Name: assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface
Uploaded: 2020-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

이 작품은 독일 연방 교육 연구부 (분데스 장관 퓌르 빌둥 und Forschung, BMBF, 독일 (그랜트 031A581, 하위 프로젝트 A-D))와 독일 연구 재단 (도이치 포슈슈젤샤프트, DFG) 지원되었다, 연구 훈련 그룹 GRK 2338).

참고: 한 노출 실험의 프로토콜은 3일의 기간을 다룹니다.
1일차
1. 세포의 일반적인 준비 및 재배
참고: 인간 폐 선암상피 세포주 A549를 노출 실험에 사용하였다. 세포는 멸균 조건하에서 처리되어야 합니다. ALI에서 의 재배에 적합한 다른 세포주를 사용할 수 있다.
<ol><li>성장 배지(덜베코의 최소 필수 배지(DMEM)를 준비하고, 10% 태아 ?...

<ol>
	<li>Faber, S. C., McCullough, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+the+Looking+Glass:+In+vitro+Models+for+Inhalation+Toxicology+and+Interindividual+Variability+in+the+Airway.">Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).</li><li>De Matteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+challenges+in+occupational+lung+diseases.">Current and new challenges in occupational lung diseases.</a> European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).</li><li>LANUV Nordrhein-Westfalen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).</li><li>B&#233;rub&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Inhalation+Toxicity+and+Disease.+The+report+of+a+FRAME+workshop.">In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop.</a> Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).</li><li>Lopez, A. D., Murray, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+disease,+1990-2020.">The global burden of disease, 1990-2020.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).</li><li>Clippinger, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+approaches+for+acute+inhalation+toxicity+testing+to+address+global+regulatory+and+non-regulatory+data+requirements:+An+international+workshop+report.">Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report.</a> Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).</li><li>Agrawal, M. R., Winder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+and+Occurrence+of+LD50+Values+for+Materials+in+the+Workplace.">Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace.</a> Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).</li><li>Amtsblatt der Europ&#228;ischen Union. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verordnung+(EG)+Nr.+1907/2006+des+Europ&#228;ischen+Parlaments+und+des+Rates.">Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europ&#228;ischen Parlaments und des Rates.</a> Europ&#228;ische Union. 860, (2006).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+Organ-Level+Lung+Functions+on+a+Chip.">Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Fisher, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Human+Lung+Slices+in+Toxicology.">The Use of Human Lung Slices in Toxicology.</a> Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).</li><li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+and+Oxidative+Stress+Responses+of+an+Alveolar+Epithelial+Cell+Line+to+Airborne+Zinc+Oxide+Nanoparticles+at+the+Air-Liquid+Interface.">Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 12, (2013).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+as+an+in+vitro+exposure+method+to+assess+acute+pulmonary+toxicity+of+fine+dusts+and+nanoparticles+with+special+focus+on+the+intra-+and+inter-laboratory+reproducibility.">Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility.</a> Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).</li><li>Lacroix, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-Liquid+Interface+In+vitro+Models+for+Respiratory+Toxicology+Research.">Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).</li><li>Eskes, C., Whelan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, (2016).</li><li>Rach, J., Budde, J., M&#246;hle, N., Aufderheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+exposure+at+the+air-liquid+interface:+Evaluation+of+an+in+vitro+approach+for+simulating+inhalation+of+airborne+substances.">Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances.</a> Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).</li><li>Aufderheide, M., Halter, B., M&#246;hle, N., Hochrainer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CULTEX+RFS:+A+comprehensive+Technical+Approach+for+the+In+vitro+Exposure+of+Airway+Epithelial+Cells+to+the+Particulate+Matter+at+the+Air-Liquid+Interface.">The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 15, (2013).</li><li>Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Carterson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates:+Alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).</li><li>Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. 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J., Birch, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+GS-NS0+myeloma+cells+to+pH+shifts+and+pH+perturbations.">The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+Guideline+433:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2018).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , (2018).</li></ol>

많은 비동물 흡입 독성 시험 모델은 흡입 가능한 입자의 급성 흡입 위험에 대한 정보를 얻고 3R 원리25에따라 동물 실험을 감소 및 대체하기 위해 최근에 개발되었다.
세포 배양 모델의 관점에서, 세포의 노출은 침수 된 조건 또는 ALI에서 수행 될 수있다. 침수 된 조건 하에서 세포를 노출하는 것은 물리 화학적 특성에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서, 시험 물?...

유독한 공기 중 입자의 흡입은 공중 위생 관심사, 전 세계적으로 건강 위험의 다수로 이끌어 내고 죽음의 많은 수백만 매년1,2. 기후변화, 지속적인 산업발전, 에너지, 농산물 및 소비재에 대한 수요 증가는 지난 몇 년간폐질환의증가에 기여해 왔으며3, 4,5,6. 그들의 급성 흡입 독성에 관한 흡입 성 물질의 지식과 평가는 위험 평가 및 위험 관리의 기초를 제공하지만,이 정보는 여전히 이러한 물질의 넓은 범위에 대한 부족7,8. 2006년부터 EU 화학 법규 REACH(화학물질등록, 평가, 승인 및 제한)는 기존 및 새로 도입된 제품이 시장에 출시되기 전에 흡입 경로를 포함한 독성 특성화를 거쳐야 합니다. 따라서 REACH는 대체 및 동물 없는 방법, "3R" 원리의 구현(동물 실험의 대체, 정제 및 감소) 및 적절한 시험관 내 모델의 사용에 초점을 맞추고9. 최근 몇 년 동안, 많은 상이하고 적절한 비동물 흡입 독성 시험 모델(예를 들어, 시험관 내 세포 배양, 폐온칩 모델, 정밀 절단 폐 슬라이스(PCLS))은 공기 중 입자의 급성 흡입 독성을 평가하기 위해 개발되어5,7,10,11. 시험관 내 세포 배양 모델의 관점에서, 경작된 세포는 침수된 조건 하에서 또는 ALI에서 노출될 수있다(도 1). 그러나, 침수 된 노출 연구의 타당성은 공기 중 화합물 특히 입자의 독성평가에 관하여 제한된다. 침수 된 노출 기술은 생체 내 인간 상황에 부합하지 않습니다; 세포를 덮는 세포 배양 배지는 물리-화학적 특성에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서, 시험물질(12,13)의독성 성질을 갖는다. ALI 체외 흡입 모델은 시험 입자와 세포 배양 배지의 간섭없이 시험 물질에 세포의 직접 노출을 허용, 따라서, 침수 노출보다 더 높은 생리적 및 생물학적 유사성을 가진 인간의 노출을 모방12,14.
REACH와 같은 규제 프로세스의 경우, 급성 흡입 독성학 분야에서 동물 모델만 사용할 수 있으며, 시험관 내 대안이 충분히 검증되지 않았고 지금까지14. 이를 위해, 시험 모델은 시험 타당성에 대한 유럽 연합 참조 연구소의 동물 실험 대안(EURL-ECVAM) 원칙에 따라 검증되어야 합니다15.
이전 사전 검증 연구 및 최근 완료 된 검증 연구는 성공적으로 CULTEX RFS 노출 시스템의 적용 영역과 그 전송성, 안정성 및 재현성13을입증했다. 이러한 노출 시스템은 그 방사형 에어로졸 분포 개념 및 시험 에어로졸의 전도로 인해 ALI에서 가스, 입자 또는 복잡한 대기(예를 들어, 담배 연기)에 세포의 균질한 노출을 가능하게 하는 시험관내 세포 기반 노출시스템(16)을통해 연속적인 흐름으로. 이 방사형 유량 시스템의 기본 모듈은 인렛 어댑터, 방사형 에어로졸 분포가 있는 에어로졸 가이딩 모듈, 샘플링 및 소켓 모듈, 핸드 휠이 있는 잠금 모듈로구성됩니다(그림 2). 생성된 입자는 인렛 어댑터 및 에어로졸 가이딩 모듈을 통해 세포에 도달하고 샘플링 모듈의 3개의 방사형 배치된 노출 챔버에 위치한 세포 배양 인서트상에 증착된다. 에어로졸 가이딩 모듈과 샘플링 모듈은 외부수조(17)에연결하여 가열할 수 있다.
두 연구의 틀 내에서, A549 세포는 모든 노출 실험에 사용되었다. 상기 세포주 A549는 인간 불멸의 상피 세포주로서 매우 잘 특성화되어 수많은 독성 연구에서 II형 폐포 상피 세포에 대한 시험관내 모델로 사용되어 왔다. 상기 세포는 라멜라 체, 계면활성제 및 다수의 염증 관련인자(18)의생산을 특징으로 한다. 그(것)들은 또한 그들의 점액 생산19때문에 기관지 상피 세포의 속성을 보여줍니다. 또한 ALI에서 배양할 수 있습니다. 이러한 세포주들은 세포-세포 접촉을 구축하는데 결핍되어 있지만, 이들 세포의 배양은 훨씬 더 편리하고, 비용이 적게 들고, 이의 유래 된 결과는 1차세포(20)에비해 공여자-독립적이다.
A549 세포를 삽입당 3.0 x 105 세포의 밀도로 6웰 세포 배양 인서트(PET 멤브레인, 4.67 cm2,기공 크기 0.4 mm)에서 시드하고 24시간 동안 침수된 조건에서 배양하였다. 세포는 공기를 청소하기 위해 3 개의 독립적 인 실험실에서 노출된 후 ALI에서 20 개의 시험 물질 중 3 가지 노출 용량 (25, 50 및 100 μg / cm2)을노출했습니다. 노출 량은 각각 15, 30 또는 60 분 후에 세포에 25 μg/cm2,50 μg/cm2 및 100 μg/cm2의 일정한 입자 비율의 결과로 증착 시간과 상관됩니다. 증착된 입자는, 그러나, 증착 후에 떨어져 세척되지 않았습니다, 그러나 24 시간 동안 세포에 남아 있었습니다. 입자의 증착 시간은 따라서 15, 30 및 60 분이었지만 세포의 노출은 총 24 시간 동안 지속되었습니다. 시험 물질의 증착 속도는 이전 방법17에따른 예비 실험에서 결정되었다.
세포 생존력의 지표로서 세포 생존력은 세포 생존성 분석기를 사용하여 입자 증착 후 24시간 평가되었다. 특히 청정 공기 제어의 품질, 노출 프로토콜의 최적화 및 개선, 실험실 내 재현성 및 예측 모델(PM)의 확립에 중점을 두였습니다. 세포 생존율 50% 이하(PM 50%) 감소를 초래한 물질 또는 75% (PM 75%) 3개의 노출 복용량 중 어느 에서든 급성 흡입 위험을 발휘하는 것으로 간주되었다. 그 후 생체내 데이터(OECD 테스트 가이드라인(TG) 403 또는 TG 43621,22에따른 최소 하나의 신뢰할 수 있는 연구결과에 기초하여, 83%의 특이성 및 88%의 민감도를 가진 85%의 전체 적인 일치로 이끌어 내는 결과를 비교하였다.
세포 생존가능성의 측정 외에, 사이토카인 방출과 같은 다른 종점, LDH 분석시험을 통한 세포 용해 또는 막 무결성의 검사는 평가될 수 있지만 유효성 검사 연구에는 필요하지 않았다. 따라서, 노광 시스템(예를 들어, CULTEX RFS)은 시험된 공수 입자의 급성 흡입 독성에 대한 질적 평가를 위한 예측 스크리닝 시스템으로서 입증되었으며, 동물 실험에 대한 유망한 대체 방법을 나타낸다. 다음 프로토콜은 이 노출 시스템을 사용하여 공중 입자에 대한 노출 실험에 권장됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium and supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>FG 0415</td>
			<td>used as growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td>22320</td>
			<td>used as exposure medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S 0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10mg/mL)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>A 2710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Th. Geyer, Renningen, Germany</td>
			<td>L 0180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 2143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cups</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3516</td>
			<td>6&#173;-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell cell culture inserts</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3450</td>
			<td>24mm inserts; 6-&#173;well plates; 0.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASYton</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Air (DIN EN 12021)</td>
			<td>Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td>2290152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab155902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments + equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cell Counter</td>
			<td>Sch&#228;rfe System GmbH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation thermostat</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline RE 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX HyP - Hydraulic Press</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX insert sleeve</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (large)</td>
			<td>Munktell &#38; Filtrak GmbH, Sachsen, Germany</td>
			<td>LP-050</td>
			<td>Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency &#62; 99,999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (small)</td>
			<td>Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany</td>
			<td>9933-05-DQ</td>
			<td>Balston disposable filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pump</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td>Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser</td>
			<td>digital peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader Infinite M200 Pro</td>
			<td>Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vakuum pump</td>
			<td>KNF, Freiburg, Germany</td>
			<td>N86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#246;gtlin mass flow controller 0,2-10 l/min</td>
			<td>TrigasFI GmbH</td>
			<td>V&#246;gtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline Staredition RE 104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface

여기에서, 우리는 ALI에서 재배된 인간 폐 세포의 균질한 노출을 가스, 입자 또는 복잡한 대기(예: 담배 연기)에 균질하게 노출할 수 있도록 특별히 설계된 시험관 내 노출 시스템을 제시하여 현실적인 생리학적 인 생리학적 을 제공합니다. 공기에 인간 폐포 영역의 정점 표면의 노출. 선형 에어로졸 가이던스가 있는 순차적 노광 모델과 는 달리, 방사형 유량 계통의 모듈식 설계는 테스트 분위기의 연속 생성 및 세포 수송, 균질한 분포 및 증착에 대한 모든 요구 사항을 충족합니다. 입자와 대기의 지속적인 제거. 이 노출 방법은 주로 공기 중 입자에 세포의 노출을 위해 설계, 하지만 에어로졸 생성 방법 및 노출 모듈의 재료에 따라 액체 에어로졸 및 매우 독성및 공격적인 가스의 노출에 적응 될 수있다 .
최근 완료된 검증 연구의 틀 안에서, 이 노출 시스템은 공기 중 입자의 급성 폐 세포 독성의 질적 평가를 위한 양도 가능, 재현 가능 및 예측 스크리닝 방법으로 입증되었으며, 이에 따라 잠재적으로 감소 또는 일반적으로이 독성 평가를 제공 하는 동물 실험을 대체.

CULTEX RFS는 ALI에서 세포의 직접적이고 균일한 노출을 가능하게 하는 특별히 설계된 시험관 내 노출 시스템입니다. 이전 사전 검증 연구 내에서, 이 노출 시스템의 일반적인 적용 가능성과 그 전이성, 안정성 및 재현성이 성공적으로 입증되었다. 독일 연방 교육 연구부의 지원을 받은 최근 연구 프로젝트에서 노출 시스템은 테스트된 화합물의 급성 흡입 위험에 대한 예측 모...

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Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

우리는 공기 액체 인터페이스 (ALI)에서 경작 된 인간 폐 세포를 노출시킴으로써 급성 폐 세포 독성에 관한 공기 중 입자의 스크리닝 및 모니터링을위한 견고하고 양도 가능하며 예측 가능한 체외 노출 시스템을 제시합니다.

공기-액체 인터페이스에서 재배된 인간 폐 세포를 노출하여 공기 중 입자의 급성 흡입 독성 평가

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

이 체외 노출 시스템을 사용하여 ALI에서 경작된 인간 폐 세포를 노출시킴으로써 급성 폐 세포 독성에 관한 공중 입자의 검사는 동물 실험을 줄이는 데 도움이 될 수 있다. 이러한 노출 시스템의 주요 장점은 세포상에 균질분포및 입자의 위치를 이끌어 내는 방사형 에어로졸 분포 개념이다. 세포를 파종하기 전에 6 개의 웰 플레이트의 각 웰에 2.5 밀리리터의 강화 된 성장 매체를 추가하십시오.세포 배양 물기를 우물 내부에 조심스럽게 배치하고 모든 세포 배양 삽입에 성장 배지 1 밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 30분간 배양합니다. 세포의 트립시화 후, 10 밀리리터의 등산화용액으로 채워진 컵에 세포 배양 현탁액의 100 마이크로리터를 희석시한다.흔들리지 않고 컵을 천천히 기울이는다. 세포 카운터에서, A549 세포의 세포 특이적 측정 파라미터를 기반으로 밀리리터 당 가능한 세포 및 세포 생존가능성을 결정한다. 플레이트의 템퍼링 후, 각 세포 배양물에서 밀리리터당 3배 10의 밀도를 가진 A549 세포의 세포 배양 삽입 및 종자 1밀리리터 내의 배지를 흡인한다.부드러운 흔들림으로 세포 현탁액을 분배하고 24 시간 동안 배양하십시오. 프레스 의 전면에 시간 제어를 통해 프레스 시간을 설정합니다. 압축 공기 밸브에서 압축 공기 공급을 엽니다.프레스 의 전면에 압력 레귤레이터를 사용하여 압축 공기 압력을 약 2 개의 막대로 설정합니다. 서랍을 꺼내 누르기 버튼을 누르고 디지털 압력 스위치의 압박을 읽습니다. 소량의 시험 물질로 물질 용기를 채웁니다.플런저를 물질 용기에 삽입하고 약간 앞뒤로 돌려 용기에 분말을 고르게 분배합니다. 플런저를 장착한 물질 용기를 서랍에 넣고 누기 버튼을 누릅니다. 서랍을 열고 플런저를 제거합니다.중요한 단계는 안정적인 미립자 노출을 가능하게하기 위해 물질 용기 내의 분말 케이크로 특별히 압축되어야하는 테스트 물질의 압박입니다. 에어로졸 안내 모듈에서 입구 어댑터와 응축수 반사판을 제거합니다. 에어로졸 안내 모듈의 에어로졸 먹이 보어 3개를 플러그와 더미 플랩으로 샘플링 모듈의 중간 공급 연결으로 닫습니다.에어로졸 가이딩 모듈의 튜브 커넥터와 진공 선을 연결합니다. 핸드 휠을 사용하여 모듈을 닫고 유량 컨트롤러의 값을 측정합니다. 닫은 후 몇 분 후에 값은 분당 5 밀리리터 미만으로 감소합니다.에어로졸 생성기 소프트웨어를 시작합니다. 물질 스크레이퍼가 가장 낮은 위치에 있지 않은 경우 버튼 호밍 모드를 누릅니다. 압착 된 테스트 재료로 물질 용기를 물질 스크레이퍼 위에 거꾸로 놓습니다.물질 용기의 유리가 전면에 직면하도록 하십시오. 잠금 플레이트를 슬롯에 놓고 물질 용기 위에 놓고 검은 나사를 조입니다. 피드 및 회전값을 원하는 설정으로 변경합니다.아래쪽 화살표를 사용하여 물질 스크레이퍼가 압착 물질 근처에 될 때까지 물질 용기와 함께 슬라이드를 밀어 넣습니다. 압축 공기 공급 장치를 질량 흐름 컨트롤러를 탭하여 에어로졸 발전기로 열고 시작 버튼을 클릭하여 에어로졸 생성을 시작합니다. 긴 대기 시간을 피하기 위해 시간당 공급 속도를 15~20mm로 설정합니다.용유리튜브 의 유리튜브 뒤에서 작은 손전등으로 미세먼지 구름을 관찰하여 올바른 입자 생성을 제어한다. 중간 공급에 예열된 노출 매체로 시작하고 모듈이 열려 있는 동안 다운파이프가 덮일 때까지 샘플링 모듈을 채웁니다. 블라인드 셀 배양 삽입을 노출 모듈에 삽입하고, 하부 파이프가 매체로 덮여 있고 인서츠의 하부가 매체와 접촉할 때까지 노출 매체를 아래로 펌핑한다.에어로졸 발전기를 시작하고, 노출 모듈을 닫고, 에어로졸 발전기의 노출 모듈 콘센트에 노출 모듈을 연결한다. 리드 타임 후 30분 후, 용류기의 노출 모듈 콘센트를 고무 플러그로 밀봉하고 블라인드 인서트를 제거합니다. 다운파이프가 매체로 덮일 때까지 노출 매체를 다시 채웁니다.핀셋의 도움으로 6 개의 우물 플레이트에서 세포 배양 삽입을 제거합니다. 인서트를 덮어 세포 배양으로부터 조심스럽게 성장 배지를 붓고 파이펫을 사용하여 잔류 액체를 흡인하고 폐기합니다. 노출 및 청정 공기 모듈의 노출 챔버에 인서트를 배치합니다.에어로졸 발전기의 노출 모듈 콘센트와 청정 공기 모듈을 캐리어 가스 공급에 동시에 연결하여 모듈을 닫고 노출 실험을 시작합니다. 실험을 완료한 후, 노출 및 깨끗한 공기 모듈을 분리하고 노출 모듈 콘센트를 밀봉합니다. 정지 버튼을 클릭하여 압축 공기 공급 장치와 에어로졸 생성기를 중지합니다.노출 및 깨끗한 공기 모듈을 열고 핀셋을 사용하여 셀 배양 인서트를 준비된 인큐베이션 6개의 웰 플레이트로 전송합니다. 6개의 웰 플레이트와 노출되지 않은 세포 배양 인서트에 24시간 동안 37도, 공기 액상 인터페이스에서 이산화탄소 5%를 배양합니다. 노출 후 24시간, 새로운 준비된 6개의 웰 플레이트에 세포 배양 인서트를 삽입한다.각 세포 배양 삽입에 신선한 준비된 WST1 용액1밀리리터를 추가합니다. 용액을 세포에 균일하게 분배하기 위해 플레이트를 조심스럽게 흔들어 주세요. 세포 배양 인서트와 함께 6 개의 우물 플레이트를 섭씨 37도및 이산화탄소 5 %에서 1 시간 동안 배양하십시오.그 후, 6개의 웰 플레이트에서 96웰 플레이트로 세쌍둥이의 100마이크로리터를 세쌍둥이로 옮기다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 기준 파장 650나노미터로 450나노미터의 흡광도를 측정합니다. CULTEX RFS는 특수 설계된 모듈식 시험관 내 노출 시스템으로 공기 액체 인터페이스에서 공기 중 입자에 직접 적이고 균일하게 노출될 수 있습니다.깨끗한 공기에 세포의 노출은 시간이 지남에 따라 세포 생존의 감소로 이어질. 노출 시스템은 성공적으로 검증되고 테스트된 화합물의 급성 흡입 위험에 대한 예측 모델로 확립되었다. A549 세포의 노출은 아니, 매체, 또는 강한 독성을 전시 하는 다른 테스트 물질에 세포.잠복기, 미립자 발생의 리드 타임, 미립자 증착 시간인 시간 프레임을 엄격하게 보관하십시오. 이러한 노출 방법은 주로 세포의 미립자 노출을 위해 설계되었지만 에어로졸 생성 방법을 적용하여 액체 에어로졸 및 가스의 노출로 확장될 수 있다. 이 스크리닝 방법은 시험관 내급성 흡입 독성에 관한 흡입 가능한 입자의 질적 평가를 가능하게 하여 일반적으로 이러한 독성 평가를 제공하는 동물 실험을 감소시킵니다.독성 테스트 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 장갑, 마스크를 착용하는 것과 같은 예방 조치는 그러한 화합물을 취급할 때 항상 취해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

에어 리퀴드 인터페이스에서 마우스 호흡기 상피 세포 및 실험 담배 연기에 노출의 분리

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

연구

의학

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

인간 혈청에있는 N-메틸-D-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

왼쪽 앞쪽에 내림차순 동맥의 결찰을 통해 심근 허혈 - 재관류 손상의 생쥐 모델

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

마우스 모델을 사용하여 급성 이온화 방사선 유발 피부 독성의 정량적 평가를위한 광학 분광학 확산

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

급성 심근 경색의 돼지 모델의 주요 결과 평가

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

급성 폐 손상의 열기 기관 절개 위산 흡인 쥐 모델은 최대한 급성 치명적 폐 손상의 결과

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

인-31 자기 공명 분광학 : 측정을위한 도구<em&gt; 생체</em인간의 골격 근육에&gt; 미토콘드리아 산화 적 인산화 능력

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

직접 경포당증 주입에 의해 마우스에 있는 심각한 폐 상해를 유도하는

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Oral Health Assessment by Lay Personnel for Older Adults

노인을위한 평신도 직원에 의한 구강 건강 평가

Oral health is an often-undervalued contributor to overall health. The literature, however, underscores the myriad of systemic diseases influenced by oral ...