Name: assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface
Uploaded: 2020-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Tyskland (Grant 031A581, underprosjekt A-D)) og av Den tyske forskningsstiftelsen (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Forskningsopplæringsgruppe GRK 2338).

MERK: Protokollen for ett eksponeringseksperiment dekker en periode på tre dager.
Dag 1
1. Generelle preparater og dyrking av celler
MERK: Human lungeadenokarsinom epitelcellelinje A549 ble brukt til eksponeringseksperimenter. Celler må håndteres under sterile forhold. Andre cellelinjer som er egnet for dyrking ved ALI kan brukes.
<ol><li>Forbered vekstmediet (Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM), supplert med 10% føtal storfe...

<ol>
	<li>Faber, S. C., McCullough, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+the+Looking+Glass:+In+vitro+Models+for+Inhalation+Toxicology+and+Interindividual+Variability+in+the+Airway.">Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).</li><li>De Matteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+challenges+in+occupational+lung+diseases.">Current and new challenges in occupational lung diseases.</a> European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).</li><li>LANUV Nordrhein-Westfalen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).</li><li>B&#233;rub&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Inhalation+Toxicity+and+Disease.+The+report+of+a+FRAME+workshop.">In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop.</a> Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).</li><li>Lopez, A. D., Murray, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+disease,+1990-2020.">The global burden of disease, 1990-2020.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).</li><li>Clippinger, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+approaches+for+acute+inhalation+toxicity+testing+to+address+global+regulatory+and+non-regulatory+data+requirements:+An+international+workshop+report.">Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report.</a> Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).</li><li>Agrawal, M. R., Winder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+and+Occurrence+of+LD50+Values+for+Materials+in+the+Workplace.">Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace.</a> Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).</li><li>Amtsblatt der Europ&#228;ischen Union. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verordnung+(EG)+Nr.+1907/2006+des+Europ&#228;ischen+Parlaments+und+des+Rates.">Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europ&#228;ischen Parlaments und des Rates.</a> Europ&#228;ische Union. 860, (2006).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+Organ-Level+Lung+Functions+on+a+Chip.">Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Fisher, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Human+Lung+Slices+in+Toxicology.">The Use of Human Lung Slices in Toxicology.</a> Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).</li><li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+and+Oxidative+Stress+Responses+of+an+Alveolar+Epithelial+Cell+Line+to+Airborne+Zinc+Oxide+Nanoparticles+at+the+Air-Liquid+Interface.">Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 12, (2013).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+as+an+in+vitro+exposure+method+to+assess+acute+pulmonary+toxicity+of+fine+dusts+and+nanoparticles+with+special+focus+on+the+intra-+and+inter-laboratory+reproducibility.">Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility.</a> Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).</li><li>Lacroix, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-Liquid+Interface+In+vitro+Models+for+Respiratory+Toxicology+Research.">Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).</li><li>Eskes, C., Whelan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, (2016).</li><li>Rach, J., Budde, J., M&#246;hle, N., Aufderheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+exposure+at+the+air-liquid+interface:+Evaluation+of+an+in+vitro+approach+for+simulating+inhalation+of+airborne+substances.">Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances.</a> Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).</li><li>Aufderheide, M., Halter, B., M&#246;hle, N., Hochrainer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CULTEX+RFS:+A+comprehensive+Technical+Approach+for+the+In+vitro+Exposure+of+Airway+Epithelial+Cells+to+the+Particulate+Matter+at+the+Air-Liquid+Interface.">The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 15, (2013).</li><li>Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Carterson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates:+Alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).</li><li>Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+useful+in+vitro+model+for+transport+studies+of+alveolar+epithelial+barrier.">A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier.</a> Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+403:+Acute+Inhalation+Toxicity.">Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+436:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+for+the+assessment+of+the+acute+inhalation+toxicity+of+airborne+particles.">Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles.</a> Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+exposure+system+generating+nebulized+aerosol+of+sulfur+mustard+in+comparison+to+the+standard+submerse+exposure.">A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure.</a> Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+CULTEX+radial+flow+system+for+in+vitro+investigation+of+lung+damaging+agents.">Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents.</a> Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).</li><li>Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+GS-NS0+myeloma+cells+to+pH+shifts+and+pH+perturbations.">The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+Guideline+433:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2018).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , (2018).</li></ol>

Mange ikke-dyr innånding toksisitet testing modeller har blitt utviklet de siste årene for å få informasjon om akutt innånding fare for inhalerbare partikler og for å redusere og erstatte dyreforsøk i henhold til 3R prinsippet25.
Når det gjelder cellekulturmodeller, kan eksponering av celler gjøres under nedsenkede forhold eller ved ALI. Utsette celler under nedsenket forhold kan påvirke fysico-kjemiske egenskaper og dermed giftige egenskaper av en test stoff<...

Innånding av giftige luftbårne partikler er en folkehelsebekymring, noe som fører til en rekke helserisikoer over hele verden og mange millioner dødsfall årlig1,2. Klimaendringer, den pågående industriutviklingen og den økende etterspørselen etter energi-, landbruks- og forbrukerprodukter har bidratt til økningen av lungesykdommer de siste årene3,4,5,6. Kunnskap og evaluering av inhalerbare stoffer om akutt innåndingstoksisitet gir grunnlag for farevurdering og risikostyring, men denne informasjonen mangler fortsatt for et bredt spekter av disse stoffene7,8. Siden 2006 krever EUs kjemiske lovgivning REACH (Registrering, evaluering, autorisasjon og begrensning av kjemikalier) at allerede eksisterende og nylig introduserte produkter gjennomgår en toksikologisk karakterisering, inkludert innåndingsruten før de plasseres på markedet. Derfor fokuserer REACH på alternative og dyrefrie metoder, implementeringen av "3R"-prinsippet (Erstatning, raffinement og reduksjon av dyreforsøk) og bruk av passende in vitro-modeller9. I de senere årene har mange forskjellige og tilstrekkelige ikke-dyr innånding toksisitet testing modeller (f.eks in vitro celle kulturer, lunge-på-en-chip modeller, presisjon kuttet lungeskiver (PCLS)) er utviklet for å vurdere den akutte innånding toksisitet av luftbårne partikler5,7,10,11. Når det gjelder in vitro celle kultur modeller, dyrket celler kan bli utsatt under nedsenket forhold eller ved ALI (Figur 1). Imidlertid er gyldigheten av nedsenkede eksponeringsstudier begrenset med hensyn til evaluering av toksisiteten av luftbårne forbindelser, spesielt partikler. Nedsenket eksponeringsteknikker samsvarer ikke med den menneskelige in vivo-situasjonen; cellekulturmediet som dekker cellene kan påvirke fysico-kjemiske egenskaper og dermed de giftige egenskapene til et teststoff12,13. ALI in vitro innånding modeller tillate direkte eksponering av celler til teststoffer uten forstyrrelser av cellekulturmediet med testpartikler, dermed etterligne menneskelig eksponering med høyere fysiologisk og biologisk likhet enn nedsenket eksponering12,14.
For regulatoriske prosesser som REACH er imidlertid bare dyremodeller tilgjengelige innen akutt innånding toksikologi, da ingen alternative in vitro-metoder har blitt tilstrekkelig validert og offisielt akseptert så langt14. For dette formålet må testmodeller valideres i henhold til kravene til EUs referanselaboratorium for alternativer til dyretesting (EURL-ECVAM) prinsipper om testgyldighet15.
En tidligere pre-validering studie og en nylig fullført validering studie vellykket demonstrert e-området av CULTEX RFS eksponeringssystem og dens overførbarhet, stabilitet, og reproduserbarhet13. Dette eksponeringssystemet er et in vitro cellebasert eksponeringssystem som muliggjør homogen eksponering av celler for gasser, partikler eller komplekse atmosfærer (f.eks. sigarettrøyk) ved ALI på grunn av sitt radiale aerosoldistribusjonskonsept og ledning av testaerosolen i en kontinuerlig strøm over cellene16. Den grunnleggende modulen til dette radiale strømningssystemet består av innløpsadapteren, aerosolføringsmodulen med radial aerosoldistribusjon, prøvetaking og socket-modul og en låsemodul med et håndhjul (figur 2). De genererte partiklene når cellene via innløpsadapteren og aerosolføringsmodulen og deponeres på cellekulturinnsatsene, som ligger i de tre radialt arrangerte eksponeringskamrene i prøvetakingsmodulen. Aerosolføringsmodulen samt prøvetakingsmodulen kan varmes opp ved å koble til et eksternt vannbad17.
Innenfor rammen av begge studiene ble A549-celler brukt til alle eksponeringseksperimenter. Cellelinjen A549 er en human udødeliggjort epitelcellelinje som er svært godt karakterisert og har blitt brukt som in vitro-modell for type II alveolær epitelceller i mange toksikologiske studier. Cellene er preget av lamellære kropper, produksjon av overflateaktivt middel og en rekke betennelsesrelevante faktorer18. De viser også egenskaper av bronkial epitelceller på grunn av deres slimproduksjon19. Videre kan de dyrkes på ALI. Selv om denne cellelinjen er mangelfull i å bygge cellecellekontakter, er dyrkingen av disse cellene mye mer praktisk, billigere og resultater avledet av disse er donoruavhengige sammenlignet med primærceller20.
A549 celler ble seeded i 6-brønncellekulturinnsatser (PET membran, 4,67 cm2, porestørrelse 0,4 mm) med en tetthet på 3,0 x 105 celler per innsats og dyrket i 24 timer under nedsenket forhold. Cellene ble deretter eksponert i tre uavhengige laboratorier for ren luft og tre forskjellige eksponeringsdoser (25, 50 og 100 μg/cm2)av 20 teststoffer ved ALI. Eksponeringsdosen er korrelert med avsetningstiden, noe som resulterer i en konstant partikkelhastighet på henholdsvis 25 μg/cm2,50 μg/cm2 og 100 μg/cm2 på cellene etter henholdsvis 15, 30 eller 60 min. Deponerte partiklene ble imidlertid ikke vasket av etter avsetning, men forble på cellene i 24 timer. Partiklenes avsetningstider var derfor 15, 30 og 60 min, men eksponeringen av cellene varte totalt i 24 timer. Avsetningsfrekvensen for teststoffene ble bestemt i foreløpige eksperimenter i henhold til tidligere metoder17.
Cellelevedyktighet som en indikator på toksisitet ble vurdert 24 timer etter partikkelavsetning ved hjelp av en cellelevedyktighetsanalyse. Det ble satt spesielt fokus på kvaliteten på rene luftkontroller, optimalisering og raffinement av eksponeringsprotokollen, intra- og inter-laboratoriereproduserbarhet og etablering av en prediksjonsmodell (PM). Stoffer som førte til en reduksjon av cellelevedyktighet en under 50 % (PM 50 %) eller 75 % (PM 75 %) i noen av de tre eksponeringsdosene ble ansett for å utøve en akutt innåndingsfare. Resultatene ble deretter sammenlignet med eksisterende in vivo-data (basert på minst én pålitelig studie i henhold til OECDs testretningslinje (TG) 403 eller TG 43621,22), noe som førte til en samlet konkordans på 85 %, med en spesifisitet på 83 % og en følsomhet på 88 %23.
I tillegg til måling av cellelevedyktighet, kan andre endepunkter som cytokinfrigjøring, undersøkelse av cellelysat eller membranintegritet via LDH-analyse vurderes, men var ikke nødvendig for valideringsstudien. Dermed ble eksponeringssystemet (f.eks. CULTEX RFS) bevist som et prediktivt screeningsystem for kvalitativ vurdering av den akutte innåndingstoksisiteten til de testede luftbårne partiklene, som representerer en lovende alternativ metode for dyretesting. Følgende protokoll anbefales for eksponeringseksperimenter til luftbårne partikler ved hjelp av dette eksponeringssystemet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium and supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>FG 0415</td>
			<td>used as growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td>22320</td>
			<td>used as exposure medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S 0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10mg/mL)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>A 2710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Th. Geyer, Renningen, Germany</td>
			<td>L 0180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 2143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cups</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3516</td>
			<td>6&#173;-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell cell culture inserts</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3450</td>
			<td>24mm inserts; 6-&#173;well plates; 0.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASYton</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Air (DIN EN 12021)</td>
			<td>Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td>2290152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab155902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments + equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cell Counter</td>
			<td>Sch&#228;rfe System GmbH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation thermostat</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline RE 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX HyP - Hydraulic Press</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX insert sleeve</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (large)</td>
			<td>Munktell &#38; Filtrak GmbH, Sachsen, Germany</td>
			<td>LP-050</td>
			<td>Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency &#62; 99,999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (small)</td>
			<td>Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany</td>
			<td>9933-05-DQ</td>
			<td>Balston disposable filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pump</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td>Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser</td>
			<td>digital peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader Infinite M200 Pro</td>
			<td>Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vakuum pump</td>
			<td>KNF, Freiburg, Germany</td>
			<td>N86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#246;gtlin mass flow controller 0,2-10 l/min</td>
			<td>TrigasFI GmbH</td>
			<td>V&#246;gtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline Staredition RE 104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface

Her presenterer vi et spesialdesignet modulær in vitro eksponeringssystem som muliggjør homogen eksponering av dyrkede menneskelige lungeceller ved ALI til gasser, partikler eller komplekse atmosfærer (f.eks. sigarettrøyk), og gir dermed realistisk fysiologisk eksponering av den apikale overflaten av den menneskelige alveolære regionen til luft. I motsetning til sekvensielle eksponeringsmodeller med lineær aerosolveiledning oppfyller den modulære utformingen av radialstrømningssystemet alle krav til kontinuerlig generasjon og transport av testatmosfæren til cellene, en homogen fordeling og avsetning av partiklene og kontinuerlig fjerning av atmosfæren. Denne eksponeringsmetoden er primært utformet for eksponering av celler for luftbårne partikler, men kan tilpasses eksponeringen av flytende aerosoler og svært giftige og aggressive gasser avhengig av aerosolgenereringsmetoden og materialet i eksponeringsmodulene .
Innenfor rammen av en nylig fullført valideringsstudie ble dette eksponeringssystemet bevist som en overførbar, reproduserbar og prediktiv screeningmetode for kvalitativ vurdering av akutt lungecytotoksisitet av luftbårne partikler, og dermed potensielt redusere eller erstatte dyreforsøk som normalt ville gi denne toksikologiske vurderingen.

CULTEX RFS er et spesialdesignet modulær in vitro-eksponeringssystem som muliggjør direkte og homogen eksponering av celler ved ALI. I en tidligere pre-valideringstudie ble den generelle anvendelsen av dette eksponeringssystemet og dets overførbarhet, stabilitet og reproduserbarhet vellykket demonstrert. I et nylig forskningsprosjekt finansiert av det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet ble eksponeringssystemet vellykket validert og etablert som en prediksjonsmodell ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Vi presenterer et robust, overførbart og prediktivt in vitro-eksponeringssystem for screening og overvåking av luftbårne partikler om deres akutte lungecytotoksisitet ved å utsette dyrkede menneskelige lungeceller ved luftvæskegrensesnittet (ALI).

Vurdering av akutt innånding av luftbårne partikler ved å utsette dyrkede menneskelige lungeceller ved luftflytende grensesnitt

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Screening av luftbårne partikler om akutt lungecyttoksisitet ved å utsette dyrkede humane lungeceller ved ALI ved hjelp av dette in vitro eksponeringssystemet kan bidra til å redusere dyreforsøk. Den største fordelen med dette eksponeringssystemet er det radiale aerosoldistribusjonskonseptet som fører til en homogen fordeling og partiklenes posisjon på cellene. Før du sår cellene, legg til 2,5 milliliter herdet vekstmedium til hver brønn av en seks brønnplate.Plasser cellekulturen innsatser uten celler forsiktig inne i brønnene og legg til en milliliter vekstmedium til hver cellekulturinnsats. Inkuber platene i 30 minutter ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Etter trypsinisering av celler, fortynne 100 mikroliter av cellekulturen suspensjon i en kopp fylt med 10 milliliter isotonisk løsning.Vipp koppen sakte uten å riste. På en celleteller bestemmer du antall levedyktige celler per milliliter og celle levedyktighet basert på cellespesifikke måleparametere for A549-celler. Etter herding av platen, aspirere mediet i cellekulturen setter inn og frø en milliliter A549 celler med en tetthet på tre ganger 10 til femte celler per milliliter i hver celle kultur innsats.Fordel cellefjæringen ved skånsom gynge og inkuber i 24 timer. Still inn trykketiden via tidskontrollen på forsiden av pressen. Åpne trykklufttilførselen ved trykkluftventilen.Bruk trykkregulatoren på forsiden av pressen til å sette trykklufttrykket til ca. to bar. Trekk ut skuffen, trykk på Trykk på-knappen og les trykktrykket på den digitale trykkbryteren. Fyll stoffbeholderen med en liten mengde av teststoffet.Sett stempelet inn i stoffbeholderen og snu det litt frem og tilbake for å fordele pulveret jevnt i beholderen. Plasser stoffbeholderen, med stempelet, i skuffen og trykk på Trykk på knappen. Åpne skuffen og fjern stempelet.Et kritisk trinn er pressing av teststoffer som må komprimeres spesifikt til en pulverkake i stoffbeholderen for å muliggjøre stabile partikkeleksponeringer. Fjern innløpsadapteren og kondensatreflektoren fra aerosolguidingsmodulen. Lukk de tre aerosolfôringsborene i aerosolguidingsmodulen med plugger og mediumforsyningstilkoblinger på prøvetakingsmodulen med dummyklaffer.Koble vakuumledningene til rørkontakten til aerosolguidingsmodulen. Bruk håndhjulet til å lukke modulen og måle verdien til strømningskontrollerne. Et par minutter etter stengetid reduseres verdiene under fem milliliter per minutt.Start aerosolgeneratorprogramvaren. Hvis stoffskraperen ikke er i laveste posisjon, trykker du på knappen Homing Mode. Plasser stoffbeholderen med det pressede testmaterialet opp ned over stoffskraperen.Pass på at glasset i stoffbeholderen vender mot forsiden. Plasser låseplaten i sporet over stoffbeholderen og stram den svarte skruen. Endre verdiene for mating og rotasjon til ønsket innstillinger.Bruk nedoverpilene til å skyve ned lysbildet med stoffbeholderen til stoffet skraper er nær presset stoffet. Åpne trykklufttilførselen til aerosolgeneratoren med et trykk på massestrømningskontrolleren og start aerosolgenereringen ved å klikke på Start-knappen. Sett matehastigheten til 15 til 20 millimeter per time for å unngå lange ventetider.Kontroller riktig partikkelgenerering ved å observere den fine støvskyen med en liten lommelykt plassert nedenfra bak glassrøret til elutriatoren. Start mediumtilførselen med forvarmet eksponeringsmedium og fyll prøvemodulene til downpipes er dekket mens modulen er åpen. Sett inn blindcellekulturinnleggene i eksponeringsmodulen, pump eksponeringsmediet ned til downpipene er dekket med middels og undersiden av innsatsene er i kontakt med medium.Start aerosolgeneratoren, lukk eksponeringsmodulen, og koble eksponeringsmodulen til eksponeringsmoduluttaket til aerosolgeneratoren. 30 minutter etter ledetiten forsegler du eksponeringsmoduluttaket til elutriatoren med en gummiplugg og fjerner blindeinnsatsene. Påfyll eksponeringsmediet til downpipes er dekket med medium.Fjern cellekulturinnleggene fra de seks brønnplatene ved hjelp av pinsett. Hell vekstmediet forsiktig fra cellekulturen setter av ved å velte innsatsene og bruke en pipette til å aspirere og kaste restvæsken. Plasser innsatsene i eksponeringskamrene for både eksponerings- og renluftsmodulene.Lukk modulene og start eksponeringseksperimentene ved å koble eksponeringsmodulen til eksponeringsmoduluttaket til aerosolgeneratoren og ren luftmodul til transportørgassforsyningen samtidig. Etter at eksperimentet er fullført, kobler du fra eksponerings- og renluftmodulene og forsegler eksponeringsmoduluttaket. Stopp trykklufttilførselen og aerosolgeneratoren ved å klikke på Stopp-knappen.Åpne eksponeringen og ren luftmodulen og bruk pinsett for å overføre cellekulturinnsatsene til de tilberedte etterinkubasjonen seks brønnplater. Inkuber de seks brønnplatene, samt de ueksponerte cellekulturinnsatsene, i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid ved luftvæskegrensesnittet. 24 timer etter eksponering, sett inn cellekulturinnsatsene i de nye tilberedte seks brønnplatene.Tilsett en milliliter av den ferske tilberedte WST1-løsningen til hvert cellekulturinnlegg. Rock platene nøye for å distribuere løsningen homogent på cellene. Inkuber de seks brønnplatene med cellekulturinnsatsene i en time ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.Deretter overfører du 100 mikroliter av supernatanten i triplikater fra hver seks brønnplate til en 96 brønnplate. Bruk en mikroplateleser til å måle absorbansen ved 450 nanometer med en referansebølgelengde på 650 nanometer. CULTEX RFS er et spesialdesignet modulært in vitro-eksponeringssystem som gjør det mulig å få direkte og homogen eksponering av celler til luftbårne partikler i luftvæskegrensesnittet.Eksponering av celler for ren luft fører til ingen reduksjon av celle levedyktighet over tid. Eksponeringssystemet ble validert og etablert som en prediksjonsmodell for akutte innåndingsfarer for de testede forbindelsene. Eksponering av A549-celler til forskjellige teststoffer som viste ingen, middels eller sterk toksisitet.Pass på at du strengt holder tidsrammene som er inkubasjonstidene, leveringstiden for partikkelgenerering og partikkeldeponeringstidene. Denne eksponeringsmetoden er primært designet for partikkeleksponering av celler, men kan utvides til eksponering av flytende aerosoler og gasser ved å tilpasse aerosolgenereringsmetoden. Denne screeningmetoden muliggjør kvalitativ vurdering av inhalerbare partikler angående akutt innåndingstoksisitet in vitro, og dermed redusere dyretesting som normalt ville gi denne toksikologiske vurderingen.Ikke glem at arbeid med giftige teststoffer kan være ekstremt farlig og forholdsregler, for eksempel bruk av hansker, en maske, bør alltid tas når du håndterer slike forbindelser.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flow Cytometry cellebasert analyse for å påvise antistoffer mot N-metyl-D-aspartat-reseptoren, eller dopamin-2-reseptor i Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

En murine modell av myokardiskemi-reperfusjon Injury gjennom Ligation av Left Anterior Synkende Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolering av human lymfatisk endotelceller ved Multi-parameter fluorescens-aktivert cellesortering

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Diffuse optisk spektroskopi for kvantitativ vurdering av akutt Ioniserende stråling Induced Skin Toxicity bruke en mus modell

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Primær Outcome Vurdering i en gris modell av akutt hjerteinfarkt

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Åpne trakeostomi magesyre aspire Murine modell av akutt lungeskade Resultater i Maximal Akutt-dødelige lungeskade

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 Magnetic Resonance spektroskopi: Et verktøy for måling<em&gt; I Vivo</em&gt; Mitokondriell oksidativ fosforylering Kapasitet i Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Inducing akutt lungeskade i mus ved direkte Intratrakeal lipopolysakkarid drypping

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Oral Health Assessment by Lay Personnel for Older Adults

Oral helsevurdering av lay personell for eldre voksne

Oral health is an often-undervalued contributor to overall health. The literature, however, underscores the myriad of systemic diseases influenced by oral ...