Name: assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface
Uploaded: 2020-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Tyskland (Grant 031A581, underprojekt A-D)) og af Den Tyske Forskningsfond (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Forskningsuddannelsesgruppe GRK 2338).

BEMÆRK: Protokollen for et eksponeringseksperiment dækker en periode på tre dage.
Dag 1
1. Generel tilberedning og dyrkning af celler
BEMÆRK: Den menneskelige lunge adenocarcinom epitelcellelinje A549 blev brugt til eksponeringsforsøg. Celler skal håndteres under sterile forhold. Andre cellelinjer, der er egnede til dyrkning på ALI kan anvendes.
<ol><li>Vækstmediet (Dulbeccos Minimum Essential Medium (DMEM), suppleret med 10% f?...

<ol>
	<li>Faber, S. C., McCullough, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+the+Looking+Glass:+In+vitro+Models+for+Inhalation+Toxicology+and+Interindividual+Variability+in+the+Airway.">Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).</li><li>De Matteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+challenges+in+occupational+lung+diseases.">Current and new challenges in occupational lung diseases.</a> European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).</li><li>LANUV Nordrhein-Westfalen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).</li><li>B&#233;rub&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Inhalation+Toxicity+and+Disease.+The+report+of+a+FRAME+workshop.">In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop.</a> Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).</li><li>Lopez, A. D., Murray, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+disease,+1990-2020.">The global burden of disease, 1990-2020.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).</li><li>Clippinger, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+approaches+for+acute+inhalation+toxicity+testing+to+address+global+regulatory+and+non-regulatory+data+requirements:+An+international+workshop+report.">Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report.</a> Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).</li><li>Agrawal, M. R., Winder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+and+Occurrence+of+LD50+Values+for+Materials+in+the+Workplace.">Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace.</a> Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).</li><li>Amtsblatt der Europ&#228;ischen Union. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verordnung+(EG)+Nr.+1907/2006+des+Europ&#228;ischen+Parlaments+und+des+Rates.">Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europ&#228;ischen Parlaments und des Rates.</a> Europ&#228;ische Union. 860, (2006).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+Organ-Level+Lung+Functions+on+a+Chip.">Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Fisher, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Human+Lung+Slices+in+Toxicology.">The Use of Human Lung Slices in Toxicology.</a> Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).</li><li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+and+Oxidative+Stress+Responses+of+an+Alveolar+Epithelial+Cell+Line+to+Airborne+Zinc+Oxide+Nanoparticles+at+the+Air-Liquid+Interface.">Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 12, (2013).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+as+an+in+vitro+exposure+method+to+assess+acute+pulmonary+toxicity+of+fine+dusts+and+nanoparticles+with+special+focus+on+the+intra-+and+inter-laboratory+reproducibility.">Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility.</a> Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).</li><li>Lacroix, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-Liquid+Interface+In+vitro+Models+for+Respiratory+Toxicology+Research.">Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).</li><li>Eskes, C., Whelan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, (2016).</li><li>Rach, J., Budde, J., M&#246;hle, N., Aufderheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+exposure+at+the+air-liquid+interface:+Evaluation+of+an+in+vitro+approach+for+simulating+inhalation+of+airborne+substances.">Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances.</a> Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).</li><li>Aufderheide, M., Halter, B., M&#246;hle, N., Hochrainer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CULTEX+RFS:+A+comprehensive+Technical+Approach+for+the+In+vitro+Exposure+of+Airway+Epithelial+Cells+to+the+Particulate+Matter+at+the+Air-Liquid+Interface.">The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 15, (2013).</li><li>Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Carterson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates:+Alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).</li><li>Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+useful+in+vitro+model+for+transport+studies+of+alveolar+epithelial+barrier.">A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier.</a> Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+403:+Acute+Inhalation+Toxicity.">Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+436:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+for+the+assessment+of+the+acute+inhalation+toxicity+of+airborne+particles.">Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles.</a> Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+exposure+system+generating+nebulized+aerosol+of+sulfur+mustard+in+comparison+to+the+standard+submerse+exposure.">A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure.</a> Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+CULTEX+radial+flow+system+for+in+vitro+investigation+of+lung+damaging+agents.">Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents.</a> Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).</li><li>Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+GS-NS0+myeloma+cells+to+pH+shifts+and+pH+perturbations.">The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+Guideline+433:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2018).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , (2018).</li></ol>

Mange modeller for toksicitetstest for indånding af indånding uden for dyr er blevet udviklet i de senere år for at få oplysninger om den akutte fare for indånding af partikler, der kan inhaleres, og for at reducere og erstatte dyreforsøg i henhold til 3R-princippet25.
Med hensyn til cellekultur modeller, eksponering af celler kan ske under neddykkede forhold eller på ALI. Udsætter celler under neddykkede forhold kan påvirke de fysisk-kemiske egenskaber og derm...

Indånding af giftige luftbårne partikler er et folkesundhedsproblem, der fører til en lang række sundhedsrisici på verdensplan og mange millioner dødsfald årligt1,2. Klimaændringer, den igangværende industrielle udvikling og den stigende efterspørgsel efter energi, landbrug og forbrugsvarer har bidraget til stigningen i lungesygdomme i de seneste år3,4,5,6. Viden om og evaluering af inhalerbare stoffer vedrørende deres akutte toksicitet ved indånding danner grundlag for risikovurdering og risikostyring, men disse oplysninger mangler stadig for en lang række af disse stoffer7,8. Siden 2006 har EU's kemikalielovgivning Reach (Registrering, Evaluering, Autorisation og Begrænsning af Kemikalier) kræves, at allerede eksisterende og nyindførte produkter underkastes en toksikologisk karakterisering, herunder inhalationsvejen, før de markedsføres. Reach fokuserer derfor på alternative og animalske metoder, gennemførelse af "3R"-princippet (erstatning, raffinement og reduktion af dyreforsøg) og anvendelse af passende in vitro-modeller9. I de seneste år er der udviklet mange forskellige og tilstrækkelige modeller til test af inhalationstoksicitet uden for dyr (f.eks. in vitrocellekulturer, lunge-on-a-chip-modeller, præcisionssnitilungeskiver (PCLS)) for at vurdere den akutte toksicitet ved indånding af luftbårne partikler5,7,10,11. Med hensyn til in vitrocellekulturmodeller kan dyrkede celler eksponeres under neddykkede forhold eller ved ALI (figur 1). Gyldigheden af undersøgelser af neddykket eksponering er imidlertid begrænset med hensyn til vurderingen af toksiciteten af luftbårne forbindelser, især partikler. Nedsænket eksponeringsteknikker svarer ikke til den menneskelige in vivo-situation cellekulturmediet, der dækker cellerne, kan påvirke de fysisk-kemiske egenskaber og dermed de toksiske egenskaber ved et teststof12,13. ALI in vitro inhalation modeller tillader direkte eksponering af celler til teststoffer uden indblanding af cellekultur medium med testpartikler, således efterligne menneskers eksponering med højere fysiologiske og biologiske lighed end neddykket eksponering12,14.
For reguleringsprocesser som REACH er der imidlertid kun tilgængelige dyremodeller inden for akut inhalationstoksikologi, da ingen alternative in vitro-metoder indtil videre er blevet tilstrækkeligt valideret og officielt accepteret indtil videre14. Med henblik herpå skal testmodellervalideres i overensstemmelse med kravene i Eu's referencelaboratorium for alternativer til dyreforsøg (EURL-ECVAM) om testgyldighed15.
En tidligere prævalideringsundersøgelse og en nyligt afsluttet valideringsundersøgelse viste med succes anvendelsesområdet for CULTEX RFS-eksponeringssystemet og dets overførsel, stabilitet og reproducerbarhed13. Dette eksponeringssystem er et in vitro-cellebaseret eksponeringssystem, der muliggør ensartet eksponering af celler for gasser, partikler eller komplekse atmosfærer (f.eks. cigaretrøg) ved ALI på grund af dets radiale aerosoldistributionskoncept og udførelsen af testaerosolet i et kontinuerligt flow over cellerne16. Grundmodulet i dette radiale flowsystem består af indløbsadapteren, aerosolets styremodul med en radial aerosolfordeling, prøvetagnings- og stikmodulet og et låsemodul med et håndhjul (figur 2). De genererede partikler når cellerne via indløbsadapteren og aerosolstyremodulet og deponeres på cellekulturindsatserne, som er placeret i prøvetagningsmodulets tre radialt arrangerede eksponeringskamre. Aerosolets styremodul samt prøvetagningsmodulet kan opvarmes ved at tilslutte sig et eksternt vandbad17.
Inden for rammerne af begge undersøgelser blev der anvendt A549-celler til alle eksponeringsforsøg. Cellelinjen A549 er en human udødeliggjort epitelcellelinje, der er meget velkarakteriseret og har været brugt som in vitro-model for type II alveolar epitelceller i talrige toksikologiske undersøgelser. Cellerne er karakteriseret ved lamellar organer, produktion af overfladeaktive stof og en række inflammation-relevante faktorer18. De viser også egenskaber bronkial epitelceller på grund af deres slim produktion19. Desuden kan de dyrkes på ALI. Selv om denne cellelinje er mangelfuld i opbygningen af celle-celle kontakter, dyrkning af disse celler er langt mere praktisk, billigere og resultater afledt heraf er donor-uafhængige i forhold til primære celler20.
A549 celler blev seedet i 6-brøndcellekultur skær (PET membran, 4,67 cm2, pore størrelse 0,4 mm) med en tæthed på 3,0 x 105 celler pr indsætte og dyrket i 24 timer under neddykkede forhold. Celler blev derefter eksponeret i tre uafhængige laboratorier for ren luft og tre forskellige eksponeringsdoser (25, 50 og 100 μg/cm2) af 20 teststoffer ved ALI. Eksponeringsdosis korreleres med aflejringstiden, hvilket resulterer i en konstant partikelhastighed på henholdsvis 25 μg/cm2,50 μg/cm2 og 100 μg/cm2 på cellerne efter henholdsvis 15, 30 eller 60 min. De deponerede partikler blev dog ikke vasket af efter aflejring, men forblev på cellerne i 24 timer. Partiklernes aflejringstider var derfor 15, 30 og 60 min, men eksponeringen af cellerne varede i 24 timer i alt. Teststoffernes depositionrate blev fastsat ved indledende forsøg efter tidligere metoder17.
Cellelevedygtigheden som indikator for toksicitet blev vurderet 24 timer efter partikelaflejring ved hjælp af en cellelevedygtighedsanalyse. Der blev sat særlig fokus på kvaliteten af ren luftkontrol, optimering og forfinelse af eksponeringsprotokollen, intra- og interlaboratoriereproducerbarheden og etablering af en forudsigelsesmodel (PM). Stoffer, der førte til et fald i cellelevedygtigheden på under 50 % (PM 50 %) eller 75% (PM 75%) ved en af de tre eksponeringsdoser blev anset for at have en akut inhalationsfare. Resultaterne blev derefter sammenlignet med eksisterende in vivo-data (baseret på mindst én pålidelig undersøgelse ifølge OECD's testretningslinje (TG) 403 eller TG 43621,22), hvilket førte til en samlet overensstemmelse på 85 %, med en specificitet på 83 % og en følsomhed på 88 %23.
Ud over måling af cellelevedygtighed kan andre endepunkter såsom cytokinfrigivelse, undersøgelse af cellelysate- eller membranintegriteten via LDH-analyse vurderes, men var ikke påkrævet til valideringsundersøgelsen. Eksponeringssystemet (f.eks. Følgende protokol anbefales til eksponeringsforsøg med luftbårne partikler ved hjælp af dette eksponeringssystem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium and supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>FG 0415</td>
			<td>used as growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td>22320</td>
			<td>used as exposure medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S 0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10mg/mL)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>A 2710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Th. Geyer, Renningen, Germany</td>
			<td>L 0180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 2143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cups</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3516</td>
			<td>6&#173;-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell cell culture inserts</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3450</td>
			<td>24mm inserts; 6-&#173;well plates; 0.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASYton</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Air (DIN EN 12021)</td>
			<td>Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td>2290152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab155902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments + equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cell Counter</td>
			<td>Sch&#228;rfe System GmbH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation thermostat</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline RE 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX HyP - Hydraulic Press</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX insert sleeve</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (large)</td>
			<td>Munktell &#38; Filtrak GmbH, Sachsen, Germany</td>
			<td>LP-050</td>
			<td>Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency &#62; 99,999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (small)</td>
			<td>Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany</td>
			<td>9933-05-DQ</td>
			<td>Balston disposable filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pump</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td>Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser</td>
			<td>digital peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader Infinite M200 Pro</td>
			<td>Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vakuum pump</td>
			<td>KNF, Freiburg, Germany</td>
			<td>N86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#246;gtlin mass flow controller 0,2-10 l/min</td>
			<td>TrigasFI GmbH</td>
			<td>V&#246;gtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline Staredition RE 104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface

Her præsenterer vi et specielt designet modulopbygget in vitro eksponeringssystem, der muliggør ensartet eksponering af dyrkede menneskelige lungeceller på ALI til gasser, partikler eller komplekse atmosfærer (f.eks cigaretrøg), hvilket giver realistiske fysiologiske eksponering af den menneskelige alveolærs apiske overflade for luft. I modsætning til sekventielle eksponeringsmodeller med lineær aerosolvejledning opfylder det modulære design af radiale flowsystem alle krav til kontinuerlig generering og transport af testatmosfæren til cellerne, en homogen fordeling og aflejring af partiklerne og den fortsatte fjernelse af atmosfæren. Denne eksponeringsmetode er primært beregnet til at blive eksponeret for celler for luftbårne partikler, men kan tilpasses eksponeringen af flydende aerosoler og meget giftige og aggressive gasser afhængigt af aerosolproduktionsmetoden og eksponeringsmodulernes materiale .
Inden for rammerne af en nyligt afsluttet valideringsundersøgelse blev dette eksponeringssystem bevist som en overførbar, reproducerbar og prædiktiv screeningsmetode til kvalitativ vurdering af luftbårne partiklers akutte lungecytotoksicitet, hvorved luftbårne partikler blev vurderet, potentielt reducere eller erstatte dyreforsøg, som normalt ville give denne toksikologiske vurdering.

CULTEX RFS er et specialdesignet modulopbygget in vitro-eksponeringssystem, der muliggør direkte og homogen eksponering af celler ved ALI' en. Inden for en tidligere prævalideringsundersøgelse blev det med succes påvist, at dette eksponeringssystem generelt kunne anvendes, og dets omsættelighed, stabilitet og reproducerbarhed. I et nyligt forskningsprojekt finansieret af det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning blev eksponeringssystemet med succes valideret og etable...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Vi præsenterer et robust, overførbart og prædiktivt in vitro eksponeringssystem til screening og overvågning af luftbårne partikler vedrørende deres akutte lungecytotoksicitet ved at udsætte dyrkede menneskelige lungeceller på luftflydende interface (ALI).

Vurdering af de luftbårne partiklers akutte toksicitet ved indånding ved at udsætte dyrkede humane lungeceller ved luftflydende interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Screening af luftbårne partikler vedrørende den akutte lungecytotoksicitet ved at eksponere dyrkede humane lungeceller ved ALI ved hjælp af dette in vitroeksponeringssystem kan bidrage til at reducere dyreforsøg. Den største fordel ved dette eksponeringssystem er det radiale aerosolfordelingskoncept, der fører til en homogen fordeling og partiklernes placering på cellerne. Før såning cellerne, tilsættes 2,5 milliliter hærdet vækstmedium til hver brønd af en seks brøndplade.Placer cellekultur skær uden celler omhyggeligt inde i brøndene og tilsæt en milliliter vækstmedium til hver celle kultur indsætte. Inkuber pladerne i 30 minutter ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Efter trypsinisering af celler, fortyndes 100 mikroliter af cellekultur suspension i en kop fyldt med 10 milliliter isotonisk opløsning.Vip koppen langsomt uden at ryste. På en celletæller bestemmes antallet af levedygtige celler pr. milliliter og cellepergivbarhed baseret på de cellespecifikke måleparametre for A549-celler. Efter temperering af pladen, aspirere mediet i cellekultur skær og frø en milliliter A549 celler med en tæthed på tre gange 10 til den femte celler pr milliliter i hver cellekultur indsætte.Fordel cellesuspensionen ved skånsom rokkende og inkuber i 24 timer. Indstil pressetiden via tidskontrollen på forsiden af pressen. Åbn tryklufttilførslen ved trykluftventilen.Ved hjælp af trykregulatoren på forsiden af pressen skal tryklufttrykket indstilles til ca. to bar. Træk skuffen ud, tryk på trykknappen, og aflæs trykketrykket på den digitale trykkontakt. Fyld stofbeholderen med en lille mængde af teststoffet.Sæt stemplet ind i stofbeholderen og drej det lidt frem og tilbage for at fordele pulveret jævnt i beholderen. Anstænker stofbeholderen med stemplet i skuffen, og tryk på trykknappen. Åbn skuffen, og fjern stemplet.Et kritisk trin er presningen af teststoffer, der specifikt skal komprimeres til en pulverkage i stofbeholderen for at muliggøre stabil partikeleksponering. Fjern indløbsadapteren og kondensat reflektoren fra aerosolets styremodul. Luk de tre aerosolboringsboringer i aerosolledningsmodulet med stik og mellemtilførselsforbindelserne ved prøvetagningsmodulet med dummyflapper.Forbind vakuumledningerne med rørstikket på aerosolets styremodul. Brug håndhjulet til at lukke modulet og måle værdien af flowregulatorerne. Et par minutter efter lukning falder værdierne til under fem milliliter i minuttet.Start aerosolgeneratorsoftwaren. Hvis stofskraberen ikke er i den laveste position, skal du trykke på knappen Homing Mode. Stofbeholderen med det pressede testmateriale på hovedet over stofskraberen.Sørg for, at glaset i stofbeholderen vender mod forsiden. Sæt låsepladen i åbningen over stofbeholderen, og stram den sorte skrue. Skift værdierne for Feed og Rotation til de ønskede indstillinger.Brug de nedadgående pile til at skubbe diaset ned med stofbeholderen, indtil stofskraberen er i nærheden af det pressede stof. Åbn tryklufttilførslen til aerosolgeneratoren med en hane af masseflowregulatoren, og start aerosolgenereringen ved at klikke på knappen Start. Indstil foderhastigheden til 15 til 20 millimeter i timen for at undgå lange ventetider.Styr den korrekte partikelgenerering ved at observere den fine støvsky med en lille lommelygte placeret nedefra bag elutriatorens glasrør. Start mellemforsyningen med forvarmet eksponeringsmedium, og fyld prøvetagningsmodulerne, indtil nedløbsrørene er dækket, mens modulet er åbent. Indsæt blind cellekultur skær i eksponeringsmodulet, pumpe eksponeringsmediet ned, indtil nedløbsrørene er dækket med medium, og den nederste side af skærne er i kontakt med medium.Start aerosolgeneratoren, luk eksponeringsmodulet, og tilslut eksponeringsmodulet til aerosolgeneratorens eksponeringsmodul. 30 minutter efter leveringstiden skal elutriatorens eksponeringsmodul lukkes med en gummiprop og blindindsatserne fjernes. Opfyld eksponeringsmediet igen, indtil nedløbsrørene er dækket med medium.Fjern cellekultur skær fra de seks brøndplader ved hjælp af pincet. Hæld vækstmediet forsigtigt fra cellekulturen ud ved at vælte skærene og bruge en pipette til at aspirere og kassere den resterende væske. Anstævn i eksponeringskamrene for både eksponerings- og renluftsmodulerne.Luk modulerne, og start eksponeringsforsøgene ved at forbinde eksponeringsmodulet med aerosolgeneratorens eksponeringsmodul og renluftmodulet med luftfartsselskabets gasforsyning samtidigt. Efter forsøgets afslutning skal eksponerings- og renluftmodulerne afbrydes, og eksponeringsmodulets udløb forsegles. Stop tryklufttilførslen og aerosolgeneratoren ved at klikke på stopknappen.Åbn eksponeringen og ren luft modul og bruge pincet til at overføre cellekultur skær til den forberedte post-inkubation seks godt plader. Inkuber de seks brøndplader, samt de ueksponerede cellekultur skær, i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid på luft væske interface. 24 timer efter eksponering indsættes cellekulturindsatserne i de nye forberedte seks brøndplader.Tilføj en milliliter af den frisklavede WST1-løsning til hver cellekulturindsats. Sten pladerne forsigtigt for at fordele opløsningen homogent på cellerne. Inkuber de seks brøndplader med cellekulturindsatserne i en time ved 37 grader Celsius og 5 % kuldioxid.Derefter overføres 100 mikroliter af supernatanten i tre eksemplarer fra hver seks brøndplade til en 96 brøndplade. Ved hjælp af en mikropladelæser måles absorbansen ved 450 nanometer med en referencebølgelængde på 650 nanometer. CULTEX RFS er et specialdesignet modulopbygget in vitro-eksponeringssystem, der muliggør direkte og homogen eksponering af celler for luftbårne partikler ved luftvæskegrænsefladen.Eksponering af celler for ren luft fører ikke til nogen reduktion af cellernes levedygtighed over tid. Eksponeringssystemet blev valideret og etableret som en forudsigelsesmodel for akutte inhalationsfarer for de testede forbindelser. Eksponering af A549-celler for forskellige teststoffer, der ikke udviste, medium eller stærk toksicitet.Sørg for, at du nøje opbevarer de tidsrammer, der er inkubationstider, leveringstiden for partikelgenerering og partikeludlejringstiderne. Denne eksponeringsmetode er primært beregnet til cellers partikeleksponering, men kan udvides til at omfatte eksponering af flydende aerosoler og gasser ved at tilpasse aerosolgenereringsmetoden. Denne screeningsmetode muliggør en kvalitativ vurdering af inhalerbare partikler med hensyn til den akutte inhalationstoksicitet in vitro og reducerer dermed dyreforsøg, der normalt ville give denne toksikologiske vurdering.Glem ikke, at arbejde med giftige teststoffer kan være yderst farligt og forholdsregler, såsom iført handsker, en maske, bør altid tages, når håndtering af sådanne forbindelser.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flowcytometri cellebaseret assay til påvisning af antistoffer til N-methyl-D-aspartat-receptor eller dopamin-2-receptoren i humant serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

En murin model af myokardieiskæmi-reperfusionsskade gennem æggelederne for Venstre Anterior Faldende Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolering af human lymfeendotelceller af Multi-parameter Fluorescens-aktiveret cellesortering

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Diffus optisk spektroskopi til kvantitativ vurdering af akut ioniserende stråling induceret hudtoksicitet Brug af mus Model

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Primære resultatvurdering i en Pig Model af akut myokardieinfarkt

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Åbent Tracheostomituber Gastric Acid Aspiration murin model af akut lungeskade Resultater i Maximal Akut ikke-letale Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: et redskab til måling<em&gt; In vivo</em&gt; Mitokondrie Oxidativ phosphorylering Kapacitet i human skeletmuskulatur

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Inducerende akut lungeskade i mus ved direkte Intratracheal Lipopolysaccharid instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Oral Health Assessment by Lay Personnel for Older Adults

Mundtlig sundhedsvurdering foretaget af lægpersonale til ældre voksne

Oral health is an often-undervalued contributor to overall health. The literature, however, underscores the myriad of systemic diseases influenced by oral ...