Name: assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface
Uploaded: 2020-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le Ministère fédéral allemand de l’éducation et de la recherche (Bundesministerium f’r Bildung und Forschung, BMBF, Allemagne (Grant 031A581, sous-projet A-D)) et par la Fondation allemande de la recherche (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Groupe de formation à la recherche GRK 2338).

REMARQUE : Le protocole d’une expérience d’exposition couvre une période de trois jours.
Jour 1
1. Préparations générales et culture des cellules
REMARQUE : La ligne épithéliale d’adénocarcinome humain d’adénocarcinome A549 a été employée pour des expériences d’exposition. Les cellules doivent être manipulées dans des conditions stériles. D’autres lignées cellulaires qui conviennent à la culture à l’ALI peuv...

<ol>
	<li>Faber, S. C., McCullough, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+the+Looking+Glass:+In+vitro+Models+for+Inhalation+Toxicology+and+Interindividual+Variability+in+the+Airway.">Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).</li><li>De Matteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+challenges+in+occupational+lung+diseases.">Current and new challenges in occupational lung diseases.</a> European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).</li><li>LANUV Nordrhein-Westfalen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).</li><li>B&#233;rub&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Inhalation+Toxicity+and+Disease.+The+report+of+a+FRAME+workshop.">In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop.</a> Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).</li><li>Lopez, A. D., Murray, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+disease,+1990-2020.">The global burden of disease, 1990-2020.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).</li><li>Clippinger, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+approaches+for+acute+inhalation+toxicity+testing+to+address+global+regulatory+and+non-regulatory+data+requirements:+An+international+workshop+report.">Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report.</a> Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).</li><li>Agrawal, M. R., Winder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+and+Occurrence+of+LD50+Values+for+Materials+in+the+Workplace.">Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace.</a> Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).</li><li>Amtsblatt der Europ&#228;ischen Union. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verordnung+(EG)+Nr.+1907/2006+des+Europ&#228;ischen+Parlaments+und+des+Rates.">Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europ&#228;ischen Parlaments und des Rates.</a> Europ&#228;ische Union. 860, (2006).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+Organ-Level+Lung+Functions+on+a+Chip.">Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Fisher, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Human+Lung+Slices+in+Toxicology.">The Use of Human Lung Slices in Toxicology.</a> Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).</li><li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+and+Oxidative+Stress+Responses+of+an+Alveolar+Epithelial+Cell+Line+to+Airborne+Zinc+Oxide+Nanoparticles+at+the+Air-Liquid+Interface.">Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 12, (2013).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+as+an+in+vitro+exposure+method+to+assess+acute+pulmonary+toxicity+of+fine+dusts+and+nanoparticles+with+special+focus+on+the+intra-+and+inter-laboratory+reproducibility.">Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility.</a> Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).</li><li>Lacroix, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-Liquid+Interface+In+vitro+Models+for+Respiratory+Toxicology+Research.">Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).</li><li>Eskes, C., Whelan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, (2016).</li><li>Rach, J., Budde, J., M&#246;hle, N., Aufderheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+exposure+at+the+air-liquid+interface:+Evaluation+of+an+in+vitro+approach+for+simulating+inhalation+of+airborne+substances.">Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances.</a> Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).</li><li>Aufderheide, M., Halter, B., M&#246;hle, N., Hochrainer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CULTEX+RFS:+A+comprehensive+Technical+Approach+for+the+In+vitro+Exposure+of+Airway+Epithelial+Cells+to+the+Particulate+Matter+at+the+Air-Liquid+Interface.">The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 15, (2013).</li><li>Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Carterson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates:+Alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).</li><li>Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+useful+in+vitro+model+for+transport+studies+of+alveolar+epithelial+barrier.">A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier.</a> Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+403:+Acute+Inhalation+Toxicity.">Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+436:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+for+the+assessment+of+the+acute+inhalation+toxicity+of+airborne+particles.">Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles.</a> Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+exposure+system+generating+nebulized+aerosol+of+sulfur+mustard+in+comparison+to+the+standard+submerse+exposure.">A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure.</a> Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+CULTEX+radial+flow+system+for+in+vitro+investigation+of+lung+damaging+agents.">Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents.</a> Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).</li><li>Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+GS-NS0+myeloma+cells+to+pH+shifts+and+pH+perturbations.">The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+Guideline+433:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2018).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , (2018).</li></ol>

De nombreux modèles d’essais de toxicité par inhalation non animale ont été développés ces dernières années afin d’obtenir des informations sur le risque aigu d’inhalation de particules inhalables et de réduire et de remplacer les expériences animales selon le principe 3R25.
En termes de modèles de culture cellulaire, l’exposition des cellules peut se faire dans des conditions immergées ou à l’ALI. L’exposition des cellules dans des conditions i...

L’inhalation de particules toxiques en suspension dans l’air est un problème de santé publique, entraînant une multitude de risques pour la santé dans le monde entier et plusieurs millions de décès par an1,2. Le changement climatique, le développement industriel en cours et la demande croissante d’énergie, d’agriculture et de produits de consommation ont contribué à l’augmentation des maladies pulmonaires au cours des dernières années3,4,5,6. La connaissance et l’évaluation des substances inhalables concernant leur toxicité par inhalation grave constituent la base de l’évaluation des risques et de la gestion des risques, mais cette information fait encore défaut pour un large éventail de ces substances7,8. Depuis 2006, la législation de l’UE sur les produits chimiques REACH (Enregistrement, Évaluation, Autorisation et Restriction des produits chimiques) exige que les produits déjà existants et nouvellement introduits subissent une caractérisation toxicologique, y compris la voie d’inhalation, avant d’être mis sur le marché. Par conséquent, REACH met l’accent sur les méthodes alternatives et sans animaux, la mise en œuvre du principe « 3R » (Remplacement, raffinement et réduction des expériences animales) et l’utilisation de modèles in vitro appropriés9. Au cours des dernières années, de nombreux modèles d’essais de toxicité par inhalation non animale différents et adéquats (p. ex., cultures cellulaires in vitro, modèles de poumons sur puce, tranches de poumoncoupées de précision (PCLS)) ont été développés afin d’évaluer la toxicité par inhalation aigue des particules en suspension dans l’air5,7,10,11. En ce qui concerne les modèles de culture cellulaire in vitro, les cellules cultivées peuvent être exposées dans des conditions immergées ou à l’ALI (Figure 1). Cependant, la validité des études d’exposition submergée est limitée en ce qui concerne l’évaluation de la toxicité des composés en suspension dans l’air, en particulier les particules. Les techniques d’exposition submergée ne correspondent pas à la situation in vivo humaine; le milieu de culture cellulaire couvrant les cellules peut affecter les propriétés physico-chimiques et donc, les propriétés toxiques d’une substance d’essai12,13. Les modèles d’inhalation in vitro ALI permettent l’exposition directe des cellules aux substances d’essai sans interférence du milieu de culture cellulaire avec des particules d’essai, imitant ainsi l’exposition humaine avec une similitude physiologique et biologique plus élevée que les expositions submergées12,14.
Pour les processus réglementaires tels que REACH, cependant, seuls les modèles animaux sont disponibles dans le domaine de la toxicologie par inhalation aigue, car aucune autre méthode in vitro n’a été suffisamment validée et officiellement acceptée jusqu’à présent14. À cette fin, les modèles d’essai doivent être validés conformément aux exigences du Laboratoire de référence de l’Union européenne pour les principes d’alternatives à l’expérimentation animale (EURL-ECVAM) sur la validité des tests15.
Une ancienne étude de pré-validation et une étude de validation récemment terminée ont démontré avec succès la zone d’application du système d’exposition À la RFS DELET et sa transférabilité, sa stabilité et sa reproductibilité13. Ce système d’exposition est un système d’exposition cellulaire in vitro qui permet une exposition homogène des cellules aux gaz, aux particules ou aux atmosphères complexes (p. ex. fumée de cigarette) à l’ALI en raison de son concept de distribution d’aérosols radiaux et de la conduction de l’aérosol d’essai dans un flux continu sur les cellules16. Le module de base de ce système d’écoulement radial se compose de l’adaptateur d’entrée, du module de guidage d’aérosol avec une distribution d’aérosols radiaux, du module d’échantillonnage et de prise, et d’un module de verrouillage avec une roue à main (Figure 2). Les particules générées atteignent les cellules par l’intermédiaire de l’adaptateur d’entrée et du module de guidage des aérosols et sont déposées sur les inserts de culture cellulaire, qui sont situés dans les trois chambres d’exposition radialement disposées du module d’échantillonnage. Le module de guidage des aérosols ainsi que le module d’échantillonnage peuvent être chauffés en se connectant à un bain d’eau externe17.
Dans le cadre des deux études, les cellules A549 ont été utilisées pour toutes les expériences d’exposition. La lignée cellulaire A549 est une lignée cellulaire épithéliale immortalisée par l’homme qui est très bien caractérisée et a été utilisée comme modèle in vitro pour les cellules épithéliales alvéoliennes de type II dans de nombreuses études toxicologiques. Les cellules sont caractérisées par des corps lamellar, la production de surfactant et un certain nombre de facteurs inflammation-pertinents18. Ils montrent également des propriétés des cellules épithéliales bronchiques en raison de leur production de mucus19. En outre, ils peuvent être cultivés à l’ALI. Bien que cette lignée cellulaire est déficiente dans la construction de contacts cellule-cellule, la culture de ces cellules est beaucoup plus pratique, moins coûteux et les résultats dérivés de celui-ci sont indépendants des donneurs par rapport aux cellules primaires20.
Les cellules A549 ont été enseventées dans des inserts de culture cellulaire de 6 puits (membrane DE PET, 4,67 cm2, taille de pore 0,4 mm) avec une densité de 3,0 x 105 cellules par insert et cultivées pendant 24 h dans des conditions immergées. Les cellules ont ensuite été exposées dans trois laboratoires indépendants à l’air pur et à trois doses d’exposition différentes (25, 50 et 100 'g/cm2) de 20 substances d’essai à l’ALI. La dose d’exposition est corrélée au temps de dépôt, ce qui entraîne un taux de particules constants de 25 g/cm2,50 g/cm2 et 100 g/cm2 sur les cellules après 15, 30 ou 60 min, respectivement. Les particules déposées, cependant, n’ont pas été lavées après dépôt, mais sont restées sur les cellules pendant 24 h. Les temps de dépôt des particules étaient donc de 15, 30 et 60 min, mais l’exposition des cellules a duré 24 h au total. Le taux de dépôt des substances d’essai a été déterminé dans des expériences préliminaires selon les méthodes précédentes17.
La viabilité cellulaire comme indicateur de toxicité a été évaluée 24 h après dépôt de particules à l’aide d’un exemple de viabilité cellulaire. Un accent particulier a été mis sur la qualité des contrôles de l’air pur, l’optimisation et le raffinement du protocole d’exposition, la reproductibilité intra- et inter-laboratoire et l’établissement d’un modèle de prévision (PM). Substances qui ont entraîné une diminution de la viabilité cellulaire en dessous de 50 % (PM 50 %) ou 75% (PM 75%) à l’une des trois doses d’exposition ont été considérées comme exerçant un risque aigu d’inhalation. Les résultats ont ensuite été comparés aux données in vivo existantes (basées sur au moins une étude fiable selon les lignes directrices des tests de l’OCDE (TG) 403 ou TG 43621,22), conduisant à une concordance globale de 85%, avec une spécificité de 83% et une sensibilité de 88%23.
Outre la mesure de la viabilité cellulaire, d’autres critères d’évaluation tels que la libération de cytokine, l’examen du lysate cellulaire ou l’intégrité de la membrane par l’analyse DeLH peuvent être évalués, mais n’ont pas été requis pour l’étude de validation. Ainsi, le système d’exposition (p. ex., LE RFS DE L’ESSAI DE CULTEX) a été prouvé comme un système de dépistage prédictif pour l’évaluation qualitative de la toxicité par inhalation aigue des particules testées dans l’air, ce qui représente une méthode alternative prometteuse à l’expérimentation animale. Le protocole suivant est recommandé pour les expériences d’exposition aux particules en suspension dans l’air à l’aide de ce système d’exposition.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium and supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>FG 0415</td>
			<td>used as growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td>22320</td>
			<td>used as exposure medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S 0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10mg/mL)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>A 2710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Th. Geyer, Renningen, Germany</td>
			<td>L 0180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 2143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cups</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3516</td>
			<td>6&#173;-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell cell culture inserts</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3450</td>
			<td>24mm inserts; 6-&#173;well plates; 0.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASYton</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Air (DIN EN 12021)</td>
			<td>Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td>2290152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab155902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments + equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cell Counter</td>
			<td>Sch&#228;rfe System GmbH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation thermostat</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline RE 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX HyP - Hydraulic Press</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX insert sleeve</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (large)</td>
			<td>Munktell &#38; Filtrak GmbH, Sachsen, Germany</td>
			<td>LP-050</td>
			<td>Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency &#62; 99,999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (small)</td>
			<td>Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany</td>
			<td>9933-05-DQ</td>
			<td>Balston disposable filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pump</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td>Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser</td>
			<td>digital peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader Infinite M200 Pro</td>
			<td>Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vakuum pump</td>
			<td>KNF, Freiburg, Germany</td>
			<td>N86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#246;gtlin mass flow controller 0,2-10 l/min</td>
			<td>TrigasFI GmbH</td>
			<td>V&#246;gtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline Staredition RE 104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface

Ici, nous présentons un système modulaire d’exposition in vitro spécialement conçu qui permet l’exposition homogène des cellules pulmonaires humaines cultivées à l’ALI aux gaz, aux particules ou aux atmosphères complexes (par exemple, la fumée de cigarette), fournissant ainsi des aspects physiologiques réalistes l’exposition de la surface apaïque de la région alvéolienne humaine à l’air. Contrairement aux modèles d’exposition séquentielle avec guidage linéaire d’aérosol, la conception modulaire du système d’écoulement radial répond à toutes les exigences pour la génération et le transport continus de l’atmosphère d’essai aux cellules, une distribution homogène et le dépôt de particules et l’élimination continue de l’atmosphère. Cette méthode d’exposition est principalement conçue pour l’exposition des cellules aux particules en suspension dans l’air, mais peut être adaptée à l’exposition d’aérosols liquides et de gaz hautement toxiques et agressifs selon la méthode de production d’aérosols et le matériau des modules d’exposition. .
Dans le cadre d’une étude de validation récemment terminée, ce système d’exposition a été prouvé comme une méthode de dépistage transférable, reproductible et prédictive pour l’évaluation qualitative de la cytotoxicité pulmonaire aigue des particules en suspension dans l’air, potentiellement réduire ou remplacer les expériences animales qui fourniraient normalement cette évaluation toxicologique.

Le CULTEX RFS est un système d’exposition in vitro modulaire spécialement conçu qui permet l’exposition directe et homogène des cellules de l’ALI. Dans le cadre d’une ancienne étude de pré-validation, l’applicabilité générale de ce système d’exposition et sa transférabilité, sa stabilité et sa reproductibilité ont été démontrées avec succès. Dans le cadre d’un récent projet de recherche financé par le Ministère fédéral allemand de l’éducation et de...

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Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Nous présentons un système robuste, transférable et prédictif d’exposition in vitro pour le criblage et la surveillance des particules aéroportées concernant leur cytotoxicité pulmonaire aigue en exposant les cellules pulmonaires humaines cultivées à l’interface air-liquide (ALI).

Évaluation de la toxicité par inhalation aigue des particules aéroportées en exposant les cellules pulmonaires humaines cultivées à l’interface air-liquide

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Le criblage des particules aéroportées concernant la cytotoxicité pulmonaire aiguë en exposant les cellules pulmonaires humaines cultivées à l’ALI utilisant ce système d’exposition in vitro peut aider à réduire des expériences animales. Le principal avantage de ce système d’exposition est le concept de distribution d’aérosols radiaux conduisant à une distribution homogène et à la position des particules sur les cellules. Avant d’ensemencer les cellules, ajouter 2,5 millilitres de milieu de croissance tempéré à chaque puits d’une plaque de six puits.Placez les inserts de culture cellulaire sans cellules soigneusement à l’intérieur des puits et ajoutez un millilitre de milieu de croissance à chaque insert de culture cellulaire. Incuber les plaques pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après la trypsinisation des cellules, diluer 100 microlitres de la suspension de la culture cellulaire dans une tasse remplie de 10 millilitres de solution isotonique.Inclinez la tasse lentement sans trembler. Sur un compteur cellulaire, déterminer le nombre de cellules viables par millilitre et la viabilité cellulaire en fonction des paramètres de mesure spécifiques des cellules A549. Après le tempérage de la plaque, aspirer le milieu dans les inserts de culture cellulaire et la graine d’un millilitre de cellules A549 avec une densité de trois fois 10 à la cinquième cellule par millilitre dans chaque insert de culture cellulaire.Répartir la suspension cellulaire par basculement doux et incuber pendant 24 heures. Réglez le temps de pressage via le contrôle du temps sur le côté avant de la presse. Ouvrez l’alimentation en air comprimé à la valve d’air comprimé.À l’aide du régulateur de pression sur le côté avant de la presse, réglez la pression de l’air comprimé à environ deux barres. Sortez le tiroir, appuyez sur le bouton Appuyez sur et lisez la pression pressante sur le commutateur de pression numérique. Remplissez le contenant de substance d’une petite quantité de la substance d’essai.Insérez le piston dans le récipient de substance et tournez-le légèrement d’avant en arrière pour répartir uniformément la poudre dans le récipient. Placez le récipient de substance, avec le piston, dans le tiroir et appuyez sur le bouton Appuyez sur. Ouvrez le tiroir et retirez le piston.Une étape cruciale est le pressage des substances d’essai qui doivent être spécifiquement comprimées à un gâteau en poudre dans le récipient de substance afin de permettre des expositions stables de particules. Retirez l’adaptateur d’entrée et le réflecteur de condensat du module de guidage des aérosols. Fermez les trois alésages d’alimentation en aérosol dans le module de guidage des aérosols avec des bouchons et les connexions d’alimentation moyenne au module d’échantillonnage avec des volets factices.Connectez les lignes de vide avec le connecteur à tube du module de guidage des aérosols. Utilisez la roue à main pour fermer le module et mesurer la valeur des contrôleurs de débit. Quelques minutes après la fermeture, les valeurs diminuent en dessous de cinq millilitres par minute.Démarrez le logiciel générateur d’aérosols. Si le grattoir de substance n’est pas dans la position la plus basse, appuyez sur le bouton Homing Mode. Placez le récipient de substance avec le matériel d’essai pressé à l’envers au-dessus du grattoir de substance.Assurez-vous que le verre du contenant de substance fait face à l’avant. Placez la plaque de verrouillage dans la fente au-dessus du récipient de substance et serrez la vis noire. Modifiez les valeurs d’alimentation et de rotation vers les paramètres souhaités.Utilisez les flèches vers le bas pour pousser la glissière avec le récipient de substance jusqu’à ce que le grattoir de substance soit près de la substance pressée. Ouvrez l’alimentation en air comprimé du générateur d’aérosols avec un robinet du contrôleur de débit de masse et démarrez la génération d’aérosols en cliquant sur le bouton Démarrer. Réglez le taux d’alimentation à 15 à 20 millimètres par heure pour éviter de longs temps d’attente.Contrôlez la bonne génération de particules en observant le nuage de poussière fine avec une petite lampe de poche placée d’en bas derrière le tube de verre de l’élitriateur. Démarrez l’approvisionnement moyen avec le milieu d’exposition préchauffé et remplissez les modules d’échantillonnage jusqu’à ce que les tuyaux d’aval soient couverts pendant que le module est ouvert. Insérez des inserts de culture cellulaire aveugle dans le module d’exposition, pompez le milieu d’exposition jusqu’à ce que les tuyaux inférieurs soient recouverts de milieu et que le côté inférieur des inserts soit en contact avec le milieu.Démarrez le générateur d’aérosols, fermez le module d’exposition et connectez le module d’exposition à la sortie du module d’exposition du générateur d’aérosols. 30 minutes après le délai d’avance, sceller la sortie du module d’exposition de l’élitriateur à l’aide d’un bouchon en caoutchouc et retirer les inserts aveugles. Remplissez le milieu d’exposition jusqu’à ce que les tuyaux d’arrêt soient recouverts de milieu.Retirer les inserts de culture cellulaire des six plaques du puits à l’aide d’une pince à épiler. Versez soigneusement le milieu de croissance de la culture cellulaire en déversant les inserts et utilisez une pipette pour aspirer et jeter le liquide résiduel. Placez les inserts dans les chambres d’exposition des modules d’exposition et d’air pur.Fermez les modules et commencez les expériences d’exposition en connectant le module d’exposition à la sortie du module d’exposition du générateur d’aérosols et du module d’air pur à l’approvisionnement en gaz du transporteur simultanément. Une fois l’expérience terminée, déconnectez les modules d’exposition et d’air pur et scellez la sortie du module d’exposition. Arrêtez l’alimentation en air comprimé et le générateur d’aérosol en cliquant sur le bouton Stop.Ouvrez le module d’exposition et d’air pur et utilisez des pinces à épiler pour transférer les inserts de culture cellulaire vers les six plaques de puits préparées après l’incubation. Incuber les six plaques de puits, ainsi que les inserts de culture cellulaire non exposés, pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone à l’interface liquide de l’air. 24 heures après l’exposition, insérez les inserts de culture cellulaire dans les six nouvelles plaques de puits préparées.Ajoutez un millilitre de la solution WST1 fraîchement préparée à chaque insert de culture cellulaire. Rock les plaques avec soin afin de distribuer la solution de manière homogène sur les cellules. Incuber les six plaques de puits avec les inserts de culture cellulaire pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Après cela, transférer 100 microlitres du surnatant en triplicates de chaque plaque de six puits à une plaque de puits 96. À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez l’absorption à 450 nanomètres avec une longueur d’onde de référence de 650 nanomètres. Le CULTEX RFS est un système modulaire d’exposition in vitro spécialement conçu qui permet l’exposition directe et homogène des cellules aux particules en suspension dans l’air à l’interface liquide de l’air.L’exposition des cellules à l’air pur n’entraînent aucune diminution de la viabilité cellulaire au fil du temps. Le système d’exposition a été validé avec succès et établi comme modèle de prévision des risques aigus d’inhalation des composés testés. Exposition des cellules A549 à différentes substances d’essai qui ne présentaient aucune toxicité, moyenne ou forte.S’il vous plaît assurez-vous que vous gardez strictement les délais qui sont les temps d’incubation, le délai de production de particules, et les temps de dépôt des particules. Cette méthode d’exposition est principalement conçue pour l’exposition aux particules des cellules, mais peut être étendue à l’exposition des aérosols liquides et des gaz en adaptant la méthode de génération d’aérosols. Cette méthode de dépistage permet l’évaluation qualitative des particules inhalables concernant la toxicité aiguë par inhalation in vitro, réduisant ainsi les tests sur les animaux qui fourniraient normalement cette évaluation toxicologique.N’oubliez pas que travailler avec des substances d’essai toxiques peut être extrêmement dangereux et des précautions, comme le port de gants, d’un masque, doivent toujours être prises lors de la manipulation de ces composés.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

L&#39;isolement de la souris les cellules épithéliales respiratoires et l&#39;exposition à la fumée de cigarette expérimentale chez Air interface liquide

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Recherche

Médecine

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Haut-débit cytométrie en flux test cellulaire pour détecter les anticorps de la N-méthyl-D-aspartate Receptor ou récepteur de la dopamine-2 dans le sérum humain

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Un modèle murin d&#39;ischémie myocardique-reperfusion par ligature de l&#39;artère interventriculaire antérieure

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolement des cellules endothéliales humaines lymphatique par multi-paramètres fluorescence tri cellulaire activé

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Diffuse Spectroscopie optique pour l&#39;évaluation quantitative de la toxicité de la peau induit par les rayonnements ionisants aiguë Utilisation d&#39;un modèle de souris

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Évaluation des résultats primaires dans un modèle porcin de infarctus aigu du myocarde

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Ouvrir trachéotomie acide gastrique Aspiration modèle murin de lésion pulmonaire aiguë Résultats dans Maximal aiguë non létaux Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphore-31 Spectroscopie par résonance magnétique: un outil de mesure<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacité mitochondrial phosphorylation oxydative dans le muscle squelettique humain

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Induire une lésion pulmonaire aigue chez la souris par instillation directe du lipopolysaccharide intratrachéal

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Oral Health Assessment by Lay Personnel for Older Adults

Évaluation de la santé buccodentaire par le personnel laïc pour les personnes âgées

Oral health is an often-undervalued contributor to overall health. The literature, however, underscores the myriad of systemic diseases influenced by oral ...