיום ESC אנושי mTeSR-1 על-ידי צינורות בעדינות למעלה ולמטה. כדי להתאים את תאי הגזע העובריים האנושיים מסוג המושבה לתרבות סוג תא יחיד, צלחת כ 1.5 עד 2 מיליון תאים לתוך כל באר של מטריצת קרום המרתף מצופה צלחת בשני מיליליטר של mTeSR-1 המכיל 10 מעכבי רוק מיקרומולרי.לאחר 24 שעות, החלף את המדיום עם mTeSR-1 טרי ללא מעכבי רוק. אפשר לתאים לגדול כסוג תא יחיד במשך שלושה ימים שינוי המדיום מדי יום. ביום הרביעי, לנתק את התאים בתסכול ניתוק מחדש צלחת אותם כפי שתואר קודם לכן.לאחר שימוש חוזר ודגירה של התאים על פי הוראות כתב היד, מעבירים את הגופים העובריים הקטנים לצינור של 15 מיליליטר, נותנים להם להתיישב לתחתית, ומסירים בעדינות את המדיום עם פיפטה. מעבירים אותם למדיום EB ומאפשרים להם להתרחב במנות התקשרות נמוכות במשך שבעה ימים. כדי לגרום לתאי ניוון עצביים או התמדה NPC, לנתק את תאי גזע עובריים מסוג תא יחיד עם מיליליטר אחד של פתרון ניתוק לדגר אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.צנטריפוגה התאים במשך שתי דקות ב 370 פעמים g. הסר את פתרון הניתוק על-טבעי. לאחר מכן בצע שימוש חוזר בתאים ב- DMEM/F-12.צלחת התאים על מטריצת קרום מרתף מצופה צלחת שש באר בצפיפות של פעמיים 10 לתאים החמישיים לגם בשני מיליליטר של mTeSR-1 עם 10 מעכבי רוק micromolar. לאחר 24 שעות, החלף את מדיום התרבות עם מדיום אינדוקציה עצבית בתוספת מיקרומולר אחד דורסומורפין וחמישה מיקרומולרי SB431542. לשנות את המדיום כל יומיים במהלך ארבעת הימים הראשונים של אינדוקציה עצבית, ולאחר מכן כל יום עד ההתכנסות הוא הגיע ביום השביעי.לאחר שבעה ימים של אינדוקציה עצבית, לנתק את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של פתרון ניתוק ודגירה אותם במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה התאים ב 370 פעמים g ולהסיר את פתרון הניתוק על טבעי. הוסף מיליליטר אחד של הרחבת NPC בינוני בעדינות pipette התאים למעלה ולמטה כדי לעשות שימוש חוזר.ואז צלחת אחת 10 לתאים החמישיים לגם בשני מיליליטר של מדיום הרחבת NPC על מטריצת קרום המרתף מצופה שש צלחות היטב. מעבר התאים לפי הצורך כאשר תרבויות להגיע 90% confluency הוספת 10 מעכבי רוק micromolar במהלך שלושת עד ארבעה המעברים הראשונים. לשנות את המדיום כל יומיים במהלך ההתרחבות.כדי להכין צלחות מצופות למינין של אש"ף, לדלל את פתרון המלאי של אש"ף ב- PBS או מים לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר, מערבבים היטב, ואז מצפים כל באר של צלחת שש באר עם מיליליטר אחד של הפתרון. הדגירה את הצלחות לפחות שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס או לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף כל באר עם PBS ומיד לאחר מעיל כל גם עם מיליליטר אחד של פתרון למינין מוכן על פי הוראות כתב היד.שמור את הצלחות בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. כדי להבדיל NPCs לתוך נוירונים דופאמין, צלחת התאים בצלחות מצופה למינין אש"ף במדיום הרחבת NPC בצפיפות של כ 50% לאחר 24 שעות, לשנות את המדיום DA1 ולשנות את המדיום כל יומיים לאחר מכן. כדי לעבור תרבויות כאשר הם מגיעים confluency, לנתק את התאים עם מיליליטר אחד של פתרון ניתוק דגירה אותם במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.ואז צנטריפוגה אותם ב 370 פעמים g ולהסיר את פתרון הניתוק על טבעי. תן שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של מדיום DA1 וצלחת אחת פעמים 10 לתאים החמישיים בשני מיליליטר של מדיום על לוחות שש באר מצופים למינין אש"ף. כדי להבדיל את NPCs לאסטרוציטים, צלחת התאים על לוחות למינין אש"ף ובינוני הרחבת NPC בצפיפות של 50%לשנות את המדיום כדי אסטרוציטים בינוני לאחר 24 שעות, ולמעבר התאים כפי שתואר קודם לכן.כאשר תאי גזע עובריים אנושיים מסוג המושבה הותאמו לתרבות סוג התא הבודד, נמצא כי התאים היו מסוגלים להישמר בצפיפות גבוהה, ואז בקלות וביעילות subcultured כאשר הושגה התפלה. תאים אלה שמרו על מאפייני מחזור התא האופייניים לתאי גזע עובריים אנושיים מסוג המושבה כגון שלב G1 קצר ושיעור גבוה של תאים בשלב S. ניתוח PCR כמותי גם אישר כי הם מבטאים סמני ESC ברמות דומות לאלה של תאים מסוג המושבה.יתר על כן, הוכח כי תאי גזע עובריים אנושיים חד-תאיים הצליחו ליצור גופים עובריים המכילים תאים מכל שלוש שכבות הנבטים: אנדודרמה, מסודרמה ואקטודרמה. לאחר מכן הוכח כי תאי גזע עובריים מסוג תא יחיד הבדילו ביעילות ל- NPCs כפי שצוין על ידי אובדן מורפולוגיה אופיינית של תאי גזע עובריים אנושיים ומראה של מורפולוגיה NPC. בידול נתמך על ידי ביטוי מוגבר של סמני NPC חתימה ואושר על ידי immunostaining וניתוח FACS.אותו ניתוח גם הראה כי יותר מ -90% מהתאים מוכתמים חיובי עבור SOX1, PAX6, וחלבונים NCAM. יתר על כן, NPCs נגזר הצליחו להבדיל לתוך נוירונים דופאמין ואסטרוציטים כפי שצוין על ידי המראה של morphologies אופייני וביטוי של סמנים ספציפיים לשושלת. בעת ניסיון הליך זה, חיוני לצלחת תאי גזע עובריים אנושיים בצפיפות גבוהה על מנת לשמור על בריא, תרבות תאי גזע עובריים אנושיים מו מויש.פרוטוקול זה מספק פלטפורמה לייצור פשוט, חזק ומד מדרגי של עופרת ותא מובחן שיהיה מדרגי למחקר בסיסי, מסך סמים ויישום ברפואה נוירודגנרטיבית.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

שיטה מהירה ויעילה עבור טיהור של תאים האנדודרם המופקים מתאי גזע עובריים אנושיים

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

בידול יעיל של pluripotent בתאי גזע כדי NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; אבות הלבלב

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

יעיל ומדרגי הבידול בבימויו של קלינית הקרנית Limbal אפיתל תאי גזע מתאימים מתאי גזע Pluripotent אנושי

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...