Name: efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Мы благодарим д-ра Карла Д. Бортнера (NIEHS) за его помощь в анализе FACS. Это исследование было поддержано Внештремальной исследовательской программой Национального института экологических наук, Национальных институтов здравоохранения, No01-ES-101585 в AMJ.

1. Подготовка hESC-квалифицированных Подвал Мембрана Матрица покрытием пластин
<ol><li>Медленно оттаивать hESC-квалифицированных подвал мембранной матрицы (см. Таблица материалов) решение на 4 кв, по крайней мере 2-3 ч или на ночь, чтобы избежать образования геля.</li>
	<li>Для подготовки п...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Rosler, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions.">Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).</li><li>Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+xeno-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).</li><li>Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Characterization and culture of human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+derivation+of+primitive+neural+stem+cells+and+generation+of+brain+subtype+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).</li><li>Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Neurogenesis+in+the+Hippocampus:+From+Stem+Cells+to+Behavior.">Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior.</a> Cell. 167 (4), 897-914 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative.">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).</li><li>Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clump+passaging+and+expansion+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+on+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells.">Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-colony+type+monolayer+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).</li><li>Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-myosin+contractility+is+responsible+for+the+reduced+viability+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).</li><li>Ohgushi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+and+cell+state+responsible+for+dissociation-induced+apoptosis+in+human+pluripotent+stem+cells.">Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).</li><li>Pakzad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+a+ROCK+inhibitor+in+extracellular+matrix+supports+more+undifferentiated+growth+of+feeder-free+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+upon+passaging.">Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Jeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLIS3+Transcriptionally+Activates+WNT+Genes+to+Promote+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+Posterior+Neural+Progenitors.">GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors.</a> Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+with+biological+and+epigenetic+characteristics+similar+to+those+of+mouse+ESCs.">Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).</li><li>Saha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-engineered+substrates+for+improved+human+pluripotent+stem+cell+culture+under+fully+defined+conditions.">Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).</li><li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+small+molecule+inhibitor+cocktail+supports+long-term+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells.">An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells.</a> Nature Communications. 2, 167 (2011).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+a+core+signaling+regulatory+mechanism+for+pluripotent+stem+cell+survival+and+self-renewal+by+small+molecules.">Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible,+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pure+and+expandable+PSA-NCAM-positive+neural+precursors+from+human+ESC+and+iPSC-derived+neural+rosettes.">Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes.</a> PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).</li><li>Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+FGF2+and+BMP+controls+the+self-renewal,+dormancy+and+differentiation+of+rat+neural+stem+cells.">Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).</li><li>Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+that+induces+human+embryonic+stem+cells+to+differentiate+into+neural+cells+in+vitro.">An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro.</a> Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li></ol>

Важными критериями скрининга и терапии стволовыми клетками являются масштабируемые и эффективные методы дифференциации ГСС на различные линии и генерации достаточного количества дифференцированных клеток. Различные одноклеточные методы прохождения были опубликованы, в которых кл?...

Человеческие эмбриональные стволовые клетки (HESCs) имеют потенциал, чтобы дифференцироваться в три первичных слоя зародыша, которые затем дифференцироваться в различные многопотентные линии клеток-прародителей. Эти линии впоследствии приводят к появлению всех типов клеток в организме человека. Системы культуры In vitro hESC изменили способность изучать эмбриональное развитие человека и послужили ценным инструментом для получения новых сведений о том, как эти процессы регулируются на биологическом и молекулярном уровнях. Аналогичным образом, исследования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), полученных в результате перепрограммирования соматических клеток, изолированных от пациентов с человеком, дают новое представление о различных заболеваниях. Кроме того, прародитель и дифференцированные клетки, полученные из HESCs может быть полезным для исследований, связанных с терапией стволовыми клетками и скринингом лекарственных средств1,2,3,4.
hESCs можно навести для того чтобы продифференцировать в нервные клетки прародителя (NPC), которые multipotential клетки с обширной емкостью самообновления. Впоследствии эти клетки могут быть дифференцированы в нейроны, астроциты и олигодендроциты5,6. NPC также предлагают клеточной системы для in vitro исследований биологии нейроразвития и различных неврологических заболеваний. Тем не менее, современные методы культуры типа колонии, включающие hESCs и их дифференциацию в NPC, неэффективны и часто связаны с кокультурой, а также эмбриональным телом(EB) и образованием розетки5,7,8. Эти протоколы демонстрируют более низкие показатели выживаемости и спонтанную дифференциацию и отнимают больше времени.
Представлено здесь улучшенная и надежная система культуры, которая легко масштабируема и использует высокую плотность одноклеточного типа культуры hESCs10. Включение ингибитора Roh-kinase (ROCK) способствовало значительному повышению эффективности выживания при культуре одноклеточного типа hESC10,11,12,13,14. В этой системе культуры, hESCs можно легко поддерживать и расширить. Кроме того, Протокол представляет собой эффективный метод для генерации NPCs из одноклеточного типа культуры hESCs, который позволяет производство высоко чистых NPCs. Ингибирование BMP / TGF/активирующих сигнальных путей с ингибиторами ALK эффективно индуцировать дифференциацию одноклеточного типа hESCs в NPCs15,16, которые затем могут быть индуцированы в функциональную линию.
Таким образом, протокол культуры одноклеточного типа с использованием hESCs предлагает привлекательную модель для изучения дифференциации этих клеток на различные линии, включая NPC. Этот протокол легко масштабируемый и поэтому подходит для генерации клеток для исследований, связанных с регенеративной терапией и скринингом лекарств.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm m-dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>338-AC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (-Vit A)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z100065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>DAMON/ICE</td>
			<td>428-6759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS 10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cell freezing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-16A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF8</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1569601</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine supplement, 100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 (WA09) human embryonic stem cell line</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin b-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hESC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHH</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z200617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemdiff Neural Progenitor medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5833</td>
			<td>NPC expansion medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells

Дифференциация эмбриональных стволовых клеток человека (HESCs) в пробирке изменила способность изучать развитие человека как на биологическом, так и на молекулярном уровнях и предоставила клетки для использования в регенеративных целях. Стандартные подходы к культуре hESC с использованием культуры типа колонии для поддержания недифференцированных HESCs и эмбрионального тела (EB) и образования розетки для дифференциации в различные слои зародыша являются неэффективными и отнимают много времени. Здесь представлен одноклеточный метод культуры с использованием hESCs вместо культуры колонии типа. Этот метод позволяет сохранить характерные особенности недифференцированных HESCs, в том числе выражение маркеров hESC на уровнях, сопоставимых с уровнем of colony type hESC. Кроме того, протокол представляет собой эффективный метод генерации нейронных клеток-прародителей (NPC) из одноклеточного типа hESCs, который производит NPC в течение 1 недели. Эти клетки очень выразить несколько генов NPC маркер и может дифференцировать в различные типы нервных клеток, в том числе дофаминергических нейронов и астроцитов. Эта одноклеточная система культуры для HESCs будет полезна в исследовании молекулярных механизмов этих процессов, исследований некоторых заболеваний и экранов обнаружения лекарств.

Представлено здесь улучшенный протокол для обслуживания и расширения одноклеточного типа культуры hESCs и их эффективной дифференциации в нейронные клетки-прародители, которые впоследствии дифференцируется в различные вниз по течению нейронных линий, включая дофаминергические нейро?...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Здесь представлен протокол для генерации одноклеточной культуры эмбриональных стволовых клеток человека и их последующей дифференциации в нервные клетки-прародители. Протокол прост, надежен, масштабируем и подходит для скрининга лекарственных средств и применения регенеративной медицины.

Эффективная нейронная дифференциация с использованием одноклеточной культуры эмбриональных стволовых клеток человека

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Эмбриональные стволовые клетки человека могут быть индуцированы, чтобы дифференцироваться в нервные клетки-предшественники, а затем в астроциты нейронов и олигодендроциты. Тем не менее, тип культуры метод для человеческих эмбриональных стволовых клеток и их дифференциации в нейронных клеток-предшественников являются очень неэффективными и открытыми in vivo совместной культуры системы Здесь мы представляем улучшенную и надежную систему культуры, которая легко масштабируется с использованием высокой плотности одноклеточной культуры типа с эмбриональными стволовыми клетками человека. Одноклеточная культура эмбриональных стволовых клеток человека обеспечивает быструю и эффективную систему для изучения молекулярных механизмов, которые регулируют многоступенчатую дифференциацию по различным и различным дифференцированным линиям, включая нейронные клетки-предшественники и их последующую дифференциацию на дополнительные нейронные линии.Начните с подготовки эмбриональных стволовых клеток человека квалифицированных мембранной мембраны мембраны пластин с покрытием. Медленно оттаивать фундамент мембраны матричного раствора при четырех градусах по Цельсию, по крайней мере два-три часа или на ночь. Когда разморозится, разбавить матрицу в холодной DMEM/F-12 до 2%смешать хорошо, и покрыть каждый хорошо из шести хорошо пластины с одним миллилитр разбавленного раствора.Инкубировать покрытые пластины при комнатной температуре, по крайней мере три часа или при четырех градусах по Цельсию в одночасье. Для прохождения кормушки свободных культур колонии типа H9 человеческих эмбриональных стволовых клеток, выращенных на мембранной матрице подвала, аспирировать среду из колодцев и мыть один раз с одним миллилитров DPBS. Добавьте один миллилитр раствора Dispase к каждой хорошо и инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут.Удалить Dispase и аккуратно мыть клетки один раз с двумя миллилитров DMEM/F-12. После мытья, удалить средний и добавить два миллилитров DMEM / F-12 к каждому хорошо. Аккуратно отсоедините колонии, трубя вверх и вниз, и перенесите их в 15-миллилитровую трубку.Центрифуга трубки при 370 раз г в течение двух минут. Аспирировать медиум. Затем разобщить клеточные гранулы в одиночные клетки, добавив два миллилитров раствора клеточного отслоения и инкубации их при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут.Повторите центрифугу и удалите отслоение раствора. Resuspend клетки в mTeSR-1 человека ESC среды, мягко трубопроводов вверх и вниз. Чтобы адаптировать эмбриональные стволовые клетки типа колонии к культуре одного типа клеток, пластина примерно от 1,5 до двух миллионов клеток в каждый колодец мембранной матрицы подвала покрыты пластины в двух миллилитров mTeSR-1, содержащих 10 микромолярный ингибитор ROCK.Через 24 часа замените носитель свежим mTeSR-1 без ингибитора ROCK. Позвольте клеткам расти как единый тип клеток в течение трех дней, меняя среду ежедневно. На четвертый день отмежеваться от клеток в растворе отслоения и переописать их, как описано ранее.После повторного перерасхода и инкубации клеток в соответствии с рукописными указаниями, перенесите небольшие эмбриональные тела в 15 миллилитровую трубку, дайте им осесть на дно и аккуратно удалите среду пипеткой. Перенесите их в EB среды и позволить им расширить в низкой привязанности блюда в течение семи дней. Чтобы вызвать нейро-клетку-предшественник или дифференциацию NPC, отмежеваться от одноклеточного типа эмбриональных стволовых клеток человека с одним миллилитром раствора отслоения и инкубировать их при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут.Центрифуга клетки в течение двух минут при 370 раз г. Удалите отслойное решение супернатантом. Затем повторное приостановление клеток в DMEM/F-12.Плита клеток на мембранной матрице подвала покрывала шести-хорошо пластины при плотности в два раза от 10 до пятой клетки на колодец в двух миллилитров mTeSR-1 с 10 микромолярный ингибитор ROCK. Через 24 часа замените культурную среду нервной индукционной средой, дополненной одним микромолярным дорсоморфином и пятью микромоларными SB431542. Изменение среды через день в течение первых четырех дней нервной индукции, а затем каждый день, пока слияние не будет достигнуто в день семь.После семи дней нервной индукции, разобщить клетки, добавив один миллилитр раствора отслоения и инкубации их в течение 10 минут при 37 градусах по Цельсию. Центрифуга клетки в 370 раз г и удалить отслоение раствора supernatant. Добавьте один миллилитр среды расширения NPC и аккуратно пипетки клетки вверх и вниз, чтобы повторно.Затем пластины один раз от 10 до пятой клетки на колодец в двух миллилитров NPC расширения среды на мембранной матрице подвала покрытием шесть хорошо пластин. Прохождение клеток по мере необходимости, когда культуры достигают 90%-ного слияния, добавляя 10 микромоляных ингибиторов ROCK в течение первых трех-четырех проходов. Изменение среды через день во время расширения.Чтобы подготовить пластины с покрытием ламинина ООП, разбавить раствор ООП в PBS или воде до конечной концентрации 10 микрограмм на миллилитр, хорошо перемешать, затем покрыть каждый колодец из шести хорошо пластины с одним миллилитром раствора. Инкубировать пластины, по крайней мере два часа при 37 градусов по Цельсию или на ночь при четырех градусах по Цельсию. Далее, мыть каждый хорошо с PBS и сразу после пальто каждый хорошо с одним миллилитров ламинина раствор подготовлен в соответствии с рукописными направлениями.Держите пластины при четырех градусах по Цельсию в течение одной недели. Чтобы дифференцировать NPC в дофаминергических нейронов, пластины клеток в ООП ламинин покрытием блюда в среде расширения NPC при плотности около 50%После 24 часов, изменить средний DA1 и изменить средний через день после этого. Чтобы пройти культур, когда они достигают слияния, разъедать клетки с одним миллилитром раствора отряда и инкубировать их в течение 10 минут при 37 градусах по Цельсию.Затем центрифуга их в 370 раз г и удалить отслоение раствора supernatant. Resuspend клетки в одном миллилитре среды DA1 и плиты один раз от 10 до пятой клетки в двух миллилитров среды на ООП ламинин покрытием шесть хорошо пластин. Чтобы дифференцировать NPC в астроциты, пластины клеток на пластинах ламинина ООП и NPC расширение среды при плотности 50%изменить средний астроцитов среды после 24 часов, и проход клеток, как описано ранее.Когда эмбриональные стволовые клетки типа колонии были адаптированы к культуре одного типа клеток, было установлено, что клетки могут поддерживаться при высокой плотности, а затем легко и эффективно субкультуры, когда слияние было достигнуто. Эти клетки сохранили характеристики клеточного цикла, характерные для эмбриональных стволовых клеток типа колонии, таких как короткая фаза G1 и высокая доля клеток в фазе S. Количественный анализ ПЦР также подтвердил, что они выражают маркеры ESC на уровнях, сопоставимых с уровнями клеток типа колонии.Кроме того, было показано, что одноклеточные эмбриональные стволовые клетки человека способны образовывать эмбриональные тела, содержащие клетки из всех трех зародышевых слоев: эндодерма, мезодерма и эктодерма. Затем было продемонстрировано, что одноклеточный тип эмбриональных стволовых клеток человека эффективно дифференцированы в NPC, о чем свидетельствует потеря типичной морфологии эмбриональных стволовых клеток человека и появление морфологии NPC. Дифференциация была поддержана повышенным выражением маркеров NPC подписи и подтверждена иммуностимулятором и анализом FACS.Тот же анализ также показал, что более 90% клеток окрашены положительным для SOX1, PAX6 и NCAM белков. Кроме того, производные NPC смогли дифференцироваться в дофаминергических нейронов и астроцитов, как указано на появление характерных морфологий и выражение линии конкретных маркеров. При попытке этой процедуры, важно пластины эмбриональных стволовых клеток человека при высокой плотности, с тем чтобы сохранить здоровую, недифференцированную культуру эмбриональных стволовых клеток человека.Этот протокол обеспечивает платформу для простого, надежного и масштабируемого производства прародителя и дифференцированной клетки, которая будет масштабируемой для базового исследования, лекарственного экрана и применения в нейродегенеративной медицине.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Дифференциация нейронных эмбриональных стволовых клеток мыши в бессывороточной монослоя культуры

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Быстрый и эффективный метод для очистки эндодермы клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Культивирование Человеческий плюрипотентных и нервные стволовые клетки в замкнутой системе клеточной культуре фундаментальных и доклинических исследований

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Эпигенетическое регуляции сердечной дифференциации эмбриональных стволовых клеток и тканей

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Крупномасштабное производство кардиомиоцитов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с использованием высокой воспроизводимостью Малый протокол Дифференциация Molecule на основе

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Эффективное Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток к NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; панкреатических Предшественники

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Анализ ретиноевой кислоты-индуцированной Neural дифференциации эмбриональных стволовых клеток мыши в двух и трех-мерных эмбриональных телец

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Быстрое, режиссер дифференциация клеток эпителия сетчатки пигмента от человеческого эмбриона или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion одноклеточных в живых нетронутыми данио рерио

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Высокоэффективные и масштабируемые направленного дифференцирования клинически совместимый роговицы послабляющие стволовых клеток эпителия от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...