Name: assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface
Uploaded: 2020-02-23T14:00:00
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Diese Arbeit wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF, Deutschland (Zuschuss 031A581, Teilprojekt A-D)) und von der Deutschen Forschungsgesellschaft (DFG, Graduiertenkolleg GRK 2338).

HINWEIS: Das Protokoll eines Expositionsexperiments erstreckt sich über einen Zeitraum von drei Tagen.
Tag 1
1. Allgemeine Zubereitungen und Zellkultivierung
HINWEIS: Die epitheliale Zelllinie A549 der menschlichen Lunge Adenokarzinom wurde für Expositionsexperimente verwendet. Zellen müssen unter sterilen Bedingungen behandelt werden. Andere Zelllinien, die für die Kultivierung am ALI geeignet sind, können verwendet werden.
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	<li>Faber, S. C., McCullough, S. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+and+Oxidative+Stress+Responses+of+an+Alveolar+Epithelial+Cell+Line+to+Airborne+Zinc+Oxide+Nanoparticles+at+the+Air-Liquid+Interface.">Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 12, (2013).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+as+an+in+vitro+exposure+method+to+assess+acute+pulmonary+toxicity+of+fine+dusts+and+nanoparticles+with+special+focus+on+the+intra-+and+inter-laboratory+reproducibility.">Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility.</a> Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).</li><li>Lacroix, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-Liquid+Interface+In+vitro+Models+for+Respiratory+Toxicology+Research.">Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).</li><li>Eskes, C., Whelan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, (2016).</li><li>Rach, J., Budde, J., M&#246;hle, N., Aufderheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+exposure+at+the+air-liquid+interface:+Evaluation+of+an+in+vitro+approach+for+simulating+inhalation+of+airborne+substances.">Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances.</a> Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).</li><li>Aufderheide, M., Halter, B., M&#246;hle, N., Hochrainer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CULTEX+RFS:+A+comprehensive+Technical+Approach+for+the+In+vitro+Exposure+of+Airway+Epithelial+Cells+to+the+Particulate+Matter+at+the+Air-Liquid+Interface.">The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 15, (2013).</li><li>Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Carterson, A. 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J., Birch, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+GS-NS0+myeloma+cells+to+pH+shifts+and+pH+perturbations.">The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+Guideline+433:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2018).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , (2018).</li></ol>

Viele nicht-tierische Inhalationstoxizitätstestmodelle wurden in den letzten Jahren entwickelt, um Informationen über die akute Inhalationsgefahr von inhalierbaren Partikeln zu gewinnen und Tierversuche nach dem 3R-Prinzip25zu reduzieren und zu ersetzen.
In Bezug auf Zellkulturmodelle kann die Exposition von Zellen unter getauchten Bedingungen oder am ALI erfolgen. Die Exposition von Zellen unter getauchten Bedingungen kann die physikalisch-chemischen Eigenschaften un...

Das Einatmen giftiger Partikel in der Luft ist ein Problem der öffentlichen Gesundheit, was zu einer Vielzahl von Gesundheitsrisiken weltweit und vielen Millionen Todesfällen jährlich1,2führt. Der Klimawandel, die fortschreitende industrielle Entwicklung und die steigende Nachfrage nach Energie,Agrar- und Konsumgütern haben in den letzten Jahren zum Anstieg der Lungenerkrankungen beigetragen3,4,5,6. Die Kenntnis und Bewertung von inhalierbaren Stoffen in Bezug auf ihre akute Inhalationstoxizität bilden die Grundlage für die Risikobewertung und das Risikomanagement, aber diese Informationen fehlen noch für eine breite Palette dieser Stoffe7,8. Seit 2006 schreibt das EU-Chemikalienrecht REACH (Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals) vor, dass bereits bestehende und neu eingeführte Produkte vor dem Inverkehrbringen einer toxikologischen Charakterisierung unterzogen werden, einschließlich der Inhalationsroute. REACH konzentriert sich daher auf alternative und tierfreie Methoden, die Umsetzung des "3R"-Prinzips (Ersatz, Verfeinerung und Reduzierung von Tierversuchen) und die Verwendung geeigneter In-vitro-Modelle9. In den letzten Jahren wurden viele verschiedene und adäquate nicht-tierische Inhalationstoxizitätstestmodelle (z. B. In-vitro-Zellkulturen, Lungen-auf-einen-Chip-Modelle, präzisionsgeschnittene Lungenscheiben (PCLS)) entwickelt, um die akute Inhalationstoxizität von Partikeln in der Luft5,7,10,11zu bewerten. In Bezug auf In-vitro-Zellkulturmodelle können kultivierte Zellen unter Getauchtbedingungen oder am ALI (Abbildung 1) exponiert werden. Die Gültigkeit von Unterstauchexpositionsstudien ist jedoch im Hinblick auf die Bewertung der Toxizität von Luftverbindungen, insbesondere Partikeln, begrenzt. Die Techniken der untergetauchten Exposition entsprechen nicht der menschlichen in vivo-Situation; das Zellkulturmedium, das die Zellen bedeckt, kann die physikalisch-chemischen Eigenschaften und damit die toxischen Eigenschaften einer Prüfsubstanz12,13beeinflussen. ALI In-vitro-Inhalationsmodelle ermöglichen die direkte Exposition von Zellen gegenüber den Prüfsubstanzen ohne Interferenz des Zellkulturmediums mit Testpartikeln, wodurch die Exposition des Menschen mit höherer physiologischer und biologischer Ähnlichkeit als untergetauchte Expositionen12,14imitiert wird.
Für regulatorische Prozesse wie REACH stehen jedoch nur Tiermodelle im Bereich der akuten Inhalationstoxikologie zur Verfügung, da bisher keine alternativen In-vitro-Methoden ausreichend validiert und offiziell akzeptiert wurden14. Zu diesem Zweck müssen Testmodelle gemäß den Anforderungen des Referenzlabors der Europäischen Union für Alternativen zu Tierversuchen (EURL-ECVAM) zur Testgültigkeit15validiert werden.
Eine frühere Vorvalidierungsstudie und eine kürzlich abgeschlossene Validierungsstudie haben erfolgreich den Anwendungsbereich des CULTEX RFS-Expositionssystems und seine Übertragbarkeit, Stabilität und Reproduzierbarkeit13nachgewiesen. Dieses Expositionssystem ist ein in vitro zellbasiertes Expositionssystem, das eine homogene Exposition von Zellen gegenüber Gasen, Partikeln oder komplexen Atmosphären (z. B. Zigarettenrauch) am ALI aufgrund seines radialen Aerosolverteilungskonzepts und der Leitung des Testaerosols in einem kontinuierlichen Fluss über die Zellen16ermöglicht. Das Grundmodul dieses Radialdurchflusssystems besteht aus dem Einlassadapter, dem Aerosolführungsmodul mit radialer Aerosolverteilung, dem Probenahme- und Sockelmodul und einem Verriegelungsmodul mit Handrad (Abbildung 2). Die erzeugten Partikel gelangen über den Einlassadapter und das Aerosolführungsmodul in die Zellen und werden auf den Zellkultureinsätzen abgelagert, die sich in den drei radial angeordneten Belichtungskammern des Probenahmemoduls befinden. Das Aerosolführungsmodul sowie das Probenahmemodul können durch Anschluss an ein externes Wasserbad17beheizt werden.
Im Rahmen beider Studien wurden A549-Zellen für alle Expositionsexperimente eingesetzt. Die Zelllinie A549 ist eine humanverewigte Epithelzelllinie, die sehr gut charakterisiert ist und als In-vitro-Modell für Typ-II-Alveol-Epithelzellen in zahlreichen toxikologischen Studien verwendet wurde. Die Zellen zeichnen sich durch lamellenkörper, die Produktion von Tensid und eine Reihe von entzündungsrelevanten Faktoren18aus. Sie zeigen auch Eigenschaften von Bronchialepithelzellen aufgrund ihrer Schleimproduktion19. Darüber hinaus können sie im ALI kultiviert werden. Obwohl diese Zelllinie einen Mangel am Aufbau von Zell-Zell-Kontakten hat, ist die Kultivierung dieser Zellen viel bequemer, kostengünstiger und daraus abgeleitete Ergebnisse sind im Vergleich zu Primärzellen20spenderunabhängig.
A549-Zellen wurden in 6-Well-Zellkultureinsätzen (PET-Membran, 4,67 cm2, Porengröße 0,4 mm) mit einer Dichte von 3,0 x 105 Zellen pro Einsatz gesät und für 24 h unter Getauchtbedingungen kultiviert. Die Zellen wurden dann in drei unabhängigen Laboratorien der sauberen Luft und drei verschiedenen Expositionsdosen (25, 50 und 100 g/cm2) von 20 Prüfsubstanzen am ALI ausgesetzt. Die Expositionsdosis korreliert mit der Abscheidungszeit, was zu einer konstanten Partikelrate von 25 g/cm2,50 g/cm2 und 100 g/cm2 auf die Zellen nach 15, 30 bzw. 60 min führt. Die abgelagerten Partikel wurden jedoch nicht nach der Ablagerung abgewaschen, sondern blieben 24 h auf den Zellen. Die Abscheidungszeiten der Partikel betrugen somit 15, 30 und 60 min, aber die Exposition der Zellen dauerte insgesamt 24 h. Die Abscheidungsrate der Prüfsubstanzen wurde in Vorversuchen nach früheren Methoden17ermittelt.
Die Zelllebensfähigkeit als Indikator für die Toxizität wurde 24 h nach Partikelabscheidung mit einem Zelllebensfähigkeitstest bewertet. Besonderes Augenmerk wurde auf die Qualität der Reinluftsteuerungen, die Optimierung und Verfeinerung des Expositionsprotokolls, die intra- und interlaborale Reproduzierbarkeit und die Etablierung eines Vorhersagemodells (PM) gelegt. Stoffe, die zu einer Abnahme der Zelllebensfähigkeit unter 50% (PM 50%) führten oder 75% (PM 75%) bei einer der drei Expositionsdosen als akute Inhalationsgefahr angesehen. Die Ergebnisse wurden dann mit bestehenden In-vivo-Daten verglichen (basierend auf mindestens einer zuverlässigen Studie nach OECD-Testleitlinie (TG) 403 oder TG 43621,22), was zu einer Gesamtübereinstimmung von 85 % mit einer Spezifität von 83 % und einer Sensitivität von 88%23führte.
Neben der Messung der Zelllebensfähigkeit können weitere Endpunkte wie Zytokinfreisetzung, Untersuchung des Zelllysats oder Membranintegrität mittels LDH-Assay bewertet werden, waren aber für die Validierungsstudie nicht erforderlich. So wurde das Expositionssystem (z.B. CULTEX RFS) als prädiktives Screening-System für die qualitative Bewertung der akuten Inhalationstoxizität der getesteten Partikel in der Luft nachgewiesen, was eine vielversprechende alternative Methode zu Tierversuchen darstellt. Das folgende Protokoll wird für Expositionsexperimente mit Partikeln in der Luft empfohlen, die dieses Expositionssystem verwenden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium and supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>FG 0415</td>
			<td>used as growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td>22320</td>
			<td>used as exposure medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S 0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10mg/mL)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>A 2710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Th. Geyer, Renningen, Germany</td>
			<td>L 0180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 2143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cups</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3516</td>
			<td>6&#173;-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell cell culture inserts</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3450</td>
			<td>24mm inserts; 6-&#173;well plates; 0.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASYton</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Air (DIN EN 12021)</td>
			<td>Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td>2290152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab155902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments + equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cell Counter</td>
			<td>Sch&#228;rfe System GmbH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation thermostat</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline RE 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX HyP - Hydraulic Press</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX insert sleeve</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (large)</td>
			<td>Munktell &#38; Filtrak GmbH, Sachsen, Germany</td>
			<td>LP-050</td>
			<td>Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency &#62; 99,999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (small)</td>
			<td>Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany</td>
			<td>9933-05-DQ</td>
			<td>Balston disposable filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pump</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td>Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser</td>
			<td>digital peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader Infinite M200 Pro</td>
			<td>Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vakuum pump</td>
			<td>KNF, Freiburg, Germany</td>
			<td>N86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#246;gtlin mass flow controller 0,2-10 l/min</td>
			<td>TrigasFI GmbH</td>
			<td>V&#246;gtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline Staredition RE 104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface

Hier präsentieren wir ein speziell entwickeltes modulares In-vitro-Expositionssystem, das die homogene Exposition kultivierter menschlicher Lungenzellen am ALI gegenüber Gasen, Partikeln oder komplexen Atmosphären (z.B. Zigarettenrauch) ermöglicht und somit eine realistische physiologische Exposition der apikalen Oberfläche des menschlichen Alveolarbereichs gegenüber Luft. Im Gegensatz zu sequenziellen Belichtungsmodellen mit linearer Aerosolführung erfüllt der modulare Aufbau des Radialstromsystems alle Anforderungen an die kontinuierliche Erzeugung und den Transport der Prüfatmosphäre zu den Zellen, eine homogene Verteilung und partikelund die kontinuierliche Entfernung der Atmosphäre. Diese Expositionsmethode ist in erster Linie für die Exposition von Zellen gegenüber Partikeln in der Luft konzipiert, kann aber je nach Aerosolerzeugungsmethode und Material der Expositionsmodule an die Exposition von flüssigen Aerosolen und hochgiftigen und aggressiven Gasen angepasst werden. .
Im Rahmen einer kürzlich abgeschlossenen Validierungsstudie wurde dieses Expositionssystem als übertragbares, reproduzierbares und prädiktives Screening-Verfahren zur qualitativen Bewertung der akuten lungenzytotoxizität von Partikeln in der Luft nachgewiesen. Tierversuche, die normalerweise diese toxikologische Bewertung ermöglichen würden, potenziell zu reduzieren oder zu ersetzen.

Das CULTEX RFS ist ein speziell entwickeltes modulares In-vitro-Expositionssystem, das die direkte und homogene Exposition von Zellen am ALI ermöglicht. In einer früheren Vorvalidierungsstudie wurden die allgemeine Anwendbarkeit dieses Expositionssystems und seine Übertragbarkeit, Stabilität und Reproduzierbarkeit erfolgreich nachgewiesen. In einem kürzlich vom Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderten Forschungsprojekt wurde das Expositionssystem erfolgreich validier...

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Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Wir präsentieren ein robustes, übertragbares und prädiktives In-vitro-Expositionssystem für das Screening und die Überwachung von Partikeln in der Luft hinsichtlich ihrer akuten lungenzytotoxizität durch die Exposition kultivierter menschlicher Lungenzellen an der luft-flüssigen Schnittstelle (ALI).

Bewertung der akuten Inhalationstoxizität von Luftpartikeln durch Aussetzen kultivierter menschlicher Lungenzellen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Das Screening von Partikeln in der Luft bezüglich der akuten lungenzytotoxizität durch die Exposition kultivierter menschlicher Lungenzellen am ALI mit diesem In-vitro-Expositionssystem kann dazu beitragen, Tierversuche zu reduzieren. Der Hauptvorteil dieses Expositionssystems ist das konzept der radialen Aerosolverteilung, das zu einer homogenen Verteilung und der Position der Partikel auf die Zellen führt. Vor der Aussaat der Zellen, fügen Sie 2,5 Milliliter gehärtetem Wachstumsmedium zu jedem Brunnen einer sechs Brunnen platte.Platzieren Sie die Zellkultureinsätze ohne Zellen sorgfältig in den Brunnen und fügen Sie jedem Zellkultureinsatz einen Milliliter Wachstumsmedium hinzu. Inkubieren Sie die Platten für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Nach der Trypsinisierung der Zellen 100 Mikroliter der Zellkultursuspension in einer Tasse mit 10 Milliliterisotonische Lösung gefüllt verdünnen.Kippen Sie den Becher langsam ohne zu schütteln. Bestimmen Sie auf einem Zellzähler die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro Milliliter und die Zelllebensfähigkeit basierend auf den zellspezifischen Messparametern von A549-Zellen. Nach dem Temperieren der Platte, aspirieren das Medium innerhalb der Zellkultur Einsätze und Samen einen Milliliter von A549-Zellen mit einer Dichte von dreimal 10 bis die fünften Zellen pro Milliliter in jeder Zellkultur einfügen.Verteilen Sie die Zellsuspension durch sanftes Schaukeln und inkubieren Sie 24 Stunden lang. Stellen Sie die Presszeit über die Zeitsteuerung auf der Vorderseite der Presse ein. Öffnen Sie die Druckluftzufuhr am Druckluftventil.Stellen Sie mit dem Druckregler auf der Vorderseite der Presse den Druckdruck auf etwa zwei bar ein. Ziehen Sie die Schublade heraus, drücken Sie die Taste drücken, und lesen Sie den Druck auf den digitalen Druckschalter. Füllen Sie den Stoffbehälter mit einer kleinen Menge der Prüfsubstanz.Setzen Sie den Kolben in den Stoffbehälter ein und drehen Sie ihn leicht hin und her, um das Pulver gleichmäßig im Behälter zu verteilen. Legen Sie den Stoffbehälter mit dem Kolben in die Schublade und drücken Sie die Taste drücken. Öffnen Sie die Schublade und entfernen Sie den Kolben.Ein kritischer Schritt ist das Pressen von Prüfsubstanzen, die speziell zu einem Pulverkuchen im Stoffbehälter verdichtet werden müssen, um stabile Partikelexpositionen zu ermöglichen. Entfernen Sie den Einlassadapter und den Kondensatreflektor aus dem Aerosolführungsmodul. Schließen Sie die drei Aerosol-Fütterungsbohrungen im Aerosolführungsmodul mit Steckern und die mittleren Versorgungsanschlüsse am Probenahmemodul mit Dummyklappen.Verbinden Sie die Vakuumleitungen mit dem Rohranschluss des Aerosolführungsmoduls. Verwenden Sie das Handrad, um das Modul zu schließen und den Wert der Durchflussregler zu messen. Ein paar Minuten nach dem Schließen sinken die Werte unter fünf Milliliter pro Minute.Starten Sie die Aerosolgenerator-Software. Wenn sich der Stoffschaber nicht in der niedrigsten Position befindet, drücken Sie die Taste Homing-Modus. Stellen Sie den Stoffbehälter mit dem gepressten Prüfmaterial kopfüber über den Substanzschaber.Stellen Sie sicher, dass das Glas des Stoffbehälters nach vorne zeigt. Legen Sie die Verriegelungsplatte in den Schlitz über dem Stoffbehälter und ziehen Sie die schwarze Schraube fest. Ändern Sie die Werte für Feed und Rotation in die gewünschten Einstellungen.Verwenden Sie die Abwärtspfeile, um den Schlitten mit dem Stoffbehälter nach unten zu drücken, bis sich der Substanzschaber in der Nähe der gepressten Substanz befindet. Öffnen Sie die Druckluftzufuhr zum Aerosolgenerator mit einem Hahn des Massenstromreglers und starten Sie die Aerosol-Generierung, indem Sie auf die Starttaste klicken. Stellen Sie die Vorschubrate auf 15 bis 20 Millimeter pro Stunde ein, um lange Wartezeiten zu vermeiden.Steuern Sie die richtige Partikelerzeugung, indem Sie die Feinstaubwolke mit einer kleinen Taschenlampe beobachten, die von unten hinter dem Glasrohr des Elutriators positioniert ist. Starten Sie die mittlere Versorgung mit vorgewärmten Belichtungsmedium und füllen Sie die Probenahmemodule, bis die Fallrohre abgedeckt sind, während das Modul geöffnet ist. Blindzellkultureinsätze in das Belichtungsmodul einlegen, das Belichtungsmedium nach unten pumpen, bis die Fallrohre mit Medium bedeckt sind und die Unterseite der Einsätze mit Medium in Kontakt ist.Starten Sie den Aerosolgenerator, schließen Sie das Belichtungsmodul, und schließen Sie das Belichtungsmodul an den Belichtungsmodulausgang des Aerosolgenerators. 30 Minuten nach der Vorlaufzeit den Belichtungsmodulausgang des Elutriators mit einem Gummistecker versiegeln und die Blindeinsätze entfernen. Füllen Sie das Belichtungsmedium auf, bis die Fallrohre mit Medium bedeckt sind.Entfernen Sie die Zellkultureinsätze von den sechs Brunnenplatten mit Hilfe einer Pinzette. Gießen Sie das Wachstumsmedium vorsichtig aus der Zellkultur setzt durch Umstürzen der Einsätze und verwenden Sie eine Pipette, um die Restflüssigkeit zu aspirieren und zu entsorgen. Legen Sie die Einsätze in die Belichtungskammern der Belichtungs- und Reinluftmodule.Schließen Sie die Module und starten Sie die Belichtungsexperimente, indem Sie das Belichtungsmodul gleichzeitig an den Expositionsmodulausgang des Aerosolgenerators und das Reinluftmodul an die Trägergasversorgung anschließen. Trennen Sie nach Abschluss des Experiments die Belichtungs- und Reinluftmodule und versiegeln Sie den Auslass des Belichtungsmoduls. Stoppen Sie die Druckluftzufuhr und den Aerosolgenerator, indem Sie auf die Stopp-Taste klicken.Öffnen Sie das Belichtungs- und Reinluftmodul und übertragen Sie die Zellkultureinsätze mit einer Pinzette auf die vorbereiteten Nachinkubationsplatten. Die sechs Brunnenplatten sowie die unbelichteten Zellkultureinsätze 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid an der Luftflüssigkeitsschnittstelle inkubieren. 24 Stunden nach der Belichtung die Zellkultureinsätze in die neu vorbereiteten sechs Brunnenplatten einlegen.Fügen Sie jedem Zellkultureinsatz einen Milliliter der frisch zubereiteten WST1-Lösung hinzu. Die Platten sorgfältig schaukeln, um die Lösung homogen auf die Zellen zu verteilen. Inkubieren Sie die sechs Brunnenplatten mit der Zellkultur Einsätze für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Danach 100 Mikroliter des Überstandes in Triplicaten von jeder sechs Brunnenplatte auf eine 96-Well-Platte übertragen. Mit einem Mikroplattenleser wird die Absorption bei 450 Nanometern mit einer Referenzwellenlänge von 650 Nanometern gemessen. Das CULTEX RFS ist ein speziell entwickeltes modulares In-vitro-Expositionssystem, das die direkte und homogene Exposition von Zellen gegenüber luftgetragenen Partikeln an der Luftflüssigkeitsschnittstelle ermöglicht.Die Exposition der Zellen gegenüber sauberer Luft führt zu keiner Abnahme der Zelllebensfähigkeit im Laufe der Zeit. Das Expositionssystem wurde erfolgreich validiert und als Vorhersagemodell für akute Inhalationsgefahren der getesteten Verbindungen etabliert. Exposition von A549-Zellen gegenüber verschiedenen Prüfsubstanzen, die keine, mittlere oder starke Toxizität aufwiesen.Bitte achten Sie darauf, dass Sie die Zeitrahmen, die die Inkubationszeiten, die Vorlaufzeit der Partikelerzeugung und die Partikelabscheidungszeiten sind, strikt einhalten. Diese Expositionsmethode ist in erster Linie für die Partikelexposition von Zellen konzipiert, kann aber durch Anpassung der Aerosolerzeugungsmethode auf die Exposition von flüssigen Aerosolen und Gasen ausgedehnt werden. Dieses Screening-Verfahren ermöglicht die qualitative Bewertung inhalierbarer Partikel hinsichtlich der akuten Inhalationstoxizität in vitro und reduziert damit Tierversuche, die normalerweise diese toxikologische Bewertung ermöglichen würden.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit toxischen Prüfsubstanzen extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen, einer Maske, immer beim Umgang mit solchen Verbindungen getroffen werden sollten.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Isolierung von Maus respiratorischen Epithelzellen und der Exposition gegenüber Experimental Zigarettenrauch bei Air Liquid-Interface

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Forschung

Medizin

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Einem Mausmodell der myokardialen Ischämie-Reperfusion Injury durch Ligation des linken vorderen absteigenden Arterie

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolation of Human Lymphatic Endothelzellen durch Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Diffuse Optische Spektroskopie zur quantitativen Beurteilung Akute ionisierender Strahlung induzierte Hauttoxizität Mit einem Maus-Modell

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Primärer Ergebnisbeurteilung in einem Schwein Modell eines akuten Myokardinfarkts

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Offene Tracheotomie Magensäure Aspiration Mausmodell der akuten Lungenschädigung Ergebnisse in Maximal Akute nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphor-31 Magnet-Resonanz-Spektroskopie: Ein Werkzeug zur Messung<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial Oxidative Phosphorylierung Kapazität im menschlichen Skelettmuskel

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Induzieren akute Lungenschädigung bei Mäusen durch direkte intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Oral Health Assessment by Lay Personnel for Older Adults

Mundgesundheitsbewertung durch Laienpersonal für ältere Erwachsene

Oral health is an often-undervalued contributor to overall health. The literature, however, underscores the myriad of systemic diseases influenced by oral ...