Name: assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface
Uploaded: 2020-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero federale tedesco dell'Istruzione e della Ricerca (Bundesministerium f'r Bildung und Forschung, BMBF, Germania (Grant 031A581, sub-progetto A-D)) e dalla Fondazione tedesca per la ricerca (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Ricerca Training Group GRK 2338).

NOTA: il protocollo di un esperimento di esposizione copre un periodo di tre giorni.
Giorno 1
1. Preparati generali e coltivazione di cellule
NOTA: La linea cellulare epiteliale polmonare umana A549 è stata utilizzata per esperimenti di esposizione. Le cellule devono essere maneggiate in condizioni sterili. Possono essere utilizzate altre linee cellulari adatte per la coltivazione all'ALI.
<ol><li>Preparare il mezzo di crescita (Dulbec...

<ol>
	<li>Faber, S. C., McCullough, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+the+Looking+Glass:+In+vitro+Models+for+Inhalation+Toxicology+and+Interindividual+Variability+in+the+Airway.">Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).</li><li>De Matteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+challenges+in+occupational+lung+diseases.">Current and new challenges in occupational lung diseases.</a> European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).</li><li>LANUV Nordrhein-Westfalen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).</li><li>B&#233;rub&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Inhalation+Toxicity+and+Disease.+The+report+of+a+FRAME+workshop.">In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop.</a> Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).</li><li>Lopez, A. D., Murray, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+disease,+1990-2020.">The global burden of disease, 1990-2020.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).</li><li>Clippinger, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+approaches+for+acute+inhalation+toxicity+testing+to+address+global+regulatory+and+non-regulatory+data+requirements:+An+international+workshop+report.">Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report.</a> Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).</li><li>Agrawal, M. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+and+Oxidative+Stress+Responses+of+an+Alveolar+Epithelial+Cell+Line+to+Airborne+Zinc+Oxide+Nanoparticles+at+the+Air-Liquid+Interface.">Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 12, (2013).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+as+an+in+vitro+exposure+method+to+assess+acute+pulmonary+toxicity+of+fine+dusts+and+nanoparticles+with+special+focus+on+the+intra-+and+inter-laboratory+reproducibility.">Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility.</a> Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).</li><li>Lacroix, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-Liquid+Interface+In+vitro+Models+for+Respiratory+Toxicology+Research.">Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).</li><li>Eskes, C., Whelan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, (2016).</li><li>Rach, J., Budde, J., M&#246;hle, N., Aufderheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+exposure+at+the+air-liquid+interface:+Evaluation+of+an+in+vitro+approach+for+simulating+inhalation+of+airborne+substances.">Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances.</a> Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).</li><li>Aufderheide, M., Halter, B., M&#246;hle, N., Hochrainer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CULTEX+RFS:+A+comprehensive+Technical+Approach+for+the+In+vitro+Exposure+of+Airway+Epithelial+Cells+to+the+Particulate+Matter+at+the+Air-Liquid+Interface.">The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 15, (2013).</li><li>Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Carterson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates:+Alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).</li><li>Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. 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J., Birch, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+GS-NS0+myeloma+cells+to+pH+shifts+and+pH+perturbations.">The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+Guideline+433:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2018).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , (2018).</li></ol>

Negli ultimi anni sono stati sviluppati molti modelli di test di tossicità per l'inalazione non animale al fine di ottenere informazioni sul rischio di inalazione acuta delle particelle inalabili e per ridurre e sostituire gli esperimenti sugli animali secondo il principio 3R25.
In termini di modelli di coltura cellulare, l'esposizione delle cellule può essere effettuata in condizioni sommerse o all'ALI. Esporre le cellule in condizioni sommerse può influenzare le pr...

L'inalazione di particelle atmosferiche tossiche è un problema di salute pubblica, che porta a una moltitudine di rischi per la salute in tutto il mondo e molti milioni di morti ogni anno1,2. Il cambiamento climatico, lo sviluppo industriale in corso e la crescente domanda di energia, prodotti agricoli e di consumo hanno contribuito all'aumento delle malattie polmonari negli ultimi anni3,4,5,6. La conoscenza e la valutazione delle sostanze inalabili per quanto riguarda la loro tossicità acuta per l'inalazione forniscono la base per la valutazione del rischio e la gestione del rischio, ma queste informazioni sono ancora carenti per un'ampia gamma di queste sostanze7,8. Dal 2006, la legislazione chimica dell'UE REACH (Registrazione, Valutazione, Autorizzazione e Restrizione delle sostanze chimiche) richiede che i prodotti già esistenti e di nuova introduzione siano sottoposti a una caratterizzazione tossicologica, compresa la via di inalazione prima di essere immessi sul mercato. Pertanto, REACH si concentra su metodi alternativi e privi di animali, sull'attuazione del principio "3R" (sostituzione, perfezionamento e riduzione degli esperimenti sugli animali) e sull'uso di adeguati modelli in vitro9. Negli ultimi anni sono stati sviluppati molti modelli diversi e adeguati di test di tossicità per l'inalazione non animale (ad esempio, colture in vitro cellule, modelli polmonari su un chip, fette polmonari tagliate di precisione (PCLS)) al fine di valutare la tossicità acuta dell'inalazione delle particelle trasportate dall'aria5,7,10,11. In termini di modelli di coltura cellulare in vitro, le cellule coltivate possono essere esposte in condizioni sommerse o all'ALI (Figura 1). Tuttavia, la validità degli studi sull'esposizione sommersa è limitata per quanto riguarda la valutazione della tossicità dei composti trasportati dall'aria, in particolare delle particelle. Le tecniche di esposizione sommerse non corrispondono alla situazione umana in vivo; il mezzo di coltura cellulare che copre le cellule può influenzare le proprietà fisico-chimiche e, quindi, le proprietà tossiche di una sostanza di prova12,13. I modelli di inalazione alI in vitro consentono l'esposizione diretta delle cellule alle sostanze di prova senza interferenze del mezzo di coltura cellulare con particelle di prova, imitando così l'esposizione umana con una maggiore somiglianza fisiologica e biologica rispetto alle esposizioni sommerse12,14.
Per i processi normativi come REACH, tuttavia, sono disponibili solo modelli animali nel campo della tossicologia acuta dell'inalazione, in quanto nessun metodo alternativo in vitro è stato sufficientemente convalidato e ufficialmente accettato finora14. A tale scopo, i modelli di prova devono essere convalidati in base ai requisiti del Laboratorio di riferimento dell'Unione europea per le alternative ai test sugli animali (EURL-ECVAM) sulla validità dei test15.
Un ex studio di pre-convalida e uno studio di convalida recentemente completato hanno dimostrato con successo l'area di applicazione del sistema di esposizione CULTEX RFS e la sua trasferibilità, stabilità e riproducibilità13. Questo sistema di esposizione è un sistema di esposizione in vitro basato sulle cellule che consente l'esposizione omogenea delle cellule a gas, particelle o atmosfere complesse (ad esempio, fumo di sigaretta) all'ALI a causa del suo concetto di distribuzione radiale degli aerosol e della conduzione dell'aerosol di prova in un flusso continuo sulle cellule16. Il modulo di base di questo sistema di flusso radiale è costituito dall'adattatore di ingresso, dal modulo di guida dell'aerosol con distribuzione radiale degli aerosol, dal modulo di campionamento e socket e da un modulo di bloccaggio con una ruota a mano (Figura 2). Le particelle generate raggiungono le cellule tramite l'adattatore di ingresso e il modulo di guida dell'aerosol e si depositano sugli inserti di coltura cellulare, che si trovano nelle tre camere di esposizione disposte radialmente del modulo di campionamento. Il modulo di guida dell'aerosol e il modulo di campionamento possono essere riscaldati collegandosi a un bagno d'acqua esterno17.
Nell'ambito di entrambi gli studi, le cellule A549 sono state utilizzate per tutti gli esperimenti di esposizione. La linea cellulare A549 è una linea cellulare epiteliale immortalata umana che è molto ben caratterizzata ed è stata utilizzata come modello in vitro per le cellule epiteliali alveolar di tipo II in numerosi studi tossicologici. Le cellule sono caratterizzate da corpi lamellari, la produzione di surfactant e una serie di fattori rilevanti per l'infiammazione18. Mostrano anche le proprietà delle cellule epiteliali bronchiali a causa della loro produzione di muco19. Inoltre, possono essere coltivati presso l'ALI. Anche se questa linea cellulare è carente nella costruzione di contatti cellulari, la coltivazione di queste cellule è molto più conveniente, meno costose e i risultati derivati da esse sono indipendenti dal donatore rispetto alle cellule primarie20.
Le cellule A549 sono state seminate in inserti a coltura cellulare a 6 pozzetti (membrana PET, 4,67 cm2, dimensione dei pori 0,4 mm) con una densità di 3,0 x 105 celle per inserto e coltivate per 24 h in condizioni sommerse. Le cellule sono state poi esposte in tre laboratori indipendenti per pulire l'aria e tre diverse dosi di esposizione (25, 50 e 100 g/cm2) di 20 sostanze di prova all'ALI. La dose di esposizione è correlata al tempo di deposizione, con un tasso costante di particelle di 25 g/cm2,50 g/cm2 e 100 g/cm2 sulle cellule dopo 15, 30 o 60 min, rispettivamente. Le particelle depositate, tuttavia, non sono state lavate via dopo la deposizione, ma sono rimaste sulle cellule per 24 ore. I tempi di deposizione delle particelle erano quindi 15, 30 e 60 min, ma l'esposizione delle cellule è durata per 24 h in totale. Il tasso di deposizione delle sostanze di prova è stato determinato negli esperimenti preliminari secondo i metodi precedenti17.
La vitalità cellulare come indicatore di tossicità è stata valutata 24 h dopo la deposizione di particelle utilizzando un saggio di fattibilità cellulare. Particolare attenzione è stata posta sulla qualità dei controlli dell'aria pulita, sull'ottimizzazione e perfezionamento del protocollo di esposizione, sulla riproducibilità intra e interlaboratorio e sulla creazione di un modello di previsione (PM). Sostanze che hanno portato a una diminuzione della vitalità cellulare al di sotto del 50% (PM 50%) o 75% (PM 75%) in una delle tre dosi di esposizione è stato considerato un rischio di inalazione acuta. I risultati sono stati poi confrontati con i dati in vivo esistenti (sulla base di almeno uno studio affidabile secondo le linee guida dei test dell'OCSE (TG) 403 o TG 43621,22), che porta ad una concordanza complessiva dell'85%, con una specificità dell'83% e una sensibilità dell'88%23.
Oltre alla misurazione della vitalità cellulare, altri endpoint come il rilascio di citochine, l'esame dell'integrità del lisato cellulare o della membrana tramite l'analisi LDH possono essere valutati, ma non sono stati richiesti per lo studio di convalida. Pertanto, il sistema di esposizione (ad esempio, CULTEX RFS) si è dimostrato un sistema di screening predittivo per la valutazione qualitativa della tossicità acuta dell'inalazione delle particelle airotrasportate testate, rappresentando un promettente metodo alternativo alla sperimentazione animale. Il seguente protocollo è raccomandato per gli esperimenti di esposizione alle particelle trasportate dall'aria utilizzando questo sistema di esposizione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium and supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>FG 0415</td>
			<td>used as growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td>22320</td>
			<td>used as exposure medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S 0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10mg/mL)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>A 2710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Th. Geyer, Renningen, Germany</td>
			<td>L 0180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 2143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cups</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3516</td>
			<td>6&#173;-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell cell culture inserts</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3450</td>
			<td>24mm inserts; 6-&#173;well plates; 0.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASYton</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Air (DIN EN 12021)</td>
			<td>Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td>2290152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab155902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments + equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cell Counter</td>
			<td>Sch&#228;rfe System GmbH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation thermostat</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline RE 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX HyP - Hydraulic Press</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX insert sleeve</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (large)</td>
			<td>Munktell &#38; Filtrak GmbH, Sachsen, Germany</td>
			<td>LP-050</td>
			<td>Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency &#62; 99,999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (small)</td>
			<td>Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany</td>
			<td>9933-05-DQ</td>
			<td>Balston disposable filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pump</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td>Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser</td>
			<td>digital peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader Infinite M200 Pro</td>
			<td>Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vakuum pump</td>
			<td>KNF, Freiburg, Germany</td>
			<td>N86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#246;gtlin mass flow controller 0,2-10 l/min</td>
			<td>TrigasFI GmbH</td>
			<td>V&#246;gtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline Staredition RE 104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface

Qui presentiamo un sistema modulare di esposizione modulare in vitro appositamente progettato che consente l'esposizione omogenea delle cellule polmonari umane coltivate all'ALI a gas, particelle o atmosfere complesse (ad esempio, fumo di sigaretta), fornendo così un realistico l'esposizione della superficie apicale della regione alveolare umana all'aria. A differenza dei modelli di esposizione sequenziale con guida aerosol lineare, la progettazione modulare del sistema a flusso radiale soddisfa tutti i requisiti per la generazione continua e il trasporto dell'atmosfera di prova alle cellule, una distribuzione omogenea e la deposizione di le particelle e la continua rimozione dell'atmosfera. Questo metodo di esposizione è progettato principalmente per l'esposizione delle cellule alle particelle trasportate dall'aria, ma può essere adattato all'esposizione di aerosol liquidi e gas altamente tossici e aggressivi a seconda del metodo di generazione degli aerosol e del materiale dei moduli di esposizione .
Nell'ambito di uno studio di convalida recentemente completato, questo sistema di esposizione si è dimostrato un metodo di screening trasferibile, riproducibile e predittivo per la valutazione qualitativa della citotossicità polmonare acuta delle particelle trasportate dall'aria, potenzialmente riducendo o sostituendo esperimenti sugli animali che normalmente fornirebbeno questa valutazione tossicologica.

Il CULTEX RFS è un sistema modulare di esposizione in vitro appositamente progettato che consente l'esposizione diretta e omogenea delle cellule all'ALI. Nell'ambito di un precedente studio di pre-convalida, l'applicabilità generale di questo sistema di esposizione e la sua trasferibilità, stabilità e riproducibilità sono state dimostrate con successo. In un recente progetto di ricerca finanziato dal Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca, il sistema di esposizion...

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Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Presentiamo un sistema di esposizione in vitro robusto, trasferibile e predittivo per lo screening e il monitoraggio delle particelle trasportate dall'aria sulla loro citotossicità polmonare acuta esponendo le cellule polmonari umane coltivate all'interfaccia aria-liquido (ALI).

Valutazione della tossicità dell'inalazione acuta delle particelle aerotrasportate esponendo cellule polmonari umane coltivate all'interfaccia aria-liquida

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Lo screening delle particelle trasportate dall'aria riguardanti la citotossicità polmonare acuta esponendo le cellule polmonari umane coltivate all'ALI utilizzando questo sistema di esposizione in vitro può contribuire a ridurre gli esperimenti sugli animali. Il principale vantaggio di questo sistema di esposizione è il concetto di distribuzione radiale degli aerosol che porta ad una distribuzione omogenea e alla posizione delle particelle sulle cellule. Prima di seminare le cellule, aggiungere 2,5 millilitri di mezzo di crescita temperato a ogni pozzo di una piastra di sei poggiasaggio.Posizionare accuratamente gli inserti di coltura cellulare senza celle all'interno dei pozzetti e aggiungere un millilitro di mezzo di crescita a ogni inserto di coltura cellulare. Incubare le piastre per 30 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo la tripsininazione delle cellule, diluire 100 microlitri della sospensione della coltura cellulare in una tazza piena di 10 millilitri di soluzione isotonica.Inclinare lentamente la tazza senza tremare. Su un contatore di celle, determinare il numero di cellule vitali per millilitro e la vitalità cellulare in base ai parametri di misurazione specifici della cella delle celle A549. Dopo il rinvenimento della piastra, aspirare il mezzo all'interno degli inserti di coltura cellulare e seminare un millilitro di cellule A549 con una densità di tre volte 10 alla quinta cella per millilitri in ogni inserto di coltura cellulare.Distribuire la sospensione cellulare a dondolo delicato e incubare per 24 ore. Impostare il tempo di pressione tramite il controllo del tempo sul lato anteriore della pressa. Aprire l'alimentazione dell'aria compressa alla valvola ad aria compressa.Utilizzando il regolatore di pressione sul lato anteriore della pressa, impostare la pressione dell'aria compressa su circa due barre. Estrarre il cassetto, premere il pulsante Press e leggere la pressione di pressione sull'interruttore di pressione digitale. Riempire il contenitore della sostanza con una piccola quantità della sostanza in esame.Inserire lo stantuffo nel contenitore della sostanza e girarlo leggermente avanti e indietro per distribuire uniformemente la polvere nel contenitore. Posizionare il contenitore della sostanza, con lo stantuffo, nel cassetto e premere il pulsante Premi. Aprire il cassetto e rimuovere lo stantuffo.Un passo critico è la pressatura di sostanze in esame che devono essere specificamente compresse in una torta di polvere all'interno del contenitore della sostanza al fine di consentire esposizioni stabili al particolato. Rimuovere l'adattatore di ingresso e il riflettore della condensa dal modulo di guida aerosol. Chiudere i tre fori di alimentazione aerosol nel modulo di guida aerosol con spine e le connessioni di alimentazione medie al modulo di campionamento con lembi fittizi.Collegare le linee del vuoto con il connettore del tubo del modulo di guida aerosol. Utilizzare il volantino per chiudere il modulo e misurare il valore dei controller di flusso. Un paio di minuti dopo la chiusura, i valori diminuiscono sotto i cinque millilitri al minuto.Avviare il software del generatore di aerosol. Se il raschietto della sostanza non si trova nella posizione più bassa, premere il pulsante Homing Mode. Posizionare il contenitore della sostanza con il materiale di prova pressato capovolto sopra il raschietto della sostanza.Assicurarsi che il vetro del contenitore della sostanza sia anteriore. Posizionare la piastra di bloccaggio nello slot sopra il contenitore della sostanza e stringere la vite nera. Modificare i valori di Avanzamento e Rotazione in base alle impostazioni desiderate.Utilizzare le frecce verso il basso per spingere verso il basso lo scivolo con il contenitore della sostanza fino a quando il raschietto della sostanza non è vicino alla sostanza pressata. Aprire l'alimentazione dell'aria compressa al generatore di aerosol con un tocco del controller di flusso di massa e avviare la generazione di aerosol facendo clic sul pulsante Start. Impostare la velocità di avanzamento su 15-20 millimetri all'ora per evitare lunghi tempi di attesa.Controllare la corretta generazione di particelle osservando la nube di polvere fine con una piccola torcia posizionata dal basso dietro il tubo di vetro dell'elutriatore. Avviare l'alimentazione media con mezzo di esposizione preriscaldato e riempire i moduli di campionamento fino a quando i downpipe sono coperti mentre il modulo è aperto. Inserire inserti di coltura a celle cieche nel modulo di esposizione, pompare il mezzo di esposizione verso il basso fino a quando i downpipe sono coperti con mezzi e il lato inferiore degli inserti è a contatto con il mezzo.Avviare il generatore di aerosol, chiudere il modulo di esposizione e collegare il modulo di esposizione all'uscita del modulo di esposizione del generatore di aerosol. 30 minuti dopo il lead time, sigillare l'uscita del modulo di esposizione dell'elutriatore con un tappo di gomma e rimuovere gli inserti ciechi. Riempire il mezzo di esposizione fino a quando i downpipes sono ricoperti di mezzo.Rimuovere gli inserti di coltura cellulare dalle sei piastre del pozzo con l'aiuto di pinzette. Versare attentamente il mezzo di crescita dagli inserti di coltura cellulare rovesciando gli inserti e utilizzare una pipetta per aspirare e scartare il liquido residuo. Posizionare gli inserti nelle camere di esposizione sia dei moduli di esposizione che di aria pulita.Chiudere i moduli e avviare gli esperimenti di esposizione collegando contemporaneamente il modulo di esposizione all'uscita del modulo di esposizione del generatore di aerosol e del modulo aria pulita all'alimentazione del gas vettore. Dopo aver completato l'esperimento, scollegare l'esposizione e i moduli di aria pulita e sigillare l'uscita del modulo di esposizione. Interrompere l'alimentazione dell'aria compressa e il generatore di aerosol facendo clic sul pulsante Interrompi.Aprire il modulo esposizione e aria pulita e utilizzare una pinzetta per trasferire gli inserti di coltura cellulare nelle sei piastre di pozzo preparate dopo l'incubazione. Incubare le sei piastre del pozzo, così come gli inserti di coltura cellulare non esposta, per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica all'interfaccia del liquido dell'aria. 24 ore dopo l'esposizione, inserire gli inserti di coltura cellulare nelle nuove sei piastre di pozzo preparate.Aggiungere un millilitro della soluzione WST1 preparata fresca ad ogni inserto di coltura cellulare. Dondolare accuratamente le piastre per distribuire la soluzione in modo omogeneo sulle cellule. Incubare le sei piastre del pozzo con gli inserti di coltura cellulare per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Successivamente, trasferire 100 microlitri del supernatante in triplicati da ogni piastra di sei pozza di pozzo a una piastra da 96 porri. Utilizzando un lettore di micropiastrine, misurare l'assorbanza a 450 nanometri con una lunghezza d'onda di riferimento di 650 nanometri. Cultex RFS è un sistema modulare di esposizione modulare in vitro appositamente progettato che consente l'esposizione diretta e omogenea delle cellule alle particelle trasportate dall'aria nell'interfaccia del liquido dell'aria.L'esposizione delle cellule all'aria pulita non porta a alcuna diminuzione della vitalità cellulare nel tempo. Il sistema di esposizione è stato convalidato e stabilito con successo come modello di previsione per i rischi di inalazione acuta dei composti testati. Esposizione di cellule A549 a diverse sostanze di prova che non presentavano tossicità, media o forte.Assicurarsi di mantenere rigorosamente i tempi di incubazione, i tempi di consegna della generazione di particolato e i tempi di deposizione del particolato. Questo metodo di esposizione è progettato principalmente per l'esposizione al particolato delle cellule, ma può essere esteso all'esposizione di aerosol liquidi e gas adattando il metodo di generazione dell'aerosol. Questo metodo di screening consente la valutazione qualitativa delle particelle inalabili per quanto riguarda la tossicità acuta per inalazione in vitro, riducendo così la sperimentazione animale che normalmente fornirebbe questa valutazione tossicologica.Non dimenticare che lavorare con sostanze di prova tossiche può essere estremamente pericoloso e precauzioni, come indossare guanti, una maschera, dovrebbero sempre essere prese quando si maneggiano tali composti.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Isolamento di mouse cellule epiteliali delle vie respiratorie ed esposizione al fumo di sigaretta Sperimentale interfaccia Air Liquid

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Ricerca

Medicina

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Citometria a Flusso test cellulare per individuare gli anticorpi per N-metil-D-aspartato Receptor o dopamina-2 recettore nel siero umano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Un modello murino di ischemia miocardica e riperfusione lesioni da legatura della arteria discendente anteriore sinistra

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolamento di cellule umane endoteliali linfatico da Multi-parametro fluorescenza-attivato cell sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Diffuse spettroscopia ottica per la valutazione quantitativa di acuta radiazioni ionizzanti tossicità cutanee indotte Utilizzando un modello di topo

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

La valutazione dell&#39;outcome primario in un modello suino di infarto miocardico acuto

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Aprire tracheostomia gastrico acido aspirazione Modello murino di lesioni polmonari acute Risultati in massima acuta non letale Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosforo-31 spettroscopia di risonanza magnetica: uno strumento per misurare<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacità fosforilazione ossidativa mitocondriale nel muscolo scheletrico umano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione diretta del lipopolioaccaride intracheale

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Oral Health Assessment by Lay Personnel for Older Adults

Valutazione della salute orale da parte del personale laico per gli adulti più anziani

Oral health is an often-undervalued contributor to overall health. The literature, however, underscores the myriad of systemic diseases influenced by oral ...