Name: efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Agradecemos ao Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) por sua ajuda na análise facs. Esta pesquisa contou com o apoio do Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental, dos Institutos Nacionais de Saúde, Z01-ES-101585 à AMJ.

1. Preparação de placas revestidas de matriz de membrana de porão qualificadas por hESC
<ol><li>Descongele lentamente a matriz de membrana de porão qualificada ao hESC (ver Tabela de Materiais)solução em 4 °C por pelo menos 2-3 h ou durante a noite para evitar a formação de um gel.</li>
	<li>Para preparar placas revestidas de matriz de membrana de porão, diluir matriz em DMEM/F12 a frio para uma concentração final de 2%. Misture bem e cubra cada poço de uma placa de 6 poços com 1 mL da so...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Rosler, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions.">Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).</li><li>Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+xeno-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).</li><li>Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Characterization and culture of human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+derivation+of+primitive+neural+stem+cells+and+generation+of+brain+subtype+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).</li><li>Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Neurogenesis+in+the+Hippocampus:+From+Stem+Cells+to+Behavior.">Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior.</a> Cell. 167 (4), 897-914 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative.">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).</li><li>Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clump+passaging+and+expansion+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+on+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells.">Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-colony+type+monolayer+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).</li><li>Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-myosin+contractility+is+responsible+for+the+reduced+viability+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).</li><li>Ohgushi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+and+cell+state+responsible+for+dissociation-induced+apoptosis+in+human+pluripotent+stem+cells.">Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).</li><li>Pakzad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+a+ROCK+inhibitor+in+extracellular+matrix+supports+more+undifferentiated+growth+of+feeder-free+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+upon+passaging.">Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Jeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLIS3+Transcriptionally+Activates+WNT+Genes+to+Promote+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+Posterior+Neural+Progenitors.">GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors.</a> Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+with+biological+and+epigenetic+characteristics+similar+to+those+of+mouse+ESCs.">Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).</li><li>Saha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-engineered+substrates+for+improved+human+pluripotent+stem+cell+culture+under+fully+defined+conditions.">Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).</li><li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+small+molecule+inhibitor+cocktail+supports+long-term+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells.">An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells.</a> Nature Communications. 2, 167 (2011).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+a+core+signaling+regulatory+mechanism+for+pluripotent+stem+cell+survival+and+self-renewal+by+small+molecules.">Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible,+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pure+and+expandable+PSA-NCAM-positive+neural+precursors+from+human+ESC+and+iPSC-derived+neural+rosettes.">Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes.</a> PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).</li><li>Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+FGF2+and+BMP+controls+the+self-renewal,+dormancy+and+differentiation+of+rat+neural+stem+cells.">Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).</li><li>Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+that+induces+human+embryonic+stem+cells+to+differentiate+into+neural+cells+in+vitro.">An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro.</a> Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li></ol>

Métodos escaláveis e eficientes para a diferenciação de hESCs em várias linhagens e a geração de número suficiente de células diferenciadas são critérios importantes para o rastreamento de medicamentos e terapia com células-tronco. Vários métodos de passagem de células únicas foram publicados, nos quais as células são cultivadas na presença de inibidor de ROCHA ou outras pequenas moléculas para melhorar a sobrevivência, mas os produtos finais desses métodos de cultura são os hESCs tipo colônia<sup...

As células-tronco embrionárias humanas (hESCs) têm o potencial de se diferenciar em três camadas germinais primárias, que se diferenciam em várias linhagens celulares progenitoras multipotentes. Estas linhagens posteriormente dão origem a todos os tipos de células do corpo humano. Os sistemas de cultura in vitro hESC transformaram a capacidade de estudar o desenvolvimento embrionário humano e serviram como uma ferramenta valiosa para obter novos insights sobre como esses processos são regulados nos níveis biológico e molecular. Da mesma forma, estudos de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) gerados a partir da reprogramação de células somáticas isoladas de pacientes humanos fornecem novos insights sobre várias doenças. Além disso, progenitor e células diferenciadas derivadas de hESCs podem ser úteis para pesquisas envolvendo terapia com células-tronco e triagem de medicamentos1,2,3,4.
hESCs podem ser induzidos a se diferenciar em células progenitoras neurais (NPCs), que são células multipotenciais com uma extensa capacidade de auto-renovação. Posteriormente, essas células podem ser diferenciadas em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos5,6. Npcs também oferecem um sistema celular para estudos in vitro de biologia do neurodesenvolvimento e várias doenças neurológicas. No entanto, os métodos atuais de cultura do tipo colônia envolvendo hESCs e sua diferenciação em NPCs são ineficientes e muitas vezes envolvem cocultura, bem como o corpo embrionário (EB) e formação de rosetas5,7,8,9. Esses protocolos apresentam menores taxas de sobrevida e diferenciação espontânea e são mais demorados.
Apresentado aqui é um sistema de cultura melhorado e robusto que é facilmente escalável e usa cultura de alta densidade tipo unicelular de hESCs10. A inclusão do inibidor roh-kinase (ROCK) contribuiu para aumentar significativamente a eficiência de sobrevivência durante a cultura do tipo unicelular do hESC10,11,12,13,14. Neste sistema de cultura, hESCs podem ser facilmente mantidos e expandidos. Além disso, o protocolo apresenta um método eficiente para gerar NPCs a partir da cultura do tipo unicelular de hESCs, que permite a produção de NPCs altamente puros. Inibição de BMP/TGFβ/activin sinalização vias com inibidores alk eficientemente induzir diferenciação de hESCs tipo unicelular em NPCs15,16, que então pode ser induzido a se diferenciar em linhagens neurais funcionais, tais como neurônios dopaminérgicos e astúcias.
Em resumo, o protocolo de cultura do tipo unicelular usando hESCs oferece um modelo atraente para estudar a diferenciação dessas células em várias linhagens, incluindo NPCs. Este protocolo é facilmente escalável e, portanto, adequado para a geração de células para pesquisas envolvendo terapia regenerativa e triagem de medicamentos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm m-dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>338-AC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (-Vit A)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z100065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>DAMON/ICE</td>
			<td>428-6759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS 10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cell freezing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-16A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF8</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1569601</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine supplement, 100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 (WA09) human embryonic stem cell line</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin b-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hESC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHH</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z200617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemdiff Neural Progenitor medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5833</td>
			<td>NPC expansion medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells

A diferenciação in vitro das células-tronco embrionárias humanas (hESCs) transformou a capacidade de estudar o desenvolvimento humano em níveis biológicos e moleculares e forneceu células para uso em aplicações regenerativas. Abordagens padrão para a cultura hESC usando cultura do tipo colônia para manter hESCs indiferenciados e corpo embrionário (EB) e formação de roseta para diferenciação em diferentes camadas germinais são ineficientes e demorados. Apresentado aqui é um método de cultura unicelular usando hESCs em vez de uma cultura do tipo colônia. Este método permite a manutenção das características de hESCs indiferenciados, incluindo a expressão de marcadores hESC em níveis comparáveis aos hESCs tipo colônia. Além disso, o protocolo apresenta um método eficiente para a geração de células progenitoras neurais (NPC) de hESCs do tipo unicelular que produz NPCs dentro de 1 semana. Estas células expressam altamente vários genes marcador NPC e pode se diferenciar em vários tipos de células neurais, incluindo neurônios dopaminérgicos e astrócitos. Este sistema de cultura unicelular para hESCs será útil na investigação dos mecanismos moleculares desses processos, estudos de certas doenças e telas de descoberta de medicamentos.

Apresentado aqui é um protocolo melhorado para a manutenção e expansão da cultura do tipo unicelular de hESCs e sua diferenciação eficiente em células progenitoras neurais, que posteriormente se diferencia em várias linhagens neurais a jusante, incluindo neurônios dopaminérgicos e astrócitos.
Imagens representativas de contraste de fase mostram morfologia celular em diferentes etapas durante a adaptação de hESCs tipo colônia para a cultura do tipounicelular</...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Células-tronco embrionárias humanas podem ser induzidas a se diferenciar em células progenitoras neurais e, posteriormente, em astrócito e oligodendrocyte neurônio. No entanto, o método de cultura do tipo para células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação em células progenitoras neurais são muito ineficientes e abertos sistema de co-cultura in vivo Aqui apresentamos um sistema de cultura melhorado e robusto que é facilmente escalável usando cultura de tipo de célula única de alta densidade com células-tronco embrionárias humanas. A cultura do tipo celular único das células-tronco embrionárias humanas fornece um sistema rápido e eficiente para estudar os mecanismos moleculares que regulam a diferenciação de várias etapas ao longo de várias e distintas linhagens diferenciadas, incluindo células progenitoras neurais e sua subsequente diferenciação em linhagens neurais adicionais.Comece preparando células-tronco embrionárias humanas qualificadas para a matriz de membrana de porão. Descongele lentamente a solução da matriz da membrana do porão a quatro graus Celsius por pelo menos duas a três horas ou durante a noite. Quando descongelado, dilui a matriz em DMEM frio/F-12 a 2%, e cubra cada poço de uma placa de seis poços com um mililitro da solução diluída.Incubar as placas revestidas à temperatura ambiente por pelo menos três horas ou a quatro graus Celsius durante a noite. Para passar as culturas livres de alimentadores de células-tronco embrionárias humanas tipo H9 cultivadas na matriz de membrana do porão, aspirar o meio dos poços e lavar uma vez com um mililitro de DPBS. Adicione um mililitro de solução dispase a cada poço e incubar a placa a 37 graus Celsius por 20 minutos.Remova o Dispase e lave suavemente as células uma vez com dois mililitros de DMEM/F-12. Após a lavagem, retire o meio e adicione dois mililitros de DMEM/F-12 a cada poço. Desprendem suavemente as colônias, encanar para cima e para baixo e transferi-las para um tubo de 15 mililitros.Centrifugar o tubo a 370 vezes g por dois minutos. Aspire o meio. Em seguida, dissociar as pelotas celulares em células únicas adicionando dois mililitros de solução de descolamento celular e incubando-as a 37 graus Celsius por 10 minutos.Repita a centrifugação e remova a solução de desprendimento. Resuspenque as células no meio ESC humano mTeSR-1, tubos suavemente para cima e para baixo. Para adaptar as células-tronco embrionárias humanas ao tipo de célula única, a placa de aproximadamente 1,5 a dois milhões de células em cada poço da matriz de membrana do porão placa revestida em dois mililitros de mTeSR-1 contendo 10 inibidores de ROCK micromolar.Após 24 horas, substitua o meio por mTeSR-1 fresco sem inibidor ROCK. Permita que as células cresçam como um único tipo de célula por três dias mudando o meio diariamente. No quarto dia, dissociar as células em solução de descolamento e replacá-las como descrito anteriormente.Depois de reutilizar e incubar as células de acordo com as instruções do manuscrito, transfira os pequenos corpos embrionários para um tubo de 15 mililitros, deixe-os se acomodarem ao fundo e removam suavemente o meio com uma pipeta. Transfira-os para o meio EB e permita que eles se expandam em pratos de baixa fixação por sete dias. Para induzir a diferenciação de célula progenitora neural ou NPC, dissociar as células-tronco embrionárias humanas do tipo único com um mililitro de solução de descolamento e incuba-las a 37 graus Celsius por 10 minutos.Centrifugar as células por dois minutos a 370 vezes g. Remova a solução de desprendimento supernaspendo. Em seguida, resuspende as células em DMEM/F-12.Placa as células em uma matriz de membrana de porão revestida placa de seis poços a uma densidade de duas vezes 10 para as quintas células por poço em dois mililitros de mTeSR-1 com 10 inibidores de ROCK micromolar. Após 24 horas, substitua o meio de cultura por meio de indução neural suplementado por um micromolar Dorsomorphin e cinco micromolar SB431542. Mude o meio a cada dois dias durante os primeiros quatro dias de indução neural, então todos os dias até que a confluência seja alcançada no sétimo dia.Após sete dias de indução neural, dissocia as células adicionando um mililitro de solução de descolamento e incubando-as por 10 minutos a 37 graus Celsius. Centrifugar as células a 370 vezes g e remover a solução de descolamento supernadante. Adicione um mililitro de expansão NPC médio e suavemente pipeta as células para cima e para baixo para resuspend.Em seguida, placa uma vez 10 para a quinta células por poço em dois mililitros de meio de expansão NPC na matriz de membrana do porão revestido placas de seis poços. Transe as células conforme necessário quando as culturas atingirem 90% de confluência adicionando 10 inibidores de ROCK de micromolar durante as primeiras três ou quatro passagens. Mude o meio a cada dois dias durante a expansão.Para preparar placas revestidas de laminina da OLP, diluir a solução de estoque de PLO em PBS ou água para uma concentração final de 10 microgramas por mililitro, misture bem, depois cubra cada poço de uma placa de seis poços com um mililitro da solução. Incubar as placas por pelo menos duas horas a 37 graus Celsius ou durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, lave cada poço com PBS e logo após revestir cada poço com um mililitro de solução de laminina preparado de acordo com as instruções do manuscrito.Mantenha as placas a 4 graus Celsius por até uma semana. Para diferenciar os NPCs em neurônios dopaminérgicos, emplaque as células em pratos revestidos de laminina da OLP em meio de expansão NPC a uma densidade de aproximadamente 50%Após 24 horas, mude o médio para o DA1 e mude o meio a cada dois dias depois disso. Para as culturas de passagem quando atingem a confluência, dissociar as células com um mililitro de solução de desprendimento e incuba-las por 10 minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, centrifuá-los a 370 vezes g e remover a solução de descolamento supernatante. Resuspenque as células em um mililitro de média DA1 e placa uma vez 10 para a quinta células em dois mililitros de médio na placa de seis poços revestidas de laminina da OLP. Para diferenciar os NPCs em astrócitos, emplaque as células nas placas de laminina da OLP e o meio de expansão do NPC a uma densidade de 50% alteram o meio médio para o astrócito após 24 horas, e passagem as células como descrito anteriormente.Quando as células-tronco embrionárias humanas do tipo colônia foram adaptadas à cultura do tipo célula única, descobriu-se que as células eram capazes de ser mantidas em alta densidade, então subculturadas de forma fácil e eficiente quando a confluência era atingida. Essas células mantiveram as características do ciclo celular típicas de células-tronco embrionárias do tipo colônia humana, como uma fase G1 curta e uma alta proporção de células na fase S. A análise quantitativa do PCR também confirmou que eles expressam marcadores ESC em níveis comparáveis aos das células do tipo colônia.Além disso, foi demonstrado que células-tronco embrionárias humanas de células únicas foram capazes de formar corpos embrionários contendo células das três camadas de germes: endoderme, mesoderme e ectoderme. Foi então demonstrado que células-tronco embrionárias do tipo de célula única se diferenciavam eficientemente em NPCs, como indicado pela perda da morfologia típica das células-tronco embrionárias humanas e pelo aparecimento da morfologia do NPC. A diferenciação foi apoiada pelo aumento da expressão de marcadores NPC de assinatura e confirmada pela imunostaining e pela análise FACS.A mesma análise também mostrou que mais de 90% das células mancharam positivo para proteínas SOX1, PAX6 e NCAM. Além disso, os NPCs derivados foram capazes de diferenciar-se em neurônios e astrócitos dopaminérgicos, como indicado pelo aparecimento de morfologias características e expressão de marcadores específicos de linhagem. Ao tentar este procedimento, é essencial emplacar as células-tronco embrionárias humanas em alta densidade, a fim de manter uma cultura de células-tronco embrionárias humanas saudáveis e indiferenciadas.Este protocolo fornece uma plataforma para uma produção simples, robusta e escalável de células progenitoras e diferenciadas que serão escaláveis para estudo básico, tela de medicamentos e aplicação em medicina neurodegenerativa.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Biologia do Desenvolvimento

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Um método rápido e eficiente para a purificação de células da endoderme Gerado de células estaminais embrionárias humanas

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Cultura pluripotentes humanas e células-tronco neurais em um sistema de cultura celular fechado de Pesquisa Básica e pré-clínica

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Regulação epigenética da Cardiac diferenciação de células estaminais embrionárias e Tecidos

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Diferenciação eficiente dos Pluripotent Stem Cells para NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Progenitores pancreáticas

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Diferenciação dirigida eficiente e escalável de clinicamente compatível Corneal estroma epiteliais células-tronco de células pluripotentes humanas

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...