Name: efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

우리는 FACS 분석에 도움을 준 칼 D. 보트너 박사 (NIEHS)에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 환경 보건 과학 연구소의 교내 연구 프로그램, 건강의 국립 연구소, AMJ에 Z01-ES-101585에 의해 지원되었다.

1. hESC 자격을 갖춘 지하 멤브레인 매트릭스 코팅 플레이트 준비
<ol><li>hESC 자격을 갖춘 지하 멤브레인 매트릭스(재료 표참조)를 적어도 2-3시간 동안 4°C에서 천천히 해동하여 겔형성을 피합니다.</li>
	<li>지하 멤브레인 매트릭스 코팅 플레이트를 준비하려면 차가운 DMEM/F12에서 매트릭스를 2% 최종 농도로 희석하십시오. 잘 혼합하고 희석 매트릭스 용액의 1 mL와 6 웰 플레이트의 각 우물...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Rosler, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions.">Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).</li><li>Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+xeno-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).</li><li>Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Characterization and culture of human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+derivation+of+primitive+neural+stem+cells+and+generation+of+brain+subtype+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).</li><li>Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Neurogenesis+in+the+Hippocampus:+From+Stem+Cells+to+Behavior.">Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior.</a> Cell. 167 (4), 897-914 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative.">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).</li><li>Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clump+passaging+and+expansion+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+on+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells.">Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-colony+type+monolayer+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).</li><li>Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-myosin+contractility+is+responsible+for+the+reduced+viability+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).</li><li>Ohgushi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+and+cell+state+responsible+for+dissociation-induced+apoptosis+in+human+pluripotent+stem+cells.">Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).</li><li>Pakzad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+a+ROCK+inhibitor+in+extracellular+matrix+supports+more+undifferentiated+growth+of+feeder-free+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+upon+passaging.">Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Jeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLIS3+Transcriptionally+Activates+WNT+Genes+to+Promote+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+Posterior+Neural+Progenitors.">GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors.</a> Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+with+biological+and+epigenetic+characteristics+similar+to+those+of+mouse+ESCs.">Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).</li><li>Saha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-engineered+substrates+for+improved+human+pluripotent+stem+cell+culture+under+fully+defined+conditions.">Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).</li><li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+small+molecule+inhibitor+cocktail+supports+long-term+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells.">An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells.</a> Nature Communications. 2, 167 (2011).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+a+core+signaling+regulatory+mechanism+for+pluripotent+stem+cell+survival+and+self-renewal+by+small+molecules.">Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible,+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pure+and+expandable+PSA-NCAM-positive+neural+precursors+from+human+ESC+and+iPSC-derived+neural+rosettes.">Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes.</a> PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).</li><li>Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+FGF2+and+BMP+controls+the+self-renewal,+dormancy+and+differentiation+of+rat+neural+stem+cells.">Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).</li><li>Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+that+induces+human+embryonic+stem+cells+to+differentiate+into+neural+cells+in+vitro.">An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro.</a> Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li></ol>

다양한 계보로 hESCs를 분화하고 충분한 수의 분화 세포를 생성하기 위한 확장 가능하고 효율적인 방법은 약물 스크리닝 및 줄기 세포 치료에 중요한 기준입니다. 다양한 단세포 통과 방법이 발표되었으며, 이 때 세포는 생존을 향상시키기 위해 ROCK 억제제 또는 다른 소분자의 존재에서 배양되지만, 이들 배양 방법의 최종 제품은 콜로니 형 hESCs17,18,</...

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 3 개의 1 차적인 세균 층으로 분화하는 잠재력을 가지고, 그 때 각종 다능성 전구 세포 계보로 분화합니다. 이 혈통은 이후에 인체에 있는 모든 세포 모형을 초래합니다. 시험관 내 hESC 배양 시스템은 인간 배아 발달을 연구하는 능력을 변화시켰으며 이러한 과정이 생물학적 및 분자 수준에서 어떻게 조절되는지에 대한 새로운 통찰력을 얻기위한 귀중한 도구로 사용되었습니다. 유사하게, 인간 환자에서 분리된 체세포 를 재프로그래밍해서 생성된 유도된 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 연구 결과는 각종 질병에 새로운 통찰력을 제공합니다. 또한, hESCs로부터 유래된 전구 및 분화 세포는 줄기세포 치료 및 약물스크리닝1,2,3,4와관련된 연구에 유용할 수 있다.
hESCs는 광범위한 자기 갱신 능력을 가진 다중 전위 세포인 신경 전구 세포 (NPC)로 분화하도록 유도될 수 있습니다. 이어서, 이들 세포는 뉴런, 성상세포 및 올리고엔드로시트5,6으로분화될 수 있다. NPC는 또한 신경 발달 생물학 및 각종 신경 질병의 시험관 내 연구를 위한 세포 시스템을 제안합니다. 그러나, 현재 의 식민지 형 배양 방법은 HCS와 NPC로의 분화를 수반하며 종종 배아체(EB) 및 로제트 형성5,7,8,9뿐만아니라 공동배양을 수반한다. 이 프로토콜은 더 낮은 생존율 및 자발적인 분화를 전시하고 더 많은 시간 소모적입니다.
여기서 제시된 개선되고 견고한 배양 시스템은 쉽게 확장 가능하고 hESCs10의고밀도 단세포 형 배양을 사용한다. 로키나아제(ROCK) 억제제의 포함은hESC10,11,12,13,14의단일 세포 형 배양 동안 생존 효율을 현저히 향상시킨에 기여했다. 이러한 문화 시스템에서 는 hESCs를 쉽게 유지 관리하고 확장할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 고도로 순수한 NPC의 생산을 허용하는 hESCs의 단일 세포 형 배양으로부터 NPC를 생성하는 효율적인 방법을 제시합니다.
요약하자면, hESCs를 이용한 단세포 형 배양 프로토콜은 NPC를 포함한 다양한 계보로 이들 세포의 분화를 연구하는 매력적인 모델을 제공한다. 이 프로토콜은 쉽게 확장 가능하기 때문에 재생 요법 및 약물 스크리닝과 관련된 연구를 위한 세포 생성에 적합합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm m-dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>338-AC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (-Vit A)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z100065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>DAMON/ICE</td>
			<td>428-6759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS 10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cell freezing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-16A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF8</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1569601</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine supplement, 100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 (WA09) human embryonic stem cell line</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin b-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hESC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHH</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z200617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemdiff Neural Progenitor medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5833</td>
			<td>NPC expansion medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 시험관 내 분화는 생물학적 및 분자 수준 모두에서 인간의 발달을 연구하는 능력을 변형시키고 재생 응용 프로그램에 사용하기 위해 세포를 제공했습니다. 콜로니 형 배양을 이용한 hESC 배양에 대한 표준 접근법은 미분화 hESCs 및 배아 체(EB) 및 상이한 세균 층으로의 분화를 위한 로제트 형성을 유지하기 위해 비효율적이고 시간이 많이 소요된다. 여기서 제시된 것은 콜로니형 배양 대신 hESC를 이용한 단일 세포 배양 방법이다. 이 방법을 사용하면 콜로니 형 hESCs에 필적하는 수준에서 hESC 마커의 발현을 포함하여 미분화 hESCs의 특성 특징을 유지 보수 할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 1주일 이내에 NPC를 생산하는 단일 세포 형 hCS로부터 신경 전구 세포(NPC) 생성을 위한 효율적인 방법을 제시한다. 이 세포는 몇몇 NPC 마커 유전자를 높게 표현하고 도파민성 신경세포 및 성상세포를 포함하여 각종 신경 세포 모형으로 분화할 수 있습니다. hESCs를 위한 이 단세포 배양 시스템은 이 프로세스의 분자 기계장치, 특정 질병의 연구 및 약 발견 스크린을 조사하는 데 유용할 것입니다.

여기에 제시된 것은 hESCs의 단일 세포 형 배양및 신경 전구 세포로의 효율적인 분화의 유지 및 확장을 위한 개선된 프로토콜이며, 이는 이어서 다양한 다운스트림 신경 계보로 분화되고, 도파민성 뉴런과 성상 세포를 포함.
대표적인 상 대비 이미지는 단일 세포 형 배양에 대한 콜로니 형 hESCs의 적응 동안 상이한 단계에서 세포 형태를보여준다(도 1...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

인간 배아 줄기 세포는 신경 전구 세포로 분화하고 뉴런 성상세포 및 올리고드엔드로시테로 분화하도록 유도될 수 있다. 그러나, 인간 배아 줄기세포및 신경전구세포로의 분화에 대한 형배양방법은 매우 비효율적이고 생체내 공동배양 시스템에서 개방되어 인간 배아 줄기세포를 이용한 고밀도 단일세포형 배양을 이용하여 용이하게 확장가능한 개선되고 견고한 배양시스템을 제시한다. 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 형 배양은 신경 전구 세포및 후속 분화를 포함한 다양하고 뚜렷한 분화 계보를 따라 다단계 분화를 조절하는 분자 메커니즘을 연구하는 신속하고 효율적인 시스템을 제공합니다.인간 배아 줄기 세포를 준비하여 시작 지하 막 매트릭스 코팅 플레이트. 지하 멤브레인 매트릭스 용액을 섭씨 4도에서 적어도 2~3시간 또는 하룻밤 동안 천천히 해동합니다. 해동하면, 차가운 DMEM/F-12에서 매트릭스를 잘 혼합하고, 6웰 플레이트의 각 웰을 희석용액의 1밀리리터로 코팅합니다.코팅된 플레이트를 실온에서 최소 3시간 또는 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 배양합니다. 지하 막 매트릭스에서 자란 콜로니 타입 H9 인간 배아 줄기 세포의 피더 없는 배양을 통과시키고, 우물에서 배지를 흡인시키고 DPBS의 1밀리리터로 한 번 세척한다. Dispase 용액 1밀리리터를 각 웰에 넣고 20분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.Dispase를 제거하고 DMEM / F-12의 두 밀리리터로 한 번 부드럽게 세포를 씻으십시오. 세척 후, 매체를 제거하고 각 우물에 DMEM / F-12의 두 밀리리터를 추가합니다. 콜로니를 위아래로 부드럽게 분리하여 15 밀리리터 튜브로 옮겨 넣습니다.2 분 동안 370 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다. 매체를 흡인합니다. 그런 다음 세포 분리 용액 의 2 밀리리터를 추가하고 10 분 동안 섭씨 37도에서 배양하여 세포 펠릿을 단일 세포로 분리합니다.원심분리를 반복하고 분리 용액을 제거합니다. mTeSR-1 인간 ESC 배지에서 셀을 부드럽게 위아래로 피펫하여 재연합니다. 콜로니 타입의 인간 배아 줄기세포를 단일 세포형 배양에 적응시키기 위해, 10마이크로몰라 ROCK 억제제함유 mTeSR-1의 2밀리리터로 코팅된 지하막 매트릭스 코팅 플레이트의 각 웰에 약 1.5~200만 개의 세포를 플레이트한다.24시간 후, 락 억제제 없이 배지를 신선한 mTeSR-1로 교체하십시오. 세포가 매일 매체를 변경하는 3 일 동안 단일 세포 유형으로 성장하도록 허용합니다. 4일째에, 분리용액에서 세포를 분리하고 이전에 설명한 대로 다시 플레이트한다.원고 지시에 따라 세포를 다시 중단하고 배양한 후 작은 배아 몸을 15 밀리리터 튜브로 옮기고 바닥에 정착시키고 파이펫으로 배지를 부드럽게 제거합니다. EB 매체로 옮기고 7일 동안 낮은 부착 요리로 확장할 수 있도록 합니다. 신경 전구 세포 또는 NPC 분화를 유도하기 위해 단일 세포 유형의 인간 배아 줄기 세포를 분리 용액 1 밀리리터로 분리하고 10 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.370배 g에서 2분간 세포를 원심분리합니다. 분리 용액 상수분리를 제거합니다. 그런 다음 DMEM/F-12의 세포를 다시 일시 중단합니다.지하 막 매트릭스에 세포를 플레이트는 10 마이크로 몰라 ROCK 억제제와 mTeSR-1의 2 밀리리터에서 잘 당 두 번 10 의 밀도에서 5 세포의 밀도로 6 웰 플레이트를 코팅. 24시간 후, 배양 배지를 1개의 마이크로몰러 도르소모핀과 5개의 마이크로몰어 SB431542로 보충된 신경 유도 매체로 대체한다. 신경 유도의 처음 4 일 동안 격일로 매체를 변경 한 다음 7 일째에 합류 할 때까지 매일.7일간의 신경 유도 후, 분리 용액 1밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양하여 세포를 분리합니다. 세포를 370배 g로 원심분리하고 분리용액상수체를 제거한다. NPC 확장 매체의 밀리리터 1밀리리터를 넣고 셀을 위아래로 부드럽게 피펫하여 다시 일시 중지합니다.그런 다음 지하 멤브레인 매트릭스에 NPC 팽창 배지의 2 밀리리터에서 잘 당 10에서 다섯 번째 세포에 1회 플레이트6웰 플레이트를 코팅하였다. 배양이 90%에 도달할 때 필요에 따라 세포를 통과하여 처음 3~4개의 통로 동안 10개의 마이크로몰라 ROCK 억제제를 추가합니다. 확장 기간 동안 격일로 매체를 변경합니다.PLO 라미닌 코팅 플레이트를 준비하려면 PBS 또는 물에 있는 PLO 스톡 솔루션을 밀리리터당 10 마이크로그램의 최종 농도로 희석한 다음 잘 섞은 다음 6웰 플레이트의 각 웰을 용액 1밀리리터로 코팅합니다. 접시를 섭씨 37도에서 최소 2시간 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, PBS로 각 우물을 씻고 원고 의 방향에 따라 준비된 라미닌 용액 1 밀리리터로 코트 직후에 잘 씻으실 수 있습니다.최대 1주일 동안 접시를 섭씨 4도까지 유지하십시오. NPC를 도파미너기뉴런으로 분화하기 위해, 24시간 후 약 50%의 밀도로 NPC 팽창 배지에서 PLO 라미닌 코팅 요리의 세포를 플레이트, 배지를 DA1로 변경하고 그 후 매일 배지를 변경한다. 그들은 합류에 도달 할 때 문화를 통과하기 위해, 분리 용액의 1 밀리리터로 세포를 분리하고 섭씨 37도에서 10 분 동안 배양.그런 다음 원심 분리를 370 배 g로 분리하고 분리 용액 상수 분리를 제거합니다. PLO 라미닌 코팅 6웰 플레이트에 있는 배지의 2밀리리터에서 10번 DA1 배지의 1밀리리터에서 세포를 10번 플레이트로 재연한다. NPC를 성상세포로 분화하기 위해 PLO 라미닌 플레이트 및 NPC 팽창 배지의 세포를 50%의 밀도로 플레이트화하여 24시간 후 성상세포 배지로 배지를 변경하고, 이전에 설명한 바와 같이 세포를 전달한다.콜로니 타입의 인간 배아 줄기세포가 단일 세포형 배양에 적응했을 때, 세포가 고밀도로 유지될 수 있었고, 이어서 수렴에 도달할 때 쉽고 효율적으로 서브배양을 할 수 있었다. 이들 세포는 짧은 G1 상 및 S 상에서 세포의 높은 비율과 같은 식민지 형 인간 배아 줄기 세포의 전형적인 세포 주기 특성을 유지했다. 정량적 PCR 분석은 또한 식민지 형 세포의 것과 비교할 수있는 수준에서 ESC 마커를 표현하는 것을 확인했습니다.더욱이, 단일 세포 인간 배아 줄기 세포는 3개의 세균 층:엔도름, 중피 및 자궁 절제술에서 세포를 포함하는 배아 체를 형성할 수 있었다는 것을 보여주었습니다. 그 때 는 전형적인 인간 배아 줄기 세포 형태와 NPC 형태의 출현에 의해 표시된 바와 같이 단일 세포 형 인간 배아 줄기 세포가 NPC로 효율적으로 분화되었다는 것을 입증하였다. 분화는 시그니처 NPC 마커의 증가된 발현에 의해 지원되었고 면역염색 및 FACS 분석에 의해 확인되었다.동일한 분석은 또한 SOX1, PAX6 및 NCAM 단백질에 대해 양성으로 염색된 세포의 90% 이상을 보여주었다. 더욱이, 유래된 NPC는 특징적인 형태화의 출현과 계보 특이적 마커의 발현에 의해 나타난 바와 같이 도파민성 뉴런 및 성상세포로 분화할 수 있었다. 이 절차를 시도할 때, 건강하고 미분화된 인간 배아 줄기 세포 배양을 유지하기 위해 인간 배아 줄기 세포를 고밀도로 판화하는 것이 필수적이다.이 프로토콜은 기본 연구, 약물 화면 및 신경 퇴행성 의학의 적용을 위해 확장 가능한 전조 및 분화 세포의 간단하고 견고하며 확장 가능한 생산을위한 플랫폼을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

연구

발생학

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

인간 배아 줄기 세포로부터 생성 된 내배엽 세포의 정제를위한 신속하고 효율적인 방법

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

기본 및 전임상 연구 밀폐 세포 배양 시스템에서 인간 다 능성 및 신경 줄기 세포를 배양

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

배아 줄기 세포와 조직의 심장 차별화의 성적인 규정

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

임상 호환 막 Limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...