Name: assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface
Uploaded: 2020-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het Duitse federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Duitsland (Grant 031A581, subproject A-D)) en door de Duitse Research Foundation (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Research Training Group GRK 2338).

OPMERKING: Het protocol van één blootstellingsexperiment bestrijkt een periode van drie dagen.
Dag 1
1. Algemene preparaten en teelt van cellen
OPMERKING: De menselijke long adenocarcinome epitheliale cellijn A549 werd gebruikt voor blootstelling experimenten. Cellen moeten onder steriele omstandigheden worden behandeld. Andere cellijnen die geschikt zijn voor teelt bij de ALI kunnen worden gebruikt.
<ol><li>Bereid het groeimedium (Du...

<ol>
	<li>Faber, S. C., McCullough, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+the+Looking+Glass:+In+vitro+Models+for+Inhalation+Toxicology+and+Interindividual+Variability+in+the+Airway.">Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).</li><li>De Matteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+challenges+in+occupational+lung+diseases.">Current and new challenges in occupational lung diseases.</a> European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).</li><li>LANUV Nordrhein-Westfalen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).</li><li>B&#233;rub&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Inhalation+Toxicity+and+Disease.+The+report+of+a+FRAME+workshop.">In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop.</a> Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).</li><li>Lopez, A. D., Murray, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+disease,+1990-2020.">The global burden of disease, 1990-2020.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).</li><li>Clippinger, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+approaches+for+acute+inhalation+toxicity+testing+to+address+global+regulatory+and+non-regulatory+data+requirements:+An+international+workshop+report.">Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report.</a> Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).</li><li>Agrawal, M. R., Winder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+and+Occurrence+of+LD50+Values+for+Materials+in+the+Workplace.">Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace.</a> Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).</li><li>Amtsblatt der Europ&#228;ischen Union. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verordnung+(EG)+Nr.+1907/2006+des+Europ&#228;ischen+Parlaments+und+des+Rates.">Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europ&#228;ischen Parlaments und des Rates.</a> Europ&#228;ische Union. 860, (2006).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+Organ-Level+Lung+Functions+on+a+Chip.">Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Fisher, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Human+Lung+Slices+in+Toxicology.">The Use of Human Lung Slices in Toxicology.</a> Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).</li><li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+and+Oxidative+Stress+Responses+of+an+Alveolar+Epithelial+Cell+Line+to+Airborne+Zinc+Oxide+Nanoparticles+at+the+Air-Liquid+Interface.">Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 12, (2013).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+as+an+in+vitro+exposure+method+to+assess+acute+pulmonary+toxicity+of+fine+dusts+and+nanoparticles+with+special+focus+on+the+intra-+and+inter-laboratory+reproducibility.">Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility.</a> Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).</li><li>Lacroix, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-Liquid+Interface+In+vitro+Models+for+Respiratory+Toxicology+Research.">Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).</li><li>Eskes, C., Whelan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, (2016).</li><li>Rach, J., Budde, J., M&#246;hle, N., Aufderheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+exposure+at+the+air-liquid+interface:+Evaluation+of+an+in+vitro+approach+for+simulating+inhalation+of+airborne+substances.">Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances.</a> Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).</li><li>Aufderheide, M., Halter, B., M&#246;hle, N., Hochrainer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CULTEX+RFS:+A+comprehensive+Technical+Approach+for+the+In+vitro+Exposure+of+Airway+Epithelial+Cells+to+the+Particulate+Matter+at+the+Air-Liquid+Interface.">The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 15, (2013).</li><li>Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Carterson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates:+Alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).</li><li>Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+useful+in+vitro+model+for+transport+studies+of+alveolar+epithelial+barrier.">A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier.</a> Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+403:+Acute+Inhalation+Toxicity.">Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+436:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+for+the+assessment+of+the+acute+inhalation+toxicity+of+airborne+particles.">Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles.</a> Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+exposure+system+generating+nebulized+aerosol+of+sulfur+mustard+in+comparison+to+the+standard+submerse+exposure.">A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure.</a> Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+CULTEX+radial+flow+system+for+in+vitro+investigation+of+lung+damaging+agents.">Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents.</a> Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).</li><li>Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+GS-NS0+myeloma+cells+to+pH+shifts+and+pH+perturbations.">The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+Guideline+433:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2018).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , (2018).</li></ol>

De afgelopen jaren zijn veel niet-dierinhalatietestmodellen ontwikkeld om informatie te verkrijgen over het acute inademingsgevaar van inhaleerbare deeltjes en om dierproeven te verminderen en te vervangen volgens het 3R-principe25.
In termen van celkweekmodellen kan blootstelling van cellen worden gedaan onder ondergedompelde omstandigheden of bij de ALI. Het blootstellen van cellen onder ondergedompelde omstandigheden kan de fysisch-chemische eigenschappen en dus de t...

Het inademen van giftige deeltjes in de lucht is een zorg voor de volksgezondheid, wat leidt tot een veelheid aan gezondheidsrisico's wereldwijd en vele miljoenen sterfgevallen per jaar1,2. De klimaatverandering, de aanhoudende industriële ontwikkeling en de stijgende vraag naar energie-, landbouw- en consumentenproducten hebben de afgelopen jaren bijgedragen tot de toename van longziekten3,4,5,6. Kennis en evaluatie van inhaleerbare stoffen met betrekking tot hun acute inhalatietoxiciteit vormen de basis voor risicobeoordeling en risicobeheer, maar deze informatie ontbreekt nog steeds voor een breed scala van deze stoffen7,8. Sinds 2006 vereist de EU-chemische wetgeving REACH (Registratie, Evaluatie, Autorisatie en Beperking van chemische stoffen) dat reeds bestaande en nieuw geïntroduceerde producten een toxicologische karakterisering ondergaan, inclusief de inademingsroute voordat ze in de handel worden gebracht. Daarom richt REACH zich op alternatieve en diervrije methoden, de toepassing van het "3R"-principe (vervanging, verfijning en vermindering van dierproeven) en het gebruik van geschikte in vitro modellen9. In de afgelopen jaren zijn veel verschillende en adequate niet-dierlijke inhalatietoxiciteitstestmodellen ontwikkeld (bijvoorbeeld in vitro celculturen, long-op-a-chipmodellen, precisiegesneden longschijfjes(PCLS)) om de acute inhalatietoxiciteit van deeltjes in de lucht 5,7,10,11te beoordelen. In termen van in vitro celkweekmodellen kunnen gekweekte cellen onder ondergedompelde omstandigheden of aan de ALI (figuur 1) worden blootgesteld. De validiteit van onderzoeken naar blootstelling onder water is echter beperkt met betrekking tot de beoordeling van de toxiciteit van verbindingen in de lucht, met name deeltjes. Blootstellingstechnieken onder water komen niet overeen met de situatie van mens in vivo; het celkweekmedium dat de cellen bedekt, kan de fysisch-chemische eigenschappen en dus de toxische eigenschappen van een teststof12,13beïnvloeden. ALI in vitro inademingsmodellen maken de directe blootstelling van cellen aan de teststoffen zonder interferentie van het celkweekmedium met testdeeltjes mogelijk, waardoor menselijke blootstelling met een hogere fysiologische en biologische gelijkenis wordt nagebootst dan ondergedompelde blootstellingen12,14.
Voor regelgevingsprocessen zoals REACH zijn echter alleen diermodellen beschikbaar op het gebied van acute inhalatietoxicologie, aangezien geen enkele alternatieve in vitro methoden voldoende zijn gevalideerd en tot nu toe officieel zijn aanvaard14. Daartoe moeten testmodellen worden gevalideerd volgens de eisen van het referentielaboratorium van de Europese Unie voor alternatieven voor dierproeven (EURL-ECVAM) beginselen inzake testvalide15.
Een voormalige pre-validatie studie en een onlangs afgeronde validatie studie met succes aangetoond dat de toepassing gebied van de CULTEX RFS blootstelling systeem en de overdraagbaarheid, stabiliteit, en reproduceerbaarheid13. Dit blootstellingssysteem is een in vitro celgebaseerd blootstellingssysteem dat homogene blootstelling van cellen aan gassen, deeltjes of complexe atmosferen (b.v., sigaretrook) bij ALI toe te schrijven aan zijn radiaal aërosoldistributieconcept en de geleiding van de testaerosol in een ononderbroken stroom over de cellen16mogelijk maakt. De basismodule van dit radiale stroomsysteem bestaat uit de inlaatadapter, de spuitbusgeleidingsmodule met een radiale aerosolverdeling, de bemonsterings- en socketmodule en een vergrendelingsmodule met een handwiel (figuur 2). De gegenereerde deeltjes bereiken de cellen via de inlaatadapter en de aerosolgeleidingsmodule en worden afgezet op de wisselplaten van de celkweek, die zich bevinden in de drie radiaal gerangschikte blootstellingskamers van de bemonsteringsmodule. De spuitbusgeleidingsmodule en de bemonsteringsmodule kunnen worden verwarmd door verbinding te maken met een extern waterbad17.
In het kader van beide studies werden A549-cellen gebruikt voor alle blootstellingsexperimenten. De cellijn A549 is een menselijke vereeuwigde epitheliale cellijn die zeer goed wordt gekenmerkt en is gebruikt als een in vitro model voor type II alveolar epitheelcellen in tal van toxicologische studies. De cellen worden gekenmerkt door lamellenlichamen, de productie van oppervlakteactieve stof en een aantal ontstekingsrelevante factoren18. Ze tonen ook eigenschappen van bronchiale epitheelcellen als gevolg van hun slijmproductie19. Bovendien kunnen ze worden gekweekt op de ALI. Hoewel deze cellijn tekort is aan het bouwen van celcelcontacten, is de teelt van deze cellen veel handiger, goedkoper en zijn de daaruit verkregen resultaten donoronafhankelijk in vergelijking met primaire cellen20.
A549 cellen werden gezaaid in 6-put cel kweek inserts (PET membraan, 4,67 cm2, porie grootte 0,4 mm) met een dichtheid van 3,0 x 105 cellen per insert en gekweekt voor 24 uur onder ondergedompelde omstandigheden. Cellen werden vervolgens blootgesteld in drie onafhankelijke laboratoria aan schone lucht en drie verschillende blootstellingsdoses (25, 50 en 100 μg/cm2)van 20 teststoffen in de ALI. De blootstellingsdosis is gecorreleerd aan de afzettingstijd die resulteert in een constante deeltjessnelheid van 25 μg/cm2, 50 μg/cm2 en 100 μg/cm2 op de cellen na respectievelijk 15, 30 of 60 min. De gedeponeerde deeltjes werden echter niet afgewassen na afzetting, maar bleven 24 uur op de cellen. De depositietijden van de deeltjes waren daarom 15, 30 en 60 min, maar de blootstelling van de cellen duurde in totaal 24 uur. De depositiesnelheid van de teststoffen werd bepaald in voorlopige experimenten volgens eerdere methoden17.
De levensvatbaarheid van cellen als indicator van toxiciteit werd 24 uur na deeltjesdepositie beoordeeld met behulp van een cellevensvatbaarheidstest. Bijzondere aandacht werd besteed aan de kwaliteit van schone luchtcontroles, de optimalisatie en verfijning van het blootstellingsprotocol, de reproduceerbaarheid binnen- en interlaboratorium en de invoering van een voorspellingsmodel (PM). Stoffen die hebben geleid tot een afname van de levensvatbaarheid van cellen onder de 50% (PM 50%) of 75% (PM 75%) bij een van de drie blootstellingsdoses werden beschouwd als een acuut inademingsgevaar. De resultaten werden vervolgens vergeleken met bestaande in vivo gegevens (op basis van ten minste één betrouwbare studie volgens de OESO-testrichtlijn (TG) 403 of TG 43621,22), wat leidde tot een algemene overeenstemming van 85%, met een specificiteit van 83% en een gevoeligheid van 88%23.
Naast de meting van de levensvatbaarheid van de cel kunnen andere eindpunten zoals cytokinerelease, onderzoek van het cellysaat of membraanintegriteit via LDH-test worden beoordeeld, maar waren niet vereist voor het validatieonderzoek. Zo werd het blootstellingssysteem (bijvoorbeeld CULTEX RFS) bewezen als een voorspellend screeningsysteem voor de kwalitatieve beoordeling van de acute inhalatietoxiciteit van de geteste deeltjes in de lucht, wat een veelbelovende alternatieve methode voor dierproeven vertegenwoordigt. Het volgende protocol wordt aanbevolen voor blootstellingsexperimenten aan deeltjes in de lucht die dit blootstellingssysteem gebruiken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium and supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>FG 0415</td>
			<td>used as growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td>22320</td>
			<td>used as exposure medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S 0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10mg/mL)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>A 2710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Th. Geyer, Renningen, Germany</td>
			<td>L 0180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 2143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cups</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3516</td>
			<td>6&#173;-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell cell culture inserts</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3450</td>
			<td>24mm inserts; 6-&#173;well plates; 0.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASYton</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Air (DIN EN 12021)</td>
			<td>Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td>2290152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab155902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments + equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cell Counter</td>
			<td>Sch&#228;rfe System GmbH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation thermostat</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline RE 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX HyP - Hydraulic Press</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX insert sleeve</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (large)</td>
			<td>Munktell &#38; Filtrak GmbH, Sachsen, Germany</td>
			<td>LP-050</td>
			<td>Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency &#62; 99,999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (small)</td>
			<td>Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany</td>
			<td>9933-05-DQ</td>
			<td>Balston disposable filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pump</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td>Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser</td>
			<td>digital peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader Infinite M200 Pro</td>
			<td>Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vakuum pump</td>
			<td>KNF, Freiburg, Germany</td>
			<td>N86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#246;gtlin mass flow controller 0,2-10 l/min</td>
			<td>TrigasFI GmbH</td>
			<td>V&#246;gtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline Staredition RE 104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface

Hier presenteren we een speciaal ontworpen modulair in vitro blootstellingssysteem dat de homogene blootstelling van gecultiveerde menselijke longcellen in de ALI aan gassen, deeltjes of complexe atmosferen (bijv. sigarettenrook) mogelijk maakt, waardoor realistische fysiologische blootstelling van het apicale oppervlak van het menselijk alveolargebied aan lucht. In tegenstelling tot sequentiële blootstellingsmodellen met lineaire aerosolgeleiding voldoet het modulaire ontwerp van het radiale stroomsysteem aan alle eisen voor de continue opwekking en het transport van de testatmosfeer naar de cellen, een homogene verdeling en afzetting van de deeltjes en de continue verwijdering van de atmosfeer. Deze blootstellingsmethode is voornamelijk ontworpen voor de blootstelling van cellen aan deeltjes in de lucht, maar kan worden aangepast aan de blootstelling van vloeibare aerosolen en zeer giftige en agressieve gassen, afhankelijk van de methode voor het genereren van aerosolen en het materiaal van de blootstellingsmodules .
In het kader van een recent afgerond validatieonderzoek werd dit blootstellingssysteem bewezen als een overdraagbare, reproduceerbare en voorspellende screeningsmethode voor de kwalitatieve beoordeling van de acute longcytotoxiciteit van deeltjes in de lucht, mogelijk dierproeven verminderen of vervangen die normaal gesproken deze toxicologische beoordeling zouden opleveren.

De CULTEX RFS is een speciaal ontworpen modulair in vitro blootstellingssysteem dat de directe en homogene blootstelling van cellen in de ALI mogelijk maakt. In een eerdere prevalidatiestudie werden met succes de algemene toepasbaarheid van dit blootstellingssysteem en de overdraagbaarheid, stabiliteit en reproduceerbaarheid ervan aangetoond. In een recent onderzoeksproject gefinancierd door het Duitse federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek, werd het blootstellingssysteem met succ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

We presenteren een robuust, overdraagbaar en voorspellend in vitro blootstellingssysteem voor de screening en monitoring van deeltjes in de lucht met betrekking tot hun acute longcytotoxiciteit door gecultiveerde menselijke longcellen bloot te stellen op de lucht-vloeibare interface (ALI).

Beoordeling van de acute inademingstoxiciteit van deeltjes in de lucht door gecultiveerde menselijke longcellen bloot te stellen op de Air-Liquid Interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Het screenen van deeltjes in de lucht met betrekking tot de acute longcytotoxiciteit door het blootstellen van gecultiveerde menselijke longcellen in het ALI met behulp van dit in vitro blootstellingssysteem kan helpen om dierproeven te verminderen. Het belangrijkste voordeel van dit blootstellingssysteem is het radiale aerosol distributieconcept dat leidt tot een homogene verdeling en de positie van de deeltjes op de cellen. Voordat u de cellen zaait, voegt u 2,5 milliliter getemperd groeimedium toe aan elke put van een zesputplaat.Plaats de celcultuur voegt zonder cellen zorgvuldig in de putten en voeg een milliliter groeimedium aan elke celcultuur insert. Incubeer de platen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Verdun na trypsinisatie van cellen 100 microliters van de celcultuursuspensie in een beker gevuld met 10 milliliter isotone oplossing.Kantel de beker langzaam zonder te schudden. Bepaal op een celteller het aantal levensvatbare cellen per milliliter en de levensvatbaarheid van de cel op basis van de celspecifieke meetparameters van A549-cellen. Na het temperen van de plaat, aspirate het medium binnen de celcultuur inserts en zaad een milliliter van A549 cellen met een dichtheid van drie keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter in elke cel cultuur insert.Verdeel de celopening door zacht te schommelen en 24 uur in te broeden. Stel de perstijd in via de tijdscontrole aan de voorzijde van de pers. Open de persluchttoevoer bij de persluchtklep.Met behulp van de drukregelaar aan de voorzijde van de pers, zet de persluchtdruk op ongeveer twee bar. Trek de lade eruit, druk op de drukknop en lees de druk op de digitale drukschakelaar. Vul de stofcontainer met een kleine hoeveelheid van de teststof.Steek de zuiger in de stofcontainer en draai het lichtjes heen en weer om het poeder gelijkmatig in de container te verdelen. Plaats de stofcontainer, met de zuiger, in de lade en druk op de drukknop. Open de lade en verwijder de zuiger.Een cruciale stap is het persen van teststoffen die specifiek moeten worden gecomprimeerd tot een poedertaart in de stoffencontainer om stabiele deeltjesblootstelling mogelijk te maken. Verwijder de inlaatadapter en de condensaatreflector uit de aerosolgeleidingsmodule. Sluit de drie spuitbussen in de spuitbusgeleidingsmodule met stekkers en de medium supply connections bij de bemonsteringsmodule met dummy flaps.Sluit de vacuümlijnen aan met de buisconnector van de aerosolgeleidingsmodule. Gebruik het handwiel om de module te sluiten en de waarde van de stroomcontrollers te meten. Een paar minuten na het sluiten dalen de waarden tot minder dan vijf milliliter per minuut.Start de aerosol generator software. Als de stofschraper zich niet in de laagste stand bevindt, drukt u op de knop Homing Mode. Plaats de stoffen container met het geperste testmateriaal ondersteboven over de stof schraper.Zorg ervoor dat het glas van de stof container naar voren. Plaats de vergrendelingsplaat in de sleuf over de inhoudscontainer en draai de zwarte schroef aan. Wijzig de waarden voor Feed en Rotation naar de gewenste instellingen.Gebruik de neerwaartse pijlen om de dia met de stofcontainer naar beneden te duwen totdat de stofschraper zich in de buurt van de geperste stof bevindt. Open de persluchttoevoer naar de spuitbusgenerator met een tik op de massastroomregelaar en start de spuitbussengeneratie door op de startknop te klikken. Stel de voersnelheid in op 15 tot 20 millimeter per uur om lange wachttijden te voorkomen.Bedien de juiste deeltjesproductie door de fijne stofwolk te observeren met een kleine zaklamp van onderen achter de glazen buis van de elutriator. Start de medium toevoer met voorverwarmd belichtingsmedium en vul de bemonsteringsmodules totdat de downpipes zijn afgedekt terwijl de module open is. Steek blinde cel cultuur inserts in de belichtingsmodule, pomp de belichting medium naar beneden totdat de downpipes zijn bedekt met medium en de onderkant van de wisselplaten in contact staan met medium.Start de spuitbusgenerator, sluit de belichtingsmodule en sluit de belichtingsmodule aan op het uitlaat van de belichtingsmodule van de aerosolgenerator. Sluit 30 minuten na de doorlooptijd de uitzetstop van de belichtingsmodule af met een rubberen stekker en verwijder de rolluiken. Vul het belichtingsmedium opnieuw totdat de downpipes zijn bedekt met medium.Verwijder de celcultuur inserts uit de zes putplaten met behulp van pincet. Giet het groeimedium voorzichtig uit de celcultuur inzetstukken af door het omvallen van de inzetstukken en gebruik een pipet aan te trekken en gooi de resterende vloeistof. Plaats de wisselplaten in de belichtingskamers van zowel de belichtings- als de schone luchtmodules.Sluit de modules en start de blootstellingsexperimenten door de blootstellingsmodule gelijktijdig aan te sluiten op het uitlaat van de blootstellingsmodule van de spuitbus en de schone luchtmodule op de gastoevoer van de drager. Na voltooiing van het experiment koppelt u de belichtings- en schone luchtmodules los en verzegelt u het uitlaat van de belichtingsmodule. Stop de persluchttoevoer en de spuitbusgenerator door op de stopknop te klikken.Open de belichtings- en schone luchtmodule en gebruik een pincet om de celcultuurwisselplaten over te brengen naar de voorbereide zes putplaten na incubatie. Broed de zes putplaten, evenals de onbelichte celcultuur inserts, gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide op de lucht vloeistof interface. 24 uur na blootstelling, steek de cel cultuur inserts in de nieuwe voorbereide zes goed platen.Voeg een milliliter van de vers bereide WST1-oplossing toe aan elke celcultuurinsert. Rock de platen zorgvuldig om de oplossing homogeen over de cellen te verdelen. Incubeer de zes putplaten met de celcultuur voegt voor een uur op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide.Daarna, breng 100 microliter van de supernatant in drievouden van elke zes put plaat naar een 96 put plaat. Met behulp van een microplatelezer meet u de absorptie op 450 nanometer met een referentiegolflengte van 650 nanometer. De CULTEX RFS is een speciaal ontworpen modulair in vitro blootstellingssysteem dat de directe en homogene blootstelling van cellen aan deeltjes in de lucht op de luchtvloeistofinterface mogelijk maakt.Blootstelling van cellen aan schone lucht leiden tot geen afname van de levensvatbaarheid van de cel na verloop van tijd. Het blootstellingssysteem werd met succes gevalideerd en vastgesteld als een voorspellingsmodel voor acute inademingsgevaren van de geteste verbindingen. Blootstelling van A549-cellen aan verschillende teststoffen die geen, gemiddelde of sterke toxiciteit vertoonden.Zorg ervoor dat u strikt de termijnen houdt die de incubatietijden zijn, de doorlooptijd van de deeltjesproductie en de deeltjesdepositietijden. Deze blootstellingsmethode is in de eerste plaats ontworpen voor de blootstelling van deeltjes van cellen, maar kan worden uitgebreid tot de blootstelling van vloeibare aerosolen en gassen door de methode voor de opwekking van aërosolen aan te passen. Deze screeningsmethode maakt een kwalitatieve beoordeling mogelijk van inhaleerbare deeltjes met betrekking tot de acute inademingstoxiciteit in vitro, waardoor dierproeven worden verminderd die normaal gesproken deze toxicologische beoordeling zouden opleveren.Vergeet niet dat het werken met giftige teststoffen zeer gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, een masker, moet altijd worden genomen bij het hanteren van dergelijke verbindingen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Isolatie van Mouse Respiratory epitheelcellen en Blootstelling aan Experimentele Cigarette Smoke bij Air Liquid Interface

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Een muizenmodel van myocard ischemie-reperfusie schade door de eileiders van de LAD

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolatie van menselijke lymfatische endotheelcellen door Multi-parameter fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Diffuse optische spectroscopie voor de kwantitatieve beoordeling van Acute ioniserende straling veroorzaakte Huidtoxiciteit Met behulp van een muismodel

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Primaire Outcome Assessment in een Varken Model acuut myocardinfarct

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Open Tracheostomie Maagzuur Aspiration muizenmodel van Acute Lung Injury Resultaten in Maximal Acute Lung Injury nonlethal

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 magnetische resonantie spectroscopie: een instrument voor het meten<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial Oxydatieve Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Inducerende acute Long blessure bij muizen door directe Intratracheal lipopolysaccharide instillatie

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Oral Health Assessment by Lay Personnel for Older Adults

Oral Health Assessment door lekenvoor oudere volwassenen

Oral health is an often-undervalued contributor to overall health. The literature, however, underscores the myriad of systemic diseases influenced by oral ...