Name: assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface
Uploaded: 2020-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل من قبل وزارة التعليم والبحث الاتحادية الألمانية (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, ألمانيا (المنحة 031A581, المشروع الفرعي A-D)) ومؤسسة البحوث الألمانية (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, مجموعة التدريب البحثي GRK 2338).

ملاحظة: يغطي بروتوكول تجربة تعرض واحدة فترة ثلاثة أيام.
اليوم الأول
1- الاستعدادات العامة وزراعة الخلايا
ملاحظة: تم استخدام خط الخلية الظهارية للرئة البشرية A549 لتجارب التعرض. يجب التعامل مع الخلايا في ظروف معقمة. ويمكن استخدام خطوط الخلايا الأخ?...

<ol>
	<li>Faber, S. C., McCullough, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+the+Looking+Glass:+In+vitro+Models+for+Inhalation+Toxicology+and+Interindividual+Variability+in+the+Airway.">Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).</li><li>De Matteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+challenges+in+occupational+lung+diseases.">Current and new challenges in occupational lung diseases.</a> European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).</li><li>LANUV Nordrhein-Westfalen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).</li><li>B&#233;rub&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Inhalation+Toxicity+and+Disease.+The+report+of+a+FRAME+workshop.">In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop.</a> Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).</li><li>Lopez, A. D., Murray, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+disease,+1990-2020.">The global burden of disease, 1990-2020.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).</li><li>Clippinger, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+approaches+for+acute+inhalation+toxicity+testing+to+address+global+regulatory+and+non-regulatory+data+requirements:+An+international+workshop+report.">Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report.</a> Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).</li><li>Agrawal, M. R., Winder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+and+Occurrence+of+LD50+Values+for+Materials+in+the+Workplace.">Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace.</a> Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).</li><li>Amtsblatt der Europ&#228;ischen Union. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verordnung+(EG)+Nr.+1907/2006+des+Europ&#228;ischen+Parlaments+und+des+Rates.">Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europ&#228;ischen Parlaments und des Rates.</a> Europ&#228;ische Union. 860, (2006).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+Organ-Level+Lung+Functions+on+a+Chip.">Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Fisher, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Human+Lung+Slices+in+Toxicology.">The Use of Human Lung Slices in Toxicology.</a> Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).</li><li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+and+Oxidative+Stress+Responses+of+an+Alveolar+Epithelial+Cell+Line+to+Airborne+Zinc+Oxide+Nanoparticles+at+the+Air-Liquid+Interface.">Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 12, (2013).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+as+an+in+vitro+exposure+method+to+assess+acute+pulmonary+toxicity+of+fine+dusts+and+nanoparticles+with+special+focus+on+the+intra-+and+inter-laboratory+reproducibility.">Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility.</a> Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).</li><li>Lacroix, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-Liquid+Interface+In+vitro+Models+for+Respiratory+Toxicology+Research.">Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).</li><li>Eskes, C., Whelan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, (2016).</li><li>Rach, J., Budde, J., M&#246;hle, N., Aufderheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+exposure+at+the+air-liquid+interface:+Evaluation+of+an+in+vitro+approach+for+simulating+inhalation+of+airborne+substances.">Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances.</a> Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).</li><li>Aufderheide, M., Halter, B., M&#246;hle, N., Hochrainer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CULTEX+RFS:+A+comprehensive+Technical+Approach+for+the+In+vitro+Exposure+of+Airway+Epithelial+Cells+to+the+Particulate+Matter+at+the+Air-Liquid+Interface.">The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 15, (2013).</li><li>Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Carterson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates:+Alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).</li><li>Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+useful+in+vitro+model+for+transport+studies+of+alveolar+epithelial+barrier.">A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier.</a> Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+403:+Acute+Inhalation+Toxicity.">Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+436:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+for+the+assessment+of+the+acute+inhalation+toxicity+of+airborne+particles.">Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles.</a> Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+exposure+system+generating+nebulized+aerosol+of+sulfur+mustard+in+comparison+to+the+standard+submerse+exposure.">A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure.</a> Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+CULTEX+radial+flow+system+for+in+vitro+investigation+of+lung+damaging+agents.">Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents.</a> Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).</li><li>Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+GS-NS0+myeloma+cells+to+pH+shifts+and+pH+perturbations.">The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+Guideline+433:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2018).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , (2018).</li></ol>

وقد تم تطوير العديد من نماذج اختبار سمية الاستنشاق غير الحيوانية في السنوات الأخيرة من أجل الحصول على معلومات حول خطر الاستنشاق الحاد للجسيمات القابلة للاستنشاق والحد من التجارب على الحيوانات واستبدالها وفقًا لمبدأ 3R25.
من حيث نماذج زراعة الخلايا ، يمكن أن يتم...

استنشاق الجسيمات السامة المحمولة جوا هو مصدر قلق الصحة العامة، مما يؤدي إلى العديد من المخاطر الصحية في جميع أنحاء العالم وعدة ملايين من الوفيات سنويا1،2. وقد ساهم تغير المناخ والتنمية الصناعية الجارية والطلب المتزايد على الطاقة والمنتجات الزراعية والاستهلاكية في زيادة الأمراض الرئوية خلال السنواتالماضية3و4و5و6. توفر المعرفة والتقييم للمواد القابلة للاستنشاق فيما يتعلق بسميتها الحادة عن طريق الاستنشاق الأساس لتقييم المخاطر وإدارة المخاطر، ولكن هذه المعلومات لا تزال غير موجودة لمجموعة واسعة من هذه المواد7و8. ومنذ عام 2006، يشترط التشريع الكيميائي للاتحاد الأوروبي REACH (تسجيل المواد الكيميائية وتقييمها والإذن بها وتقييدها) أن تخضع المنتجات الموجودة بالفعل والجديدة لتوصيف سمي بما في ذلك طريق الاستنشاق قبل طرحها في السوق. ولذلك ، يركز REACH على الأساليب البديلة والخالية من الحيوانات ، وتنفيذ مبدأ "3R" (استبدال ، وصقل ، والحد من التجارب الحيوانية) واستخدام النماذج المناسبة في المختبر9. في السنوات الأخيرة ، تم تطوير العديد من نماذج اختبار سمية الاستنشاق غير الحيوانية المختلفة والكافية (على سبيل المثال ، في زراعة الخلايا المختبرية ، ونماذج الرئة على رقاقة ، وشرائح الرئة الدقيقة (PCLS)) من أجل تقييم سمية الاستنشاق الحاد للجسيمات المحمولةجوا5،7،10،11. من حيث نماذج زراعة الخلايا المختبرية ، يمكن كشف الخلايا المزروعة تحت ظروف مغمورة أو في ALI(الشكل 1). غير أن صحة دراسات التعرض المغمورة محدودة فيما يتعلق بتقييم سمية المركبات المحمولة جواً ولا سيما الجسيمات. تقنيات التعرض المغمورة لا تتوافق مع الإنسان في حالة الجسم الحي; قد تؤثر وسط ثقافة الخلية التي تغطي الخلايا على الخصائص الفيزيائية الكيميائية وبالتالي ، فإن الخصائص السامة لمادة الاختبار12،13. تسمح نماذج استنشاق الخلايا في المختبر بالتعرض المباشر للخلايا للمواد الاختبارية دون تدخل وسط ثقافة الخلية مع جزيئات الاختبار ، وبالتالي ، تحاكي التعرض البشري بتشابه فسيولوجي وبيولوجي أعلى من التعرض المغمور12،14.
أما بالنسبة للعمليات التنظيمية مثل REACH، فإن النماذج الحيوانية فقط هي المتاحة في مجال علم السموم الاستنشاقي الحاد، حيث لم يتم التحقق من صحة أي طرق بديلة في المختبر بشكل كاف ٍ وقبولها رسمياً حتى الآن14. ولهذا الغرض، يجب التحقق من صحة نماذج الاختبار وفقاً لمتطلبات المختبر المرجعي للاتحاد الأوروبي لبدائل اختبار الحيوانات (EURL-ECVAM) بشأن صلاحية الاختبار15.
أثبتت دراسة سابقة قبل التحقق ودراسة التحقق التي تم الانتهاء منها مؤخرًا بنجاح مجال تطبيق نظام التعرض لـ CULTEX RFS وقابليته للنقل والاستقرار وقابلية التكاثر13. نظام التعرّض هذا هو نظام تعرض للخلايا في المختبر يمكّن من تعرض الخلايا المتجانس للغازات أو الجسيمات أو الأجواء المعقدة (مثل دخان السجائر) في ALI بسبب مفهوم توزيع الهباء الجوي الشعاعي والتوصيل للرذاذ الاختباري في تدفق مستمر فوق الخلايا16. تتكون الوحدة الأساسية لنظام التدفق الشعاعي هذا من محول الدخول ، ووحدة توجيه الهباء الجوي مع توزيع الهباء الجوي الشعاعي ، ووحدة أخذ العينات والمقبس ، ووحدة تأمين مع عجلة اليد(الشكل 2). تصل الجسيمات المولدة إلى الخلايا عبر محول المنافذ ووحدة توجيه الهباء الجوي ويتم إيداعها على إدراجات زراعة الخلايا ، والتي تقع في غرف التعرض الثلاث مرتبة شعاعيًا لوحدة أخذ العينات. يمكن تسخين وحدة توجيه الهباء الجوي وكذلك وحدة أخذ العينات عن طريق الاتصال بحمام مائي خارجي17.
وفي إطار كلتا الدراستين، استُخدمت خلايا A549 في جميع تجارب التعرض. خط الخلية A549 هو خط خلية ظهارية خالدة الإنسان الذي هو جيد التوصيف جدا، وقد استخدمت كنموذج في المختبر للخلايا الظهارية من النوع الثاني السنخية في العديد من الدراسات السمية. تتميز الخلايا بأجسام lamellar ، وإنتاج السطحي وعدد من العوامل ذات الصلة بالالتهاب18. كما أنها تظهر خصائص الخلايا الظهارية الشعب الهوائية بسبب إنتاجها المخاط19. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون مثقفة في ALI. على الرغم من أن هذا الخط الخلية هو نقص في بناء الاتصالات الخلية الخلية، وزراعة هذه الخلايا هو أكثر ملاءمة بكثير، وأقل تكلفة باهظة والنتائج المستمدة منها هي المانحة مستقلة بالمقارنة مع الخلايا الأولية20.
تم بذر خلايا A549 في 6 بئر إدراج الخلايا (غشاء PET، 4.67 سم2،حجم المسام 0.4 ملم) بكثافة 3.0 × 105 خلايا لكل إدراج وزرعت لمدة 24 ساعة في ظل ظروف مغمورة. ثم تم الكشف عن الخلايا في ثلاثة مختبرات مستقلة للهواء النقي وثلاث جرعات تعرض مختلفة (25 و50 و100 ميكروغرام/سم2)من 20 مادة اختبارية في نظام الاستجابة البيئية. وترتبط جرعة التعرض بوقت الترسيب مما يؤدي إلى معدل جسيمات ثابت يبلغ 25 ميكروغرام/سم2و50 ميكروغرام/سم2 و100 ميكروغرام/سم2 على الخلايا بعد 15 أو 30 أو 60 دقيقة على التوالي. ومع ذلك، لم يتم غسل الجسيمات المترسبة بعد الترسيب، ولكنها بقيت على الخلايا لمدة 24 ساعة. وكانت أوقات ترسب الجسيمات بالتالي 15 و30 و60 دقيقة، ولكن تعرض الخلايا استمر لمدة 24 ساعة في المجموع. تم تحديد معدل ترسب المواد الاختبارية في التجارب الأولية وفقا للأساليب السابقة17.
تم تقييم صلاحية الخلية كمؤشر للسمية بعد 24 ساعة من ترسب الجسيمات باستخدام جهاز تقييم قابلية صلاحية الخلية. وتم التركيز بشكل خاص على نوعية ضوابط الهواء النظيف، وتحسين وتحسين بروتوكول التعرض، وإمكانية الاستنساخ داخل المختبرات وفيما بينها، وإنشاء نموذج للتنبؤ. المواد التي أدت إلى انخفاض قدرة الخلية على البقاء أقل من 50٪ (PM 50٪) أو 75% (بعد الظهر 75%) وفي أي من جرعات التعرض الثلاث اعتُبرت ممارسة خطر استنشاق حاد. ثم تمت مقارنة النتائج بالبيانات الموجودة في الجسم الحي (استنادًا إلى دراسة واحدة موثوقة على الأقل وفقًا للدليل الاختباري لمنظمة التعاون الاقتصادي والتنمية (TG) 403 أو TG 43621،22) ، مما أدى إلى توافق عام بنسبة 85٪ ، مع خصوصية 83٪ وحساسية 88٪23.
وإلى جانب قياس صلاحية الخلية، يمكن تقييم نقاط النهاية الأخرى مثل إطلاق السيتوكين أو فحص خلية الخلايا أو سلامة الأغشية عن طريق فحص LDH ولكنها لم تكن مطلوبة لدراسة التحقق من الصحة. وهكذا، ثبت أن نظام التعرض (مثل نظام CULTEX RFS) هو نظام فحص تنبؤي للتقييم النوعي لسمية الاستنشاق الحادة للجسيمات المحمولة جواً التي تم اختبارها، مما يمثل طريقة بديلة واعدة لاختبار الحيوانات. ويوصى بالبروتوكول التالي لتجارب التعرض للجسيمات المحمولة جواً باستخدام نظام التعريض هذا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium and supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>FG 0415</td>
			<td>used as growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td>22320</td>
			<td>used as exposure medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S 0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10mg/mL)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>A 2710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Th. Geyer, Renningen, Germany</td>
			<td>L 0180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 2143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cups</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3516</td>
			<td>6&#173;-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell cell culture inserts</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3450</td>
			<td>24mm inserts; 6-&#173;well plates; 0.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASYton</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Air (DIN EN 12021)</td>
			<td>Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td>2290152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab155902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments + equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cell Counter</td>
			<td>Sch&#228;rfe System GmbH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation thermostat</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline RE 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX HyP - Hydraulic Press</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX insert sleeve</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (large)</td>
			<td>Munktell &#38; Filtrak GmbH, Sachsen, Germany</td>
			<td>LP-050</td>
			<td>Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency &#62; 99,999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (small)</td>
			<td>Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany</td>
			<td>9933-05-DQ</td>
			<td>Balston disposable filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pump</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td>Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser</td>
			<td>digital peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader Infinite M200 Pro</td>
			<td>Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vakuum pump</td>
			<td>KNF, Freiburg, Germany</td>
			<td>N86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#246;gtlin mass flow controller 0,2-10 l/min</td>
			<td>TrigasFI GmbH</td>
			<td>V&#246;gtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline Staredition RE 104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface

هنا ، نقدم نظام ًا نمطيًا مصممًا خصيصًا في المختبر يتيح التعرض المتجانس لخلايا الرئة البشرية المزروعة في ALI للغازات أو الجسيمات أو الأجواء المعقدة (مثل دخان السجائر) ، مما يوفر واقعية فسيولوجية التعرض للسطح apical من منطقة السنخية الإنسان إلى الهواء. وعلى النقيض من نماذج التعرض المتتابعة مع توجيه الهباء الجوي الخطي، فإن التصميم المعياري لنظام التدفق الشعاعي يفي بجميع متطلبات التوليد المستمر ونقل الغلاف الجوي للاختبار إلى الخلايا، وتوزيع وترسب متجانسين الجسيمات والإزالة المستمرة للغلاف الجوي. تم تصميم طريقة التعرض هذه في المقام الأول لتعرض الخلايا للجسيمات المحمولة جواً، ولكن يمكن تكييفها مع تعرض الهباء الجوي السائل والغازات شديدة السمية والعدوانية اعتماداً على طريقة توليد الهباء الجوي ومواد وحدات التعرض .
وفي إطار دراسة التحقق التي أُنجزت مؤخراً، ثبت أن نظام التعرض هذا هو طريقة فحص قابلة للتحويل وقابلة للاستنساخ وتنبؤية للتقييم النوعي للسمية السيسارية الحادة للجسيمات المحمولة جواً، وبالتالي يحتمل أن تقلل أو تحل محل التجارب الحيوانية التي من شأنها أن توفر عادة هذا التقييم السمية.

وRFS CULTEX هو وحدات مصممة خصيصا في نظام التعرض للأشعة الكفية التي تمكن من التعرض المباشر ومتجانسة من الخلايا في ALI. وفي إطار دراسة سابقة سابقة قبل التحقق، تم بنجاح إثبات التطبيق العام لنظام التعرض هذا وقابليته للتحويل والاستقرار وقابلية الاستنساخ. وفي مشروع بحثي حديث مولته ?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

نقدم نظام ًا قويًا وقابلًا للنقل وتنبؤيًا في المختبر لفحص ورصد الجسيمات المحمولة جواً فيما يتعلق بسميتها الرئوية الرئوية الحادة من خلال تعريض خلايا الرئة البشرية المزروعة في واجهة الهواء السائل (ALI).

تقييم سمية الاستنشاق الحاد للجسيمات المحمولة جواً من خلال كشف خلايا الرئة البشرية المزروعة في واجهة الهواء والسائل

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

ويمكن أن يساعد فحص الجسيمات المحمولة جواً فيما يتعلق بالسمية الرئوية الحادة عن طريق الكشف عن خلايا الرئة البشرية المزروعة في نظام ALI باستخدام نظام التعرض في المختبر في تقليل التجارب على الحيوانات. والميزة الرئيسية لنظام التعرض هذا هي مفهوم توزيع الهباء الجوي الشعاعي الذي يؤدي إلى توزيع متجانس ووضع الجسيمات على الخلايا. قبل البذر الخلايا، إضافة 2.5 ملليلتر من متوسطة النمو خفف إلى كل بئر من ستة لوحة جيدا.وضع ثقافة الخلية إدراج دون خلايا بعناية داخل الآبار وإضافة ملليلتر واحد من متوسطة النمو إلى كل خلية ثقافة إدراج. احتضان لوحات لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد تريبسينت من الخلايا، وتمييع 100 ميكرولترات من تعليق ثقافة الخلية في كوب مليئة 10 ملليلتر من محلول متساوي التوتر.إمالة الكأس ببطء دون اهتزاز. على عداد خلية، تحديد عدد الخلايا القابلة للحياة لكل ملليلتر و الخلية قابلة للاستمرار استناداً إلى معلمات قياس الخلية الخاصة بالخلايا A549. بعد هدأ من لوحة, تعرق الوسط ضمن الخلية ثقافة إدراج وبذّر واحدة ملليلتر من A549 خلايا مع كثافة من ثلاثة أوقات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر في كل خلية ثقافة إدراج.توزيع تعليق الخلية عن طريق هزاز لطيف واحتضان لمدة 24 ساعة. تعيين الوقت الملح عبر التحكم في الوقت على الجانب الأمامي من الصحافة. افتح إمدادات الهواء المضغوط في صمام الهواء المضغوط.باستخدام منظم الضغط على الجانب الأمامي من الصحافة، تعيين ضغط الهواء المضغوط إلى ما يقرب من شريط اثنين. اسحب الدرج واضغط على زر الضغط وقراءة الضغط على مفتاح الضغط الرقمي. ملء حاوية المادة بكمية صغيرة من مادة الاختبار.إدراج المكبس في حاوية المادة وتحويلها قليلا ذهابا وإيابا لتوزيع بالتساوي مسحوق في الحاوية. ضع حاوية المادة ، مع المكبس ، في الدرج واضغط على زر الضغط. فتح الدرج وإزالة المكبس.ومن الخطوات الحاسمة الضغط على المواد الاختبارية التي يجب أن تكون مضغوطة على وجه التحديد إلى كعكة مسحوق داخل حاوية المادة من أجل تمكين التعرض للجسيمات المستقرة. إزالة محول مدخل وتكاثف العاكس من وحدة توجيه الهباء الجوي. إغلاق الآبار تغذية الهباء الجوي الثلاثة في وحدة توجيه الهباء الجوي مع المقابس واتصالات العرض المتوسطة في وحدة أخذ العينات مع اللوحات وهمية.قم بتوصيل خطوط الفراغ بموصل أنبوب الوحدة التوجيهية للهباء الجوي. استخدم عجلة اليد لإغلاق الوحدة وقياس قيمة وحدات تحكم التدفق. بعد بضع دقائق من الإغلاق، تنخفض القيم إلى أقل من خمسة ملليلترات في الدقيقة.بدء تشغيل برنامج مولد الهباء الجوي. إذا لم يكن أداة كشط المادة في الموضع الأدنى، اضغط على وضع توجيه الزر. ضع حاوية المادة مع المواد الاختبارية المضغطة رأساً على عقب فوق مكشطة المادة.تأكد من أن الزجاج من حاوية المادة يواجه الجبهة. وضع لوحة تأمين في فتحة على حاوية المادة وتشديد المسمار الأسود. تغيير قيم التغذية والتدوير إلى الإعدادات المطلوبة.استخدام الأسهم إلى الأسفل لدفع أسفل الشريحة مع حاوية المادة حتى مكشطة المادة بالقرب من المادة الضغط. افتح إمدادات الهواء المضغوط إلى مولد الهباء الجوي بنقرة من وحدة تحكم التدفق الجماعي وابدأ توليد الهباء الجوي بالنقر على زر ابدأ. تعيين معدل التغذية إلى 15 إلى 20 ملليمتر في الساعة لتجنب أوقات الانتظار الطويلة.التحكم في توليد الجسيمات الصحيحة من خلال مراقبة سحابة الغبار الدقيقة مع مصباح يدوي صغير يتم وضعه من الأسفل خلف الأنبوب الزجاجي للـ elutriator. بدء العرض المتوسط مع متوسط التعرض مسخن مسبقا وملء وحدات أخذ العينات حتى يتم تغطية downpipes بينما الوحدة مفتوحة. إدراج خلية عمياء تدرج في وحدة التعرض ، ضخ متوسطة التعرض لأسفل حتى يتم تغطية downpipes مع المتوسطة والجانب السفلي من إدراج في اتصال مع المتوسطة.بدء مولد الهباء الجوي، وإغلاق وحدة التعرض، وربط وحدة التعرض لمأخذ وحدة التعرض لمولد الهباء الجوي. بعد 30 دقيقة من المهلة، ختم منفذ وحدة التعرض من elutriator مع المكونات المطاطية وإزالة إدراج أعمى. إعادة ملء متوسط التعرض حتى يتم تغطية downpipes مع المتوسطة.إزالة إدراج ثقافة الخلية من لوحات الآبار الستة بمساعدة الملاقط. صب متوسطة النمو بعناية من ثقافة الخلية إدراج قبالة عن طريق إسقاط إدراج واستخدام ماصة لpiratesate والتخلص من السائل المتبقية. ضع إدراج في غرف التعرض لكل من التعرض والوحدات الهواء النظيف.أغلق الوحدات وتبدأ تجارب التعرض عن طريق ربط وحدة التعرض بمأخذ وحدة التعرض لمولد الهباء الجوي ووحدة الهواء النظيف بإمدادات الغاز الناقلة في وقت واحد. بعد الانتهاء من التجربة، افصل وحدات التعرض والهواء النقي وختم منفذ وحدة التعرض. وقف إمدادات الهواء المضغوط والمولد الهباء الجوي عن طريق النقر على زر وقف.فتح وحدة التعرض والهواء النقي واستخدام ملاقط لنقل إدراج ثقافة الخلية إلى إعداد ما بعد الحضانة ستة لوحات جيدا. احتضان لوحات الآبار الستة ، فضلا عن إدراج ثقافة الخلية غير المكشوفة ، لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون في واجهة الهواء السائل. بعد 24 ساعة من التعرض، إدراج إدراج ثقافة الخلية في لوحات الآبار الستة الجديدة المعدة.إضافة ملليلتر واحد من الحل WST1 الطازجة المعدة لإدراج كل ثقافة الخلية. صخرة لوحات بعناية من أجل توزيع الحل متجانس على الخلايا. احتضان لوحات الآبار الستة مع إدراج ثقافة الخلية لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.بعد ذلك، نقل 100 ميكرولترات من المابير في ثلاثات من كل ستة صحن جيدا إلى لوحة 96 جيدا. باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة، وقياس امتصاص في 450 نانومتر مع طول موجة مرجعي من 650 نانومتر. RFS CULTEX هو نظام تعرض وحدات في المختبر مصممة خصيصا التي تمكن من التعرض المباشر ومتجانس الخلايا للجسيمات المحمولة جوا في واجهة السائل الهواء.تعريض الخلايا للهواء النقي يؤدي إلى عدم انخفاض صلاحية الخلية مع مرور الوقت. وتم بنجاح التحقق من صحة نظام التعرض، وتم تأسيسه كنموذج للتنبؤ بأخطار الاستنشاق الحادة للمركبات المختبرة. تعرض خلايا A549 لمواد اختبار مختلفة لم تظهر أي سمية أو متوسطة أو قوية.يرجى التأكد من أنك تحتفظ بدقة في الأطر الزمنية التي هي أوقات الحضانة، ومهلة توليد الجسيمات، وأوقات ترسب الجسيمات. وقد صُمِّمت طريقة التعرض هذه أساساً لتُعَرِّض الخلايا للجسيمات، ولكن يمكن توسيعها لتشمل تعرض الهباء الجوي والغازات السائلة عن طريق تكييف طريقة توليد الهباء الجوي. وتتيح طريقة الفرز هذه إجراء تقييم نوعي للجسيمات القابلة للاستنشاق فيما يتعلق بسمية الاستنشاق الحادة في المختبر، مما يقلل من الاختبارات على الحيوانات التي توفر عادة هذا التقييم السمي.لا تنس أن العمل مع المواد السامة اختبار يمكن أن تكون خطرة للغاية والاحتياطات، مثل ارتداء القفازات، قناع، ينبغي دائما أن تتخذ عند التعامل مع هذه المركبات.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

عزل الخلايا الظهارية ماوس الجهاز التنفسي والتعرض لدخان السجائر في واجهة تجريبية الهواء السائل

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

الإنتاجية العالية التدفق الخلوي القائم على الفحص لكشف خلية أضداد N-ميثيل مد اسبارتاتي مستقبلات الدوبامين-2 أو مستقبلات في مصل الإنسان

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

A الفئران نموذج من عضلة القلب إصابة نقص التروية، ضخه من خلال ربط الشريان الأمامي اليسار تنازليا

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

عزل خلايا الإنسان اللمفاوي البطانية التي كتبها متعدد المعلمة تنشيط الإسفار الفرز خلية

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

منتشر الطيفي الضوئي للتقييم الكمي الحاد الإشعاعات المؤينة الجلد المستحث السمية باستخدام نموذج الفأر

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

تقييم نتائج الأساسي في نموذج الخنزير من احتشاء عضلة القلب الحاد

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

فتح القصبة الهوائية المعدة حمض الطموح فأري موديل الحاد الرئة إصابة النتائج في القصوى الحاد غير قاتل الرئة الإصابات

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

الفوسفور 31 الرنين المغناطيسي الطيفي: أداة لقياس<em&gt; في فيفو</em&gt; القدرة الميتوكوندريا الفسفرة التأكسدية في العضلات الهيكلية البشرية

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

إحداث إصابات الرئة الحادة في الفئران عن طريق التبيل المباشر للكيس الشحمي داخل الرغامى

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Oral Health Assessment by Lay Personnel for Older Adults

تقييم صحة الفم من قبل الموظفين العاديين لكبار السن

Oral health is an often-undervalued contributor to overall health. The literature, however, underscores the myriad of systemic diseases influenced by oral ...