Name: efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-01-18T13:00:00
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Ringraziamo il Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) per la sua assistenza con l'analisi FACS. Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di Ricerca Intramurale dell'Istituto Nazionale di Scienze della Salute Ambientale, dai National Institutes of Health, da 01-ES-101585 all'AMJ.

1. Preparazione di piastre rivestite a matrice di membrana del seminterrato qualificate per l'HESC
<ol><li>Scongelare lentamente la soluzione di matrice di membrana del seminterrato qualificata hESC (vedi Tabella dei materiali)a 4 gradi centigradi per almeno 2-3 h o durante la notte per evitare la formazione di un gel.</li>
	<li>Per preparare piastre rivestite a matrice a membrana seminterrato, diluire la matrice in DMEM freddo/F12 a una concentrazione finale del 2%. Mescolare bene e ricoprire ogni poz...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Rosler, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions.">Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).</li><li>Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+xeno-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).</li><li>Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Characterization and culture of human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+derivation+of+primitive+neural+stem+cells+and+generation+of+brain+subtype+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).</li><li>Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Neurogenesis+in+the+Hippocampus:+From+Stem+Cells+to+Behavior.">Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior.</a> Cell. 167 (4), 897-914 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative.">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).</li><li>Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clump+passaging+and+expansion+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+on+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells.">Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-colony+type+monolayer+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).</li><li>Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-myosin+contractility+is+responsible+for+the+reduced+viability+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).</li><li>Ohgushi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+and+cell+state+responsible+for+dissociation-induced+apoptosis+in+human+pluripotent+stem+cells.">Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).</li><li>Pakzad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+a+ROCK+inhibitor+in+extracellular+matrix+supports+more+undifferentiated+growth+of+feeder-free+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+upon+passaging.">Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Jeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLIS3+Transcriptionally+Activates+WNT+Genes+to+Promote+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+Posterior+Neural+Progenitors.">GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors.</a> Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+with+biological+and+epigenetic+characteristics+similar+to+those+of+mouse+ESCs.">Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).</li><li>Saha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-engineered+substrates+for+improved+human+pluripotent+stem+cell+culture+under+fully+defined+conditions.">Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).</li><li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+small+molecule+inhibitor+cocktail+supports+long-term+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells.">An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells.</a> Nature Communications. 2, 167 (2011).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+a+core+signaling+regulatory+mechanism+for+pluripotent+stem+cell+survival+and+self-renewal+by+small+molecules.">Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible,+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pure+and+expandable+PSA-NCAM-positive+neural+precursors+from+human+ESC+and+iPSC-derived+neural+rosettes.">Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes.</a> PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).</li><li>Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+FGF2+and+BMP+controls+the+self-renewal,+dormancy+and+differentiation+of+rat+neural+stem+cells.">Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).</li><li>Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+that+induces+human+embryonic+stem+cells+to+differentiate+into+neural+cells+in+vitro.">An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro.</a> Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li></ol>

Metodi scalabili ed efficienti per la differenziazione degli HESC in vari lignaggi e la generazione di un numero sufficiente di cellule differenziate sono criteri importanti per lo screening farmacologico e la terapia con cellule staminali. Sono stati pubblicati vari metodi di passaggio di una singola cellula, in cui le cellule sono coltivate in presenza di inibitore ROCK o altre piccole molecole per migliorare la sopravvivenza, ma i prodotti finali di questi metodi di coltura sono tipo colonia hESC17</...

Le cellule staminali embrionali umane (HESC) hanno il potenziale per differenziarsi nei tre strati germinali primari, che poi si differenziano in vari linee di cellule progenitrici multipotenti. Questi lignaggi successivamente danno origine a tutti i tipi di cellule nel corpo umano. I sistemi di coltura in vitro hESC hanno trasformato la capacità di studiare lo sviluppo embrionale umano e sono serviti come un valido strumento per ottenere nuove conoscenze su come questi processi sono regolati a livello biologico e molecolare. Allo stesso modo, gli studi sulle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) generate dalla riprogrammazione di cellule somatiche isolate da pazienti umani forniscono nuove informazioni su varie malattie. Inoltre, le cellule progenitrici e differenziate derivate dagli HESC possono essere utili per la ricerca che coinvolge la terapia con cellule staminali e lo screening farmacologico1,2,3,4.
Gli hESC possono essere indotti a differenziarsi in cellule progenitrici neurali (NPC), che sono cellule multipotenziale con un'ampia capacità di auto-rinnovamento. Successivamente, queste cellule possono essere differenziate in neuroni, astrociti e oligodendrociti5,6. I PNG offrono anche un sistema cellulare per studi in vitro sulla biologia del neurosviluppo e varie malattie neurologiche. Tuttavia, gli attuali metodi di coltura del tipo di colonia che coinvolgono gli HESC e la loro differenziazione nei PNG sono inefficienti e spesso coinvolgono la cocultura così come il corpo embrionale (EB) e la formazione di rosetta5,7,8,9. Questi protocolli presentano tassi di sopravvivenza più bassi e differenziazione spontanea e richiedono più tempo.
Presentato qui è un sistema di coltura migliorato e robusto che è facilmente scalabile e utilizza la coltura di tipo a cella singola ad alta densità di hESCs10. L'inclusione dell'inibitore della chinasi Roh (ROCK) ha contribuito a migliorare significativamente l'efficienza di sopravvivenza durante la coltura a tipo di singola cellula di hESC10,11,12,13,14. In questo sistema di coltura, gli hESC possono essere facilmente mantenuti ed espansi. Inoltre, il protocollo presenta un metodo efficiente per generare NPC dalla coltura di tipo a cella singola degli hESC, che permette la produzione di percorsi di segnalazione altamente puri di NPC. Inibizione di BMP/TGF/activin con inibitori ALK inducono in modo efficiente la differenziazione degli hESC di tipo monocellulare in NPC15,16, che possono poi essere indotti a differenziarsi in lignaggi neurali funzionali, come i neuroni dopaminergici e gli astrociti.
In sintesi, il protocollo di coltura di tipo unicellulare che utilizza hESC offre un modello interessante per studiare la differenziazione di queste cellule in varie linee, tra cui i PNG. Questo protocollo è facilmente scalabile e quindi adatto per la generazione di cellule per la ricerca che coinvolge la terapia rigenerativa e lo screening farmacologico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm m-dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>338-AC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (-Vit A)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z100065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>DAMON/ICE</td>
			<td>428-6759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS 10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cell freezing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-16A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF8</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1569601</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine supplement, 100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 (WA09) human embryonic stem cell line</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin b-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hESC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHH</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z200617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemdiff Neural Progenitor medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5833</td>
			<td>NPC expansion medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells

La differenziazione in vitro delle cellule staminali embrionali umane (HESC) ha trasformato la capacità di studiare lo sviluppo umano su livelli biologici e molecolari e ha fornito cellule da utilizzare in applicazioni rigenerative. Gli approcci standard per la coltura hESC che utilizzano la coltura del tipo di colonia per mantenere hESC indifferenziati e corpo embrionale (EB) e formazione di rosetta per la differenziazione in diversi strati germinali sono inefficienti e dispendiosi in termini di tempo. Di seguito è presentato un metodo di coltura a cella singola che utilizza hESC anziché una cultura di tipo colonia. Questo metodo consente il mantenimento delle caratteristiche degli HESC indifferenziati, inclusa l'espressione di marcatori hESC a livelli paragonabili a quelli del tipo di colonia hESC. Inoltre, il protocollo presenta un metodo efficiente per la generazione di cellule progenitrici neurali (NPC) da hESC di tipo una singola cellula che produce NPC entro 1 settimana. Queste cellule esprimono altamente diversi geni marcatori NPC e possono differenziarsi in vari tipi di cellule neurali, tra cui neuroni dopaminergici e astrociti. Questo sistema di coltura a cella singola per gli HESC sarà utile per studiare i meccanismi molecolari di questi processi, gli studi di alcune malattie e gli schermi di scoperta di farmaci.

Presentato qui è un protocollo migliorato per la manutenzione e l'espansione della coltura di tipo unicellulare di hESC e la loro efficiente differenziazione in cellule progenitrici neurali, che successivamente si differenzia in vari lignaggi neurali a valle, compresi i neuroni dopaminergici e gli astrociti.
Le immagini di contrasto di fase rappresentative mostrano la morfologia cellulare in diversi passaggi durante l'adattamento del tipo di colonia hESC alla coltura a cella singola (<strong ...

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Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Presentato qui è un protocollo per la generazione di una coltura unicellulare di cellule staminali embrionali umane e la loro successiva differenziazione in cellule progenitrici neurali. Il protocollo è semplice, robusto, scalabile e adatto per lo screening farmacologico e le applicazioni di medicina rigenerativa.

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Le cellule staminali embrionali umane possono essere indotte a differenziarsi in cellule progenitrici neurali e successivamente in astrociti neuronali e oligodendrociti. Tuttavia, il metodo di coltura del tipo per le cellule staminali embrionali umane e la loro differenziazione in cellule progenitrici neurali sono un sistema di co-coltura in vivo molto inefficiente e aperto Qui presentiamo un sistema di coltura migliorato e robusto che è facilmente scalabile utilizzando coltura di tipo a singola cellula ad alta densità con cellule staminali embrionali umane. La coltura di tipo a singola cellula delle cellule staminali embrionali umane fornisce un sistema rapido ed efficiente per studiare i meccanismi molecolari che regolano la differenziazione in più fasi lungo vari e distinti lignaggi differenziati, comprese le cellule progenitrici neurali e la loro successiva differenziazione in ulteriori lignaggi neurali.Inizia preparando piastre rivestite a matrice di membrana basale qualificate per cellule staminali embrionali umane. Scongelare lentamente la soluzione a matrice di membrana basale a quattro gradi Celsius per almeno due o tre ore o durante la notte. Una volta scongelata, diluire la matrice in DMEM/F-12 freddo e mescolare bene dal 12% al 2% e rivestire ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti con un millilitro della soluzione diluita.Incubare le piastre rivestite a temperatura ambiente per almeno tre ore o a quattro gradi Celsius durante la notte. Per passare le colture libere da alimentatori di cellule staminali embrionali umane di tipo colonia H9 coltivate su matrice di membrana basale, aspirare il mezzo dai pozzi e lavare una volta con un millilitro di DPBS. Aggiungere un millilitro di soluzione di dispasi ad ogni pozzo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 20 minuti.Rimuovere la dispasi e lavare delicatamente le cellule una volta con due millilitri di DMEM/F-12. Dopo il lavaggio, rimuovere il mezzo e aggiungere due millilitri di DMEM / F-12 ad ogni pozzo. Staccare delicatamente le colonie tubazioni su e giù e trasferirle in un tubo da 15 millilitri.Centrifugare il tubo a 370 volte g per due minuti. Aspirare il mezzo. Quindi dissociare i pellet cellulari in singole cellule aggiungendo due millilitri di soluzione di distacco cellulare e incubandoli a 37 gradi Celsius per 10 minuti.Ripetere la centrifugazione e rimuovere la soluzione di distacco. Riprendono le cellule nel mezzo ESC umano mTeSR-1 con tubi delicatamente su e giù. Per adattare le cellule staminali embrionali umane di tipo colonia a una singola coltura di tipo cellulare, placcare da 1,5 a due milioni di cellule in ogni pozzo della piastra rivestita della matrice della membrana basale in due millilitri di mTeSR-1 contenenti 10 inibitori rock micromolari.Dopo 24 ore, sostituire il mezzo con mTeSR-1 fresco senza inibitore ROCK. Consentire alle celle di crescere come un singolo tipo di cella per tre giorni cambiando il mezzo ogni giorno. Il quarto giorno, dissociare le cellule in soluzione di distacco e ri-placcarle come descritto in precedenza.Dopo aver risosospenso e incubato le cellule secondo le indicazioni del manoscritto, trasferire i piccoli corpi embrionali in un tubo da 15 millilitri, lasciarli depositare sul fondo e rimuovere delicatamente il mezzo con una pipetta. Trasferirli in mezzo EB e consentire loro di espandersi in piatti di attacco basso per sette giorni. Per indurre la cellula progenitrice neurale o la differenziazione NPC, dissociare le cellule staminali embrionali umane di tipo a singola cellula con un millilitro di soluzione di distacco e incubarle a 37 gradi Celsius per 10 minuti.Centrifugare le cellule per due minuti a 370 volte g. Rimuovere il supernatante della soluzione di distacco. Quindi rimosi le celle in DMEM/F-12.Placcare le cellule su una matrice di membrana basale rivestita con piastra a sei porri ad una densità di due volte 10 alla quinta cella per pozzo in due millilitri di mTeSR-1 con 10 inibitori rock micromolari. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo di coltura con un mezzo di induzione neurale integrato con una dorsomorfina micromolare e cinque micromolari SB431542. Cambiare il mezzo a giorni diversi durante i primi quattro giorni di induzione neurale, quindi ogni giorno fino a raggiungere la confluenza al settimo giorno.Dopo sette giorni di induzione neurale, dissociare le cellule aggiungendo un millilitro di soluzione di distacco e incubandole per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Centrifugare le cellule a 370 volte g e rimuovere la soluzione di distacco supernatante. Aggiungere un millilitro di mezzo di espansione NPC e pipettare delicatamente le celle su e giù per rimorsi.Quindi placcare una volta 10 alla quinta celle per pozzo in due millilitri di mezzo di espansione NPC sulla matrice di membrana basale rivestita con piastre a sei pozzi. Passare le cellule se necessario quando le colture raggiungono il 90% di confluenza aggiungendo 10 inibitori rock micromolari durante i primi tre o quattro passaggi. Cambia il mezzo a giorni diversi durante l'espansione.Per preparare piastre rivestite in laminina PLO, diluire la soluzione di stock PLO in PBS o acqua a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro, mescolare bene, quindi rivestire ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti con un millilitro della soluzione. Incubare le piastre per almeno due ore a 37 gradi Celsius o durante la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, lavare ogni bene con PBS e subito dopo rivestire ogni bene con un millilitro di soluzione laminina preparato secondo le indicazioni del manoscritto.Mantenere i piatti a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Per differenziare i PNG in neuroni dopaminergici, placcare le cellule in piatti rivestiti di olp rivestiti di laminina in mezzo di espansione NPC ad una densità di circa il 50%Dopo 24 ore, cambiare il mezzo in DA1 e cambiare il mezzo a giorni alterni dopo. Per passare le colture quando raggiungono la confluenza, dissociare le cellule con un millilitro di soluzione di distacco e incubarle per 10 minuti a 37 gradi Celsius.Quindi centrifugarli a 370 volte g e rimuovere la soluzione di distacco supernatante. Rimostrare le cellule in un millilitro di da1 medio e piatto una volta 10 alla quinta cellule in due millilitri di mezzo sulle piastre a sei pozzi rivestite di laminina PLO. Per differenziare gli NPC in astrociti, placcare le cellule sulle piastre laminine PLO e il mezzo di espansione NPC ad una densità del 50% cambiare il mezzo per astrocita dopo 24 ore e passare le cellule come descritto in precedenza.Quando le cellule staminali embrionali umane di tipo colonia sono state adattate alla coltura del tipo a singola cellula, si è scoperto che le cellule erano in grado di essere mantenute ad alta densità, quindi sottocultura facile ed efficiente quando è stata raggiunta la confluenza. Queste cellule hanno mantenuto le caratteristiche del ciclo cellulare tipiche delle cellule staminali embrionali umane di tipo colonia come una breve fase G1 e un'alta percentuale di cellule in fase S. L'analisi quantitativa della PCR ha inoltre confermato che essi esprimono marcatori ESC a livelli paragonabili a quelli delle cellule di tipo colonia.Inoltre, è stato dimostrato che le cellule staminali embrionali umane a singola cellula erano in grado di formare corpi embrionali contenenti cellule provenienti da tutti e tre gli strati germinali: endoderma, mesoderma ed ectoderma. È stato quindi dimostrato che le cellule staminali embrionali umane di tipo a singola cellula si sono differenziate efficacemente in NPC come indicato dalla perdita della morfologia tipica delle cellule staminali embrionali umane e dall'aspetto della morfologia NPC. La differenziazione è stata supportata dall'aumento dell'espressione dei marcatori NPC distintivi e confermata dall'immunosottenzione e dall'analisi FACS.La stessa analisi ha anche mostrato che più del 90% delle cellule macchiate di positivo per le proteine SOX1, PAX6 e NCAM. Inoltre, i NPC derivati sono stati in grado di differenziarsi in neuroni dopaminergici e astrociti come indicato dalla comparsa di morfologie caratteristiche e dall'espressione di marcatori specifici del lignaggio. Quando si tenta questa procedura, è essenziale placcare le cellule staminali embrionali umane ad alta densità al fine di mantenere una coltura di cellule staminali embrionali umane sana e indifferenziata.Questo protocollo fornisce una piattaforma per la produzione semplice, robusta e scalabile di progenitore e cellule differenziate che sarà scalabile per lo studio di base, lo schermo del farmaco e l'applicazione nella medicina neurodegenerativa.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Ricerca

Biologia dello sviluppo

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