Name: efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Vi tackar Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) för hans hjälp med FACS-analysen. Denna forskning stöddes av intramural forsknings program av National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, Z01-ES-101585 till AMJ.

1. beredning av hESC-kvalificerade basalmembran Matrix-belagda plattor
<ol><li>Tina långsamt hESC-kvalificerat basalmembran Matrix (se tabell över material) lösning vid 4 ° c i minst 2 – 3 h eller över natten för att undvika bildandet av en gel.</li>
	<li>För att förbereda basalmembran matris-belagda plattor, späd matris i kallt DMEM/F12 till en 2% slutkoncentration. Blanda väl och täck varje brunn av en 6 brunn tallrik med 1 mL av den utspädda mat ris lösningen.</li>
	<li>Inkubera basal...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Rosler, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions.">Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).</li><li>Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+xeno-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).</li><li>Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Characterization and culture of human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+derivation+of+primitive+neural+stem+cells+and+generation+of+brain+subtype+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).</li><li>Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Neurogenesis+in+the+Hippocampus:+From+Stem+Cells+to+Behavior.">Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior.</a> Cell. 167 (4), 897-914 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative.">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).</li><li>Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clump+passaging+and+expansion+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+on+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells.">Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-colony+type+monolayer+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).</li><li>Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-myosin+contractility+is+responsible+for+the+reduced+viability+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).</li><li>Ohgushi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+and+cell+state+responsible+for+dissociation-induced+apoptosis+in+human+pluripotent+stem+cells.">Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).</li><li>Pakzad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+a+ROCK+inhibitor+in+extracellular+matrix+supports+more+undifferentiated+growth+of+feeder-free+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells+upon+passaging.">Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li><li>Jeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLIS3+Transcriptionally+Activates+WNT+Genes+to+Promote+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+Posterior+Neural+Progenitors.">GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors.</a> Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).</li><li>Emre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers.">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+with+biological+and+epigenetic+characteristics+similar+to+those+of+mouse+ESCs.">Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).</li><li>Saha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-engineered+substrates+for+improved+human+pluripotent+stem+cell+culture+under+fully+defined+conditions.">Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).</li><li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+small+molecule+inhibitor+cocktail+supports+long-term+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells.">An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells.</a> Nature Communications. 2, 167 (2011).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+a+core+signaling+regulatory+mechanism+for+pluripotent+stem+cell+survival+and+self-renewal+by+small+molecules.">Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible,+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pure+and+expandable+PSA-NCAM-positive+neural+precursors+from+human+ESC+and+iPSC-derived+neural+rosettes.">Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes.</a> PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).</li><li>Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+FGF2+and+BMP+controls+the+self-renewal,+dormancy+and+differentiation+of+rat+neural+stem+cells.">Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).</li><li>Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+that+induces+human+embryonic+stem+cells+to+differentiate+into+neural+cells+in+vitro.">An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro.</a> Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li></ol>

Skalbara och effektiva metoder för differentiering av hESCs i olika linjer och generering av tillräckligt antal differentierade celler är viktiga kriterier för läkemedels screening och stamcellsterapi. Olika Single-cell passerar metoder har publicerats, där celler odlas i närvaro av sten-hämmare eller andra små molekyler för att förbättra överlevnaden, men de slutliga produkterna av dessa kultur metoder är kolonin typ hESCs17,18,<sup clas...

Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) har potential att differentiera till de tre primära bakterie lagren, som sedan differentieras till olika multipotenta stamcellslinjer. Dessa härstamningar ger därefter upphov till alla celltyper i människokroppen. In vitro har hESC kultur system förändrat förmågan att studera mänsklig embryonal utveckling och har fungerat som ett värdefullt verktyg för att få nya insikter i hur dessa processer regleras på biologisk och molekylär nivå. På samma sätt ger studier av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) som genereras från omprogrammering av somatiska celler isolerade från mänskliga patienter nya insikter i olika sjukdomar. Dessutom kan stamceller och differentierade celler som härrör från hESCs vara användbara för forskning som involverar stamcellsterapi och läkemedels screening1,2,3,4.
hESCs kan induceras för att differentiera till neurala progenitorceller (NPCs), som är multipotentialceller med en omfattande självförnyelse kapacitet. Därefter kan dessa celler differentieras till nervceller, astrocyter, och oligodendrocyter5,6. NPCs erbjuder också ett cellsystem för in vitro-studier av neuroutvecklingsbiologi och olika neurologiska sjukdomar. Men nuvarande koloni typ kultur metoder som involverar hESCs och deras differentiering i NPC är ineffektiva och ofta involverar samodling samt embryoid kropp (EB) och rosett formation5,7,8,9. Dessa protokoll uppvisar lägre överlevnadsgrad och spontan differentiering och är mer tidskrävande.
Presenteras här är ett förbättrat och robust kultur system som är lätt skalbar och använder hög densitet Single-celltyp kultur av hESCs10. Införandet av Roh-Kinas (Rock) hämmare bidragit till signifikant ökad överlevnad effektivitet under Single celltyp kultur av hESC10,11,12,13,14. I detta kultur system kan hESCs lätt underhållas och utökas. Dessutom utgör protokollet en effektiv metod för att skapa NPC-er från encellig typ kultur av hESCs, som gör det möjligt att tillverka mycket rena NPC: er. hämning av BMP/tgfβ/Activin signalering vägar med ALK-hämmare inducera effektivt differentiering av encellig typ hESCs i NPCs15,16, som sedan kan induceras för att differentiera till funktionella neurala linjer, såsom dopaminerga neuroner och astrocyter.
Sammanfattnings, den Single-celltyp kultur protokoll med hjälp av hESCs erbjuder en attraktiv modell för att studera differentiering av dessa celler i olika linjer, inklusive NPCs. Detta protokoll är lätt att skalbart och lämpar sig därför för att generera celler för forskning som involverar regenerativ terapi och läkemedels screening.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm m-dishes</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104-500</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>338-AC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (-Vit A)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z100065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>DAMON/ICE</td>
			<td>428-6759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS 10</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cell freezing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-16A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF8</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z101057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1569601</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine supplement, 100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 (WA09) human embryonic stem cell line</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin b-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hESC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHH</td>
			<td>Applied Biological Materials</td>
			<td>Z200617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemdiff Neural Progenitor medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5833</td>
			<td>NPC expansion medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient neural differentiation using single-cell culture of human embryonic stem cells

In vitro differentiering av mänskliga embryonala stamceller (hESCs) har förändrat förmågan att studera mänsklig utveckling på både biologiska och molekylära nivåer och som celler för användning i regenerativa tillämpningar. Standard metoder för hESC kultur med hjälp av kolonin typ kultur för att bibehålla odifferentierade hESCs och embryoid kropp (EB) och rosett formation för differentiering i olika köns lagren är ineffektiva och tidskrävande. Här presenteras en encellig kultur metod med hjälp av hESCs istället för en koloni-typ kultur. Denna metod möjliggör underhåll av de karakteristiska dragen i odifferentierade hESCs, inklusive uttryck av hESC markörer på nivåer jämförbara med kolonin typ hESCs. Dessutom, protokollet presenterar en effektiv metod för neurala progenitorceller (NPC) generation från Single-celltyp hESCs som producerar NPC inom 1 vecka. Dessa celler uttrycker högt flera NPC markörgener och kan differentiera till olika neurala celltyper, inklusive dopaminerga neuroner och astrocyter. Detta encellig kultur system för hESCs kommer att vara användbart för att undersöka de molekylära mekanismerna i dessa processer, studier av vissa sjukdomar, och Drug discovery skärmar.

Presenteras här är ett förbättrat protokoll för underhåll och utbyggnad av encellig typ kultur av hESCs och deras effektiva differentiering till neurala stamceller, som senare skiljer sig i olika nedströms neurala linjer, inklusive dopaminerga neuroner och astrocyter.
Representativa faskontrast bilder visar cellmorfologi vid olika steg under anpassningen av kolonin typ hESCs till encellig typ kultur (figur 1A). Genom en enda cell odlingstil...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Här presenteras ett protokoll för generering av en encellig kultur av mänskliga embryonala stamceller och deras efterföljande differentiering till neurala stamcells celler. Protokollet är enkelt, robust, skalbar och lämplig för läkemedels screening och regenerativ medicin applikationer.

Effektiv neurala differentiering med hjälp av Single-cell kultur av mänskliga embryonala stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Mänskliga embryonala stamceller kan induceras att differentiera till neurala stamceller och därefter i neuron astrocyte och oligodemsyra. Typodlingsmetod för mänskliga embryonala stamceller och deras differentiering till neurala stamceller är dock mycket inefficient och öppet in vivo-samkultursystem Här presenterar vi ett förbättrat och robust odlingssystem som är lätt skalbart med hjälp av högdensitetscellstypkultur med mänskliga embryonala stamceller. Single cell typ kultur av mänskliga embryonala stamceller ger ett snabbt och effektivt system för att studera de molekylära mekanismer som reglerar flera steg differentiering längs olika och distinkta differentierade härstamningar, inklusive neurala stamceller och deras efterföljande differentiering till ytterligare neurala härstamningar.Börja med att förbereda mänskliga embryonala stamceller kvalificerade källaren membranmatris belagda plattor. Långsamt tina källaren membranmatrislösningen vid fyra grader Celsius i minst två till tre timmar eller över natten. När du tinas, späd matrisen i kall DMEM/F-12 till 2%blanda väl, och belägga varje brunn av en sex-brunnsplatta med en milliliter av den utspädda lösningen.Inkubera de belagda plattorna i rumstemperatur i minst tre timmar eller vid fyra grader Celsius över natten. Att passage de feeder-fria kulturer av koloni typ H9 mänskliga embryonala stamceller odlas på källaren membran matris, aspirera mediet från brunnarna och tvätta en gång med en milliliter av DPBS. Tillsätt en milliliter Dispase-lösning i varje brunn och inkubera plattan i 37 grader Celsius i 20 minuter.Ta bort Dispase och tvätta försiktigt cellerna en gång med två milliliter DMEM/F-12. Efter tvätten, ta bort mediet och tillsätt två milliliter DMEM/ F-12 till varje brunn. Ta försiktigt loss kolonierna genom att pipettera upp och ner och för över dem till ett 15 milliliterrör.Centrifugera röret vid 370 gånger g i två minuter. Aspirera mediet. Sedan dissociate cellen pellets i enstaka celler genom att lägga till två milliliter cellavlossning lösning och inkubera dem på 37 grader Celsius i 10 minuter.Upprepa centrifugeringen och ta bort lossgöringslösningen. Resuspend cellerna i mTeSR-1 mänskliga ESC medium genom att försiktigt pipettering upp och ner. För att anpassa kolonitypen mänskliga embryonala stamceller till en enda celltypskultur, plåtar ungefär 1,5 till två miljoner celler i varje brunn av källarmembranmatrisens belagd platta i två milliliter mTeSR-1 innehållande 10 mikromolar ROCK-hämmare.Efter 24 timmar, byt ut mediet med färsk mTeSR-1 utan ROCK-hämmare. Låt cellerna växa som en enda celltyp i tre dagar som ändrar mediet dagligen. Den fjärde dagen, dissociate cellerna i avlossningslösning och re-plate dem som tidigare beskrivits.Efter att ha återspäckt och ruvade cellerna enligt manuskriptriktningarna, överför de små embryonala kropparna till ett 15 milliliterrör, låt dem bosätta sig till botten och försiktigt ta bort mediet med en pipett. Överför dem till EB-medium och låt dem expandera i låga tillbehörsrätter i sju dagar. För att inducera neurala progenitor cell eller NPC differentiering, dissociate den enda celltyp mänskliga embryonala stamceller med en milliliter av avskildhet lösning och inkubera dem på 37 grader Celsius i 10 minuter.Centrifugera cellerna i två minuter vid 370 gånger g. Ta bort lossningslösningen supernatant. Sedan resuspend cellerna i DMEM/F-12.Plate cellerna på en källare membran matris belagda sex-väl platta vid en densitet av två gånger 10 till den femte celler per brunn i två milliliter mTeSR-1 med 10 mikromolar ROCK-hämmare. Efter 24 timmar, ersätta odlingsmediet med neural induktionsmedium kompletterat med en mikromolar Dorsomorphin och fem mikromolar SB431542. Ändra mediet varannan dag under de första fyra dagarna av neural induktion, sedan varje dag tills sammanflödet nås på dag sju.Efter sju dagar av neural induktion, separera cellerna genom att lägga till en milliliter av lossningslösning och inkubera dem i 10 minuter vid 37 grader Celsius. Centrifugera cellerna vid 370 gånger g och ta bort lossningslösningen supernatant. Tillsätt en milliliter av NPC expansionsmedium och försiktigt pipetter cellerna upp och ner till återanvändande.Sedan platta en gånger 10 till den femte celler per brunn i två milliliter av NPC expansionsmedium på källaren membran matrisen belagda sex-brunns plattor. Passage cellerna som nödvändigt när kulturer når 90%konfluency lägga 10 mikromolär ROCK-hämmare under de första tre till fyra passager. Byt medium varannan dag under expansionen.För att förbereda PLO lamininbelagda plattor, späd PLO-stamlösningen i PBS eller vatten till en slutkoncentration på 10 mikrogram per milliliter, blanda väl, belägga sedan varje brunn av en sex-brunnsplatta med en milliliter av lösningen. Inkubera plattorna i minst två timmar vid 37 grader Celsius eller över natten vid fyra grader Celsius. Därefter tvättar du varje brunn med PBS och omedelbart efter pälsen varje brunn med en milliliter lamininlösning beredd enligt manuskriptriktningarna.Håll plattorna på fyra grader Celsius i upp till en vecka. För att differentiera NPC till dopaminerga nervceller, platta cellerna i PLO laminin-belagda rätter i NPC expansionsmedium vid en densitet på cirka 50%Efter 24 timmar, ändra mediet till DA1 och ändra mediet varannan dag därefter. Till passagekulturer när de når sammanflytande, separera cellerna med en milliliter av lossningslösning och inkubera dem i 10 minuter vid 37 grader Celsius.Sedan centrifugera dem på 370 gånger g och ta bort lossningslösningen supernatant. Resuspend cellerna i en milliliter av DA1 medium och platta en gånger 10 till de femte cellerna i två milliliter medium på PLO laminin-belagda sex-brunns plattor. För att differentiera NPCs till astrocyter, platta cellerna på PLO laminin plattor och NPC expansionsmedium vid en densitet av 50%ändra mediet till astrocyte medium efter 24 timmar, och passage cellerna som tidigare beskrivits.När kolonityp mänskliga embryonala stamceller anpassades till den enda celltypskulturen, konstaterades det att cellerna kunde bibehållas vid hög densitet, sedan enkelt och effektivt subkulturerade när konfluency nåddes. Dessa celler behöll de cellcykelegenskaper som är typiska för kolonityp mänskliga embryonala stamceller såsom en kort G1-fas och en hög andel celler i S-fas. Kvantitativ PCR-analys bekräftade också att de uttrycker ESC-markörer på nivåer som är jämförbara med dem hos kolonitypsceller.Dessutom visade det sig att encelliga mänskliga embryonala stamceller kunde bilda embryoidkroppar som innehöll celler från alla tre könslager:endoderm, mesoderm och ektoderm. det visades sedan att enda celltyp mänskliga embryonala stamceller effektivt differentieras till NPCs som anges av förlusten av typiska mänskliga embryonala stamceller morfologi och utseende NPC morfologi. Differentiering stöddes av det ökade uttrycket av signatur NPC markörer och bekräftas av immunostaining och FACS analys.Samma analys visade också att mer än 90%av cellerna färgas positivt för SOX1, PAX6, och NCAM proteiner. Vidare kunde de härledda NPCs differentiera till dopaminerga nervceller och astrocyter som anges av utseendet på karakteristiska morfologier och uttryck för härstamning-specifika markörer. När man försöker detta förfarande är det viktigt att plätera de mänskliga embryonala stamcellerna med hög densitet för att upprätthålla en sund, odifferentierad mänsklig embryonal stamcellskultur.Detta protokoll ger en plattform för enkel, robust och skalbar produktion av stamfader och differentierad cell som kommer att vara skalbar för grundläggande studie, drogskärm och tillämpning i neurodegenerativ medicin.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Neural differentiering av Mouse embryonala stamceller i Serumfri enskiktskultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

En snabb och effektiv metod för rening av endoderm celler genereras från mänskliga embryonala stamceller

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Odling av humana pluripotenta och neurala stamceller i en sluten cellodlingssystem för Basic och preklinisk forskning

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk reglering av hjärt Differentiering av embryonala stamceller och vävnader

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskalig produktion av Cardiomyocytes från Human pluripotenta stamceller med hjälp av en mycket reproducerbar liten molekyl baserad differentiering protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effektiv Differentiering av pluripotenta stamceller till NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pankreasstamfäder

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Analys av retinsyra-inducerade Neural differentiering av Mouse embryonala stamceller i två och tre-dimensionella Embryoid organ

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snabb, regisserad differentiering av Retinal Pigment epitelial celler från mänskliga embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Single-cell Photoconversion i levande intakt zebrafiskar

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv och skalbar riktad differentiering av kliniskt kompatibel korneal limbala epitelial stamceller från mänskliga pluripotenta stamceller

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...