Name: efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Vi takker Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) for hans hjelp med FACS analyse. Denne forskningen ble støttet av intramural Research program ved National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, Z01-ES-101585 til AMJ.

1. utarbeidelse av hESC-kvalifisert kjeller membran Matrix-belagt plater
<ol><li>Tine sakte opp den hESC-kvalifiserte matrisen med kjeller membran (se tabell over materialer) ved 4 ° c i minst 2 – 3 timer eller over natten for å unngå dannelse av gel.</li>
	<li>Å forberede kjeller membran matrise-belagt plater, fortynne matrise i kaldt DMEM/F12 til en 2% endelig konsentrasjon. Bland godt og pels hver brønn av en 6 brønn plate med 1 mL av fortynnet matrise løsning.</li>
	<li>Ruge i kjeller memb...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Rosler, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions.">Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).</li><li>Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+xeno-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).</li><li>Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Characterization and culture of human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+derivation+of+primitive+neural+stem+cells+and+generation+of+brain+subtype+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).</li><li>Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Neurogenesis+in+the+Hippocampus:+From+Stem+Cells+to+Behavior.">Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior.</a> Cell. 167 (4), 897-914 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative.">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).</li><li>Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clump+passaging+and+expansion+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+on+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells.">Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-colony+type+monolayer+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).</li><li>Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-myosin+contractility+is+responsible+for+the+reduced+viability+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).</li><li>Ohgushi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+and+cell+state+responsible+for+dissociation-induced+apoptosis+in+human+pluripotent+stem+cells.">Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).</li><li>Pakzad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+a+ROCK+inhibitor+in+extracellular+matrix+supports+more+undifferentiated+growth+of+feeder-free+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+upon+passaging.">Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Jeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLIS3+Transcriptionally+Activates+WNT+Genes+to+Promote+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+Posterior+Neural+Progenitors.">GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors.</a> Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+with+biological+and+epigenetic+characteristics+similar+to+those+of+mouse+ESCs.">Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).</li><li>Saha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-engineered+substrates+for+improved+human+pluripotent+stem+cell+culture+under+fully+defined+conditions.">Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).</li><li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+small+molecule+inhibitor+cocktail+supports+long-term+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells.">An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells.</a> Nature Communications. 2, 167 (2011).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+a+core+signaling+regulatory+mechanism+for+pluripotent+stem+cell+survival+and+self-renewal+by+small+molecules.">Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible,+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pure+and+expandable+PSA-NCAM-positive+neural+precursors+from+human+ESC+and+iPSC-derived+neural+rosettes.">Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes.</a> PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).</li><li>Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+FGF2+and+BMP+controls+the+self-renewal,+dormancy+and+differentiation+of+rat+neural+stem+cells.">Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).</li><li>Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+that+induces+human+embryonic+stem+cells+to+differentiate+into+neural+cells+in+vitro.">An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro.</a> Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li></ol>

Skalerbare og effektive metoder for differensiering av hESCs i ulike linjene og generering av tilstrekkelig antall differensiert celler er viktige kriterier for narkotika screening og stilk cellen terapi. Ulike single-celle passerer metoder har blitt publisert, der cellene er kultivert i nærvær av rock inhibitor eller andre små molekyler for å forbedre overlevelse, men de endelige produktene av disse kultur metoder er koloni type hESCs17,18,<sup cl...

Human embryonale stamceller (hESCs) har potensial til å differensiere til de tre primære bakterie lag, som deretter differensiere til ulike Multipotent Stamcelle linjene. Disse linjene senere gi opphav til alle celletyper i menneskekroppen. In vitro hESC kultur systemer har forvandlet evnen til å studere menneskets embryoutvikling og har fungert som et verdifullt verktøy for å få ny innsikt i hvordan disse prosessene er regulert på biologiske og molekylære nivåer. Tilsvarende studier av indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) generert fra omprogrammering somatiske celler isolert fra menneskelige pasienter gi romanen innsikt i ulike sykdommer. I tillegg kan stamfar og differensiert celler avledet fra hESCs være nyttig for forskning som involverer stilk cellen terapi og Drug screening1,2,3,4.
hESCs kan bli overtalt til å differensiere til nevrale stamceller (NPCer), som er multipotential celler med en omfattende selv-fornyelse kapasitet. Deretter kan disse cellene være differensiert i neurons, astrocytter, og oligodendrocytes5,6. NPCer tilbyr også et mobil system for in vitro studier av neurodevelopmental biologi og ulike nevrologiske sykdommer. Men dagens koloni type kultur metoder som involverer hESCs og deres differensiering i NPCer er ineffektiv og ofte innebære coculture samt embryoid Body (EB) og rosett formasjon5,7,8,9. Disse protokollene viser lavere overlevelses rater og spontan differensiering og er mer tidkrevende.
Presentert her er en forbedret og robust kultur system som er lett skalerbar og bruker høy tetthet enkelt celle type kultur hESCs10. Inkluderingen av Roh-kinase (rock)-hemmer bidro til betydelig forbedret overlevelses effektivitet under enkelt celle type kulturen i hESC10,11,12,13,14. I dette kultur systemet kan hESCs enkelt vedlikeholdes og utvides. I tillegg presenterer protokollen en effektiv metode for å generere NPCer fra enkelt celle type kultur hESCs, som tillater produksjon av svært rene NPCer. hemming av BMP/TGFβ/activin signalering trasé med ALK hemmere effektivt indusere differensiering av enkelt celle type hESCs inn NPCer15,16, som deretter kan bli indusert å differensiere til funksjonell nevrale linjene, som dopaminerg neurons og astrocytter.
I sammendraget, den single-Cell type kultur protokoll ved hjelp hESCs tilbyr en attraktiv modell for å studere differensiering av disse cellene i ulike linjene, inkludert NPCer. Denne protokollen er lett skalerbar og derfor egnet til å generere celler for forskning som involverer regenererende terapi og narkotika screening.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm m-dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>338-AC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (-Vit A)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z100065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>DAMON/ICE</td>
			<td>428-6759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS 10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cell freezing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-16A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF8</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1569601</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine supplement, 100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 (WA09) human embryonic stem cell line</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin b-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hESC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHH</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z200617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemdiff Neural Progenitor medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5833</td>
			<td>NPC expansion medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells

In vitro differensiering av menneskelige embryonale stamceller (hESCs) har forvandlet evnen til å studere menneskelig utvikling på både biologiske og molekylære nivåer og gitt celler for bruk i regenererende applikasjoner. Standard tilnærminger for hESC kultur bruker koloni type kultur for å opprettholde udifferensierte hESCs og embryoid kropp (EB) og rosett formasjon for differensiering i ulike bakterie lag er ineffektiv og tidkrevende. Presentert her er en enkelt cellekultur metoden bruker hESCs stedet for en koloni-type kultur. Denne metoden tillater vedlikehold av de karakteristiske trekk ved udifferensierte hESCs, inkludert uttrykk for hESC markører på nivåer som kan sammenlignes med koloni type hESCs. I tillegg presenterer protokollen en effektiv metode for neural stamfar celle (NPC) generasjon fra én celle type hESCs som produserer NPCer innen 1 uke. Disse cellene svært uttrykker flere NPC markør gener og kan differensiere til ulike nevrale celletyper, inkludert dopaminerg neurons og astrocytter. Denne single-cellekultur system for hESCs vil være nyttig i å undersøke den molekylære mekanismer av disse prosessene, studier av visse sykdommer, og stoffet funnet skjermer.

Presentert her er en forbedret protokoll for vedlikehold og utvidelse av enkelt celle type kultur hESCs og deres effektive differensiering inn nevrale stamceller, som senere skiller ut i ulike nedstrøms neural linjene, inkludert dopaminerg neurons og astrocytter.
Representative fase kontrast bilder viser celle morfologi ved ulike trinn under tilpasningen av kolonien type hESCs til enkelt celle type kultur (figur 1A). Gjennom enkelt celle kulturen...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Presentert her er en protokoll for generering av en enkelt cellekultur av menneskelig embryonale stamceller og deres påfølgende differensiering inn nevrale stamceller. Protokollen er enkel, robust, skalerbar, og egnet for narkotika screening og regenererende medisin applikasjoner.

Effektiv neural differensiering bruker single-Cell kultur av Human embryonale stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Humane embryonale stamceller kan induseres til å differensiere i nevrale stamceller og deretter inn i nevron astrocytt og oligodendrocyte. Men type kultur metode for menneskelige embryonale stamceller og deres differensiering i nevrale stamceller er svært ineffektiv og åpen in vivo kokultur system Her presenterer vi et forbedret og robust kultursystem som er lett skalerbar ved hjelp av høy tetthet enkeltcelletype kultur med menneskelige embryonale stamceller. Enkeltcelletypekultur av humane embryonale stamceller gir et raskt og effektivt system for å studere molekylære mekanismer som regulerer flertrinnsdifferensiering langs ulike og distinkte differensierte avstamninger, inkludert nevrale stamceller og deres påfølgende differensiering i ytterligere nevrale avstamninger.Begynn med å forberede menneskelige embryonale stamcellekvalifiserte kjellermembranmatrisebelagte plater. Tin langsomt kjellermembranmatriseløsningen ved fire grader Celsius i minst to til tre timer eller over natten. Når den tines, fortynne matrisen i kaldt DMEM / F-12 til 2% bland godt, og belegge hver brønn av en seks-brønns plate med en milliliter av den fortynnede oppløsningen.Inkuber de belagte platene ved romtemperatur i minst tre timer eller ved fire grader Celsius over natten. For å passere materfrie kulturer av kolonitype H9 menneskelige embryonale stamceller dyrket på kjeller membran matrise, aspirere mediet fra brønnene og vaske en gang med en milliliter DPBS. Tilsett en milliliter Dispase-løsning på hver brønn og inkuber platen ved 37 grader Celsius i 20 minutter.Fjern dispase og vask forsiktig cellene en gang med to milliliter DMEM / F-12. Etter vasken, fjern mediet og legg til to milliliter DMEM / F-12 til hver brønn. Ta forsiktig av koloniene ved å pipetter opp og ned og overfør dem til et 15 milliliter rør.Sentrifuger røret på 370 ganger g i to minutter. Aspirer mediet. Deretter dissosiere cellen pellets i enkeltceller ved å legge til to milliliter celle løsrivelse løsning og inkubere dem ved 37 grader Celsius i 10 minutter.Gjenta sentrifugeringen og fjern løsrivelsesløsningen. Resuspend cellene i mTeSR-1 menneskelig ESC medium ved å forsiktig pipettering opp og ned. For å tilpasse kolonitypen humane embryonale stamceller til en enkeltcelletypekultur, plate ca 1,5 til to millioner celler i hver brønn av kjelleren membran matrise belagt plate i to milliliter av mTeSR-1 inneholder 10 mikromuslar ROCK hemmer.Etter 24 timer erstatter du mediet med frisk mTeSR-1 uten ROCK-hemmer. La cellene vokse som en enkelt celletype i tre dager endre mediet daglig. På den fjerde dagen, dissosiere cellene i løsrivelse løsning og re-plate dem som tidligere beskrevet.Etter å ha resuspending og inkubering cellene i henhold til manuskriptet retninger, overføre de små embryonale legemer til en 15 milliliter tube, la dem bosette seg til bunnen, og forsiktig fjerne mediet med en pipette. Overfør dem til EB medium og la dem utvide i lave vedleggsretter i syv dager. For å indusere nevrale stamceller eller NPC differensiering, dissosiere enkeltcelletypen humane embryonale stamceller med en milliliter løsrivelsesløsning og inkubere dem ved 37 grader Celsius i 10 minutter.Sentrifuger cellene i to minutter ved 370 ganger g. Fjern løsrivelsesløsningen supernatant. Deretter bruker cellene i DMEM/F-12 på igjen.Plate cellene på en kjeller membran matrise belagt seks-brønns plate med en tetthet på to ganger 10 til femte celler per brønn i to milliliter mTeSR-1 med 10 mikromolar ROCK hemmer. Etter 24 timer, erstatte kulturmediet med neural induksjonsmedium supplert med en mikromolar Dorsomorphin og fem mikromolar SB431542. Endre mediet annenhver dag i løpet av de første fire dagene av neural induksjon, deretter hver dag til samløpet er nådd på dag syv.Etter syv dager med neural induksjon, dissosiere cellene ved å legge til en milliliter av løsrivelsesløsning og inkubere dem i 10 minutter ved 37 grader Celsius. Sentrifuger cellene ved 370 ganger g og fjern løsrivelsesløsningen supernatant. Tilsett en milliliter NPC-utvidelsesmedium og pipett cellene forsiktig opp og ned for å bruke dem på nytt.Deretter plate en ganger 10 til femte celler per brønn i to milliliter av NPC ekspansjon medium på kjelleren membran matrise belagt seks-brønn plater. Pass cellene etter behov når kulturer når 90% samløpet og legger til 10 mikromuslar ROCK-hemmer i løpet av de første tre til fire passasjer. Endre mediet annenhver dag under utvidelsen.For å forberede PLO lamininbelagte plater, fortynne PLO-lagerløsningen i PBS eller vann til en endelig konsentrasjon på 10 mikrogram per milliliter, bland godt, og legg deretter hver brønn av en seksbrønns plate med en milliliter oppløsning. Inkuber platene i minst to timer ved 37 grader Celsius eller over natten ved fire grader Celsius. Deretter vasker du hver brønn med PBS og umiddelbart etter pels hver brønn med en milliliter lamininløsning tilberedt i henhold til manuskriptinstruksjonene.Hold platene på fire grader Celsius i opptil en uke. For å differensiere NPCer i dopaminerge nevroner, plate cellene i PLO lamininbelagte retter i NPC ekspansjonsmedium med en tetthet på ca 50%Etter 24 timer, endre mediet til DA1 og endre mediet annenhver dag deretter. Å passere kulturer når de når samløpet, dissosiere cellene med en milliliter av løsrivelsesløsning og inkubere dem i 10 minutter ved 37 grader Celsius.Sentrifuger dem deretter 370 ganger g og fjern løsrivelsesløsningen supernatant. Resuspend cellene i en milliliter DA1 medium og plate en ganger 10 til de femte cellene i to milliliter medium på PLO laminin-belagt seks-brønn plater. For å differensiere NpCene til astrocytter, plate cellene på PLO laminin plater og NPC ekspansjonsmed en tetthet på 50% endre mediet til astrocytt medium etter 24 timer, og passere cellene som tidligere beskrevet.Når kolonitype humane embryonale stamceller ble tilpasset enkeltcelletypekulturen, ble det funnet at cellene var i stand til å opprettholdes ved høy tetthet, deretter enkelt og effektivt subkulturert når samløpet ble nådd. Disse cellene beholdt cellesyklusegenskapene som er typiske for kolonitype humane embryonale stamceller som en kort G1-fase og en høy andel celler i S-fasen. Kvantitativ PCR-analyse bekreftet også at de uttrykker ESC-markører på nivåer som kan sammenlignes med de av kolonitypeceller.Videre ble det vist at encellede humane embryonale stamceller var i stand til å danne embryoide kropper som inneholder celler fra alle tre bakterielag:endoderm, mesoderm og ectoderm. Det ble deretter vist at encellede embryonale stamceller effektivt differensiert til NPCer som indikert ved tap av typisk human embryonisk stamcellemorfologi og utseende av NPC morfologi. Differensiering ble støttet av det økte uttrykket for signatur-NPC-markører og bekreftet ved immunstaining og FACS-analyse.Den samme analysen viste også at mer enn 90% av cellene farget positivt for SOX1, PAX6, og NCAM proteiner. Videre var de avledede NpCene i stand til å differensiere til dopaminerge nevroner og astrocytter som indikert ved utseendet av karakteristiske morfologier og uttrykk for avstamningsspesifikke markører. Når du prøver denne prosedyren, er det viktig å plate de menneskelige embryonale stamceller med høy tetthet for å opprettholde en sunn, udifferensiert menneskelig embryonal stamcellekultur.Denne protokollen gir en plattform for enkel, robust og skalerbar produksjon av stamfar og differensiert celle som vil være skalerbar for grunnleggende studie, narkotikaskjerm og anvendelse i nevrodegenerativ medisin.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Neural Differensiering av mus embryonale stamceller i Serum-free enlagskultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

En rask og effektiv metode for rensing av endoderm celler generert fra humane embryonale stamceller

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Dyrking Menneskelig Pluripotent og Neural stamceller i et lukket cellekultur System for Basic og Preklinisk Forskning

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk regulering av Cardiac Differensiering av embryonale stamceller og vev

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskala produksjon av cardiomyocytes fra Menneskelig Pluripotent stamceller ved hjelp av en meget reproduserbar lite molekyl-Based Differensiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effektiv Differensiering av pluripotent stamceller til å NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; bukspyttkjertelen stamfedre

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Analyse av retinsyre-indusert Neural Differensiering av mus embryonale stamceller i to og tre-dimensjonale embryoidlegemer

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rask, rettet differensiering av netthinnens Pigment epitelceller fra menneskelige embryonale eller indusert Pluripotent stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt sebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv og skalerbar rettet differensiering av klinisk kompatibel hornhinnen Limbal epitel stamceller fra menneskelige Pluripotent stamceller

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...