Name: assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface
Uploaded: 2020-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Ministério federal de Educação e Pesquisa (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Alemanha (Grant 031A581, subprojeto A-D)) e pela Fundação Alemã de Pesquisa (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Grupo de Treinamento de Pesquisa GRK 2338).

NOTA: O protocolo de um experimento de exposição cobre um período de três dias.
Dia 1º
1. Preparações gerais e cultivo de células
NOTA: A linha de células epitelia isopólicas a549 foi usada para experimentos de exposição. As células devem ser manuseadas em condições estéreis. Outras linhas celulares adequadas para o cultivo no ALI podem ser usadas.
<ol><li>Prepare o meio de crescimento (O Meio Mínimo Essencial (DMEM) de...

<ol>
	<li>Faber, S. C., McCullough, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+the+Looking+Glass:+In+vitro+Models+for+Inhalation+Toxicology+and+Interindividual+Variability+in+the+Airway.">Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).</li><li>De Matteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+challenges+in+occupational+lung+diseases.">Current and new challenges in occupational lung diseases.</a> European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).</li><li>LANUV Nordrhein-Westfalen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).</li><li>B&#233;rub&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Inhalation+Toxicity+and+Disease.+The+report+of+a+FRAME+workshop.">In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop.</a> Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).</li><li>Lopez, A. D., Murray, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+disease,+1990-2020.">The global burden of disease, 1990-2020.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).</li><li>Clippinger, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+approaches+for+acute+inhalation+toxicity+testing+to+address+global+regulatory+and+non-regulatory+data+requirements:+An+international+workshop+report.">Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report.</a> Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).</li><li>Agrawal, M. R., Winder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+and+Occurrence+of+LD50+Values+for+Materials+in+the+Workplace.">Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace.</a> Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).</li><li>Amtsblatt der Europ&#228;ischen Union. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verordnung+(EG)+Nr.+1907/2006+des+Europ&#228;ischen+Parlaments+und+des+Rates.">Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europ&#228;ischen Parlaments und des Rates.</a> Europ&#228;ische Union. 860, (2006).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+Organ-Level+Lung+Functions+on+a+Chip.">Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Fisher, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Human+Lung+Slices+in+Toxicology.">The Use of Human Lung Slices in Toxicology.</a> Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).</li><li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+and+Oxidative+Stress+Responses+of+an+Alveolar+Epithelial+Cell+Line+to+Airborne+Zinc+Oxide+Nanoparticles+at+the+Air-Liquid+Interface.">Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 12, (2013).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+as+an+in+vitro+exposure+method+to+assess+acute+pulmonary+toxicity+of+fine+dusts+and+nanoparticles+with+special+focus+on+the+intra-+and+inter-laboratory+reproducibility.">Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility.</a> Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).</li><li>Lacroix, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-Liquid+Interface+In+vitro+Models+for+Respiratory+Toxicology+Research.">Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).</li><li>Eskes, C., Whelan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, (2016).</li><li>Rach, J., Budde, J., M&#246;hle, N., Aufderheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+exposure+at+the+air-liquid+interface:+Evaluation+of+an+in+vitro+approach+for+simulating+inhalation+of+airborne+substances.">Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances.</a> Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).</li><li>Aufderheide, M., Halter, B., M&#246;hle, N., Hochrainer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CULTEX+RFS:+A+comprehensive+Technical+Approach+for+the+In+vitro+Exposure+of+Airway+Epithelial+Cells+to+the+Particulate+Matter+at+the+Air-Liquid+Interface.">The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 15, (2013).</li><li>Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Carterson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates:+Alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).</li><li>Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+useful+in+vitro+model+for+transport+studies+of+alveolar+epithelial+barrier.">A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier.</a> Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+403:+Acute+Inhalation+Toxicity.">Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+436:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+for+the+assessment+of+the+acute+inhalation+toxicity+of+airborne+particles.">Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles.</a> Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+exposure+system+generating+nebulized+aerosol+of+sulfur+mustard+in+comparison+to+the+standard+submerse+exposure.">A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure.</a> Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+CULTEX+radial+flow+system+for+in+vitro+investigation+of+lung+damaging+agents.">Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents.</a> Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).</li><li>Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+GS-NS0+myeloma+cells+to+pH+shifts+and+pH+perturbations.">The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+Guideline+433:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2018).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , (2018).</li></ol>

Muitos modelos de teste de toxicidade de inalação não animal foram desenvolvidos nos últimos anos, a fim de obter informações sobre o risco de inalação aguda de partículas inaginadas e reduzir e substituir experimentos animais de acordo com o princípio3R 25.
Em termos de modelos de cultura celular, a exposição de células pode ser feita em condições submersas ou no ALI. Expor células condições submersas pode afetar as propriedades físico-químicas e, p...

A inalação de partículas tóxicas no ar é uma preocupação de saúde pública, levando a uma infinidade de riscos à saúde em todo o mundo e muitos milhões de mortes anualmente1,2. As mudanças climáticas, o desenvolvimento industrial em curso e a crescente demanda por energia, produtos agrícolas e de consumo têm contribuído para o aumento de doenças pulmonares nos últimos anos3,4,5,6. O conhecimento e avaliação de substâncias inaleáveis sobre sua toxicidade aguda de inalação fornecem a base para avaliação de riscos e gerenciamento de riscos, mas essas informações ainda faltam para uma ampla gama dessas substâncias7,8. Desde 2006, a legislação química da UE REACH (Registro, Avaliação, Autorização e Restrição de Produtos Químicos) exige que os produtos já existentes e recém-introduzidos sejam submetidos a uma caracterização toxicológica, incluindo a rota de inalação antes de serem colocados no mercado. Portanto, a REACH se concentra em métodos alternativos e livres de animais, na implementação do princípio "3R" (Substituição, Refinamento e Redução de experimentos animais) e no uso de modelos in vitro adequados9. Nos últimos anos, muitos modelos diferentes e adequados de teste de toxicidade de inalação não animal (por exemplo, culturas celulares in vitro, modelos lung-on-a-chip, fatias pulmonares cortadas de precisão (PCLS)) foram desenvolvidos para avaliar a toxicidade aguda de inalação de partículas aéreas5,7,10,11. Em termos de modelos de cultura celular in vitro, as células cultivadas podem ser expostas condições submersas ou no ALI (Figura 1). No entanto, a validade dos estudos de exposição submersa limita-se à avaliação da toxicidade dos compostos aéreos, especialmente as partículas. Técnicas de exposição submersas não correspondem ao humano em situação de vida; o meio de cultura celular que cobre as células pode afetar as propriedades físico-químicas e, portanto, as propriedades tóxicas de uma substância de teste12,13. Os modelos de inalação in vitro ali permitem a exposição direta das células às substâncias de teste sem interferência do meio de cultura celular com partículas de teste, imitando assim a exposição humana com maior similaridade fisiológica e biológica do que as exposições submersas12,14.
Para processos regulatórios como o REACH, no entanto, apenas modelos animais estão disponíveis no campo da toxicologia de inalação aguda, uma vez que nenhum método in vitro alternativo foi suficientemente validado e oficialmente aceito até agora14. Para isso, os modelos de teste devem ser validados de acordo com os requisitos do Laboratório de Referência da União Europeia para Alternativas ao Teste Animal (EURL-ECVAM) sobre a validade do teste15.
Um antigo estudo de pré-validação e um estudo de validação recentemente concluído demonstraram com sucesso a área de aplicação do sistema de exposição CULTEX RFS e sua transferibilidade, estabilidade e reprodutibilidade13. Este sistema de exposição é um sistema de exposição à base de células in vitro que permite a exposição homogênea das células a gases, partículas ou atmosferas complexas (por exemplo, fumaça de cigarro) no ALI devido ao seu conceito de distribuição de aerossol radial e à condução do aerossol de teste em um fluxo contínuo sobre as células16. O módulo básico deste sistema de fluxo radial consiste no adaptador de entrada, o módulo de guia aerossol com distribuição aerossol radial, o módulo de amostragem e soquete e um módulo de travamento com uma roda de mão(Figura 2). As partículas geradas atingem as células através do adaptador de entrada e do módulo de orientação aerossol e são depositadas nas pastilhas de cultura celular, que estão localizadas nas três câmaras de exposição organizadas radialmente do módulo de amostragem. O módulo de guia de aerossol, bem como o módulo de amostragem podem ser aquecidos conectando-se a um banho de água externo17.
No quadro de ambos os estudos, as células A549 foram utilizadas para todos os experimentos de exposição. A linha celular A549 é uma linha celular epitelial imortalizada humana que é muito bem caracterizada e tem sido usada como modelo in vitro para células epiteliais alveolar tipo II em inúmeros estudos toxicológicos. As células são caracterizadas por corpos lamelares, produção de surfactante e uma série de fatores relevantes para inflamação18. Eles também mostram propriedades de células epiteliais brônquicas devido à sua produção de muco19. Além disso, eles podem ser cultivados no ALI. Embora esta linha celular seja deficiente na construção de contatos celulares, o cultivo dessas células é muito mais conveniente, menos caro e os resultados derivados dela são independentes de doadores em comparação com as células primárias20.
As células A549 foram semeadas em pastilhas de cultura celular de 6 poços (membrana PET, 4,67 cm2, tamanho 0,4 mm) com densidade de 3,0 x 105 células por inserção e cultivadas por 24 h em condições submersas. As células foram então expostas em três laboratórios independentes para limpar o ar e três doses de exposição diferentes (25, 50 e 100 μg/cm2) de 20 substâncias de teste no ALI. A dose de exposição está correlacionada com o tempo de deposição, resultando em uma taxa constante de partículas de 25 μg/cm2,50 μg/cm2 e 100 μg/cm2 nas células após 15, 30 ou 60 min, respectivamente. As partículas depositadas, no entanto, não foram lavadas após o depoimento, mas permaneceram nas células por 24 h. Os tempos de depoimento das partículas foram, portanto, 15, 30 e 60 min, mas a exposição das células durou 24 h no total. A taxa de deposição das substâncias de teste foi determinada em experimentos preliminares de acordo com métodos anteriores17.
A viabilidade celular como indicador de toxicidade foi avaliada 24h após o depoimento da partícula usando um ensaio de viabilidade celular. Foi focado especial na qualidade dos controles de ar limpo, na otimização e refinamento do protocolo de exposição, na reprodutibilidade intra e interlaboratorial e no estabelecimento de um modelo de previsão (PM). Substâncias que levaram à diminuição da viabilidade celular abaixo de 50% (PM 50%) ou 75% (PM 75%) em qualquer uma das três doses de exposição foram consideradas para exercer um risco de inalação aguda. Os resultados foram então comparados com os dados existentes no vivo (com base em pelo menos um estudo confiável de acordo com a diretriz de teste da OCDE (TG) 403 ou TG 43621,22), levando a uma concordância global de 85%, com especificidade de 83% e uma sensibilidade de 88%23.
Além da medição da viabilidade celular, outros pontos finais como liberação de citocinas, exame do lisato celular ou integridade da membrana via ensaio LDH podem ser avaliados, mas não foram necessários para o estudo de validação. Assim, o sistema de exposição (por exemplo, CULTEX RFS) foi comprovado como um sistema de triagem preditivo para a avaliação qualitativa da toxicidade da inalação aguda das partículas aéreas testadas, representando um método alternativo promissor para os testes em animais. O protocolo a seguir é recomendado para experimentos de exposição a partículas transmitidas pelo ar usando este sistema de exposição.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium and supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>FG 0415</td>
			<td>used as growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td>22320</td>
			<td>used as exposure medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S 0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10mg/mL)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>A 2710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Th. Geyer, Renningen, Germany</td>
			<td>L 0180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 2143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cups</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3516</td>
			<td>6&#173;-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell cell culture inserts</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3450</td>
			<td>24mm inserts; 6-&#173;well plates; 0.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASYton</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Air (DIN EN 12021)</td>
			<td>Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td>2290152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab155902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments + equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cell Counter</td>
			<td>Sch&#228;rfe System GmbH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation thermostat</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline RE 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX HyP - Hydraulic Press</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX insert sleeve</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (large)</td>
			<td>Munktell &#38; Filtrak GmbH, Sachsen, Germany</td>
			<td>LP-050</td>
			<td>Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency &#62; 99,999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (small)</td>
			<td>Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany</td>
			<td>9933-05-DQ</td>
			<td>Balston disposable filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pump</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td>Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser</td>
			<td>digital peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader Infinite M200 Pro</td>
			<td>Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vakuum pump</td>
			<td>KNF, Freiburg, Germany</td>
			<td>N86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#246;gtlin mass flow controller 0,2-10 l/min</td>
			<td>TrigasFI GmbH</td>
			<td>V&#246;gtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline Staredition RE 104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface

Aqui, apresentamos um sistema de exposição in vitro modular especialmente projetado que permite a exposição homogênea de células pulmonares humanas cultivadas no ALI a gases, partículas ou atmosferas complexas (por exemplo, fumaça de cigarro), fornecendo assim fisiofilógico realista exposição da superfície apical da região aleolar humana ao ar. Em contraste com modelos de exposição sequencial com orientação linear de aerossol, o design modular do sistema de fluxo radial atende a todos os requisitos para a geração contínua e o transporte da atmosfera de teste para as células, distribuição homogênea e deposição de as partículas e a remoção contínua da atmosfera. Este método de exposição é projetado principalmente para a exposição de células a partículas aéreas, mas pode ser adaptado à exposição de aerossóis líquidos e gases altamente tóxicos e agressivos, dependendo do método de geração de aerossóis e do material dos módulos de exposição .
Dentro do quadro de um estudo de validação recém-concluído, este sistema de exposição foi comprovado como um método de triagem transferível, reprodutível e preditivo para a avaliação qualitativa da citotoxicidade pulmonar aguda das partículas transmitidas pelo ar, assim potencialmente reduzindo ou substituindo experimentos animais que normalmente forneceriam essa avaliação toxicológica.

O CULTEX RFS é um sistema de exposição modular especialmente projetado in vitro que permite a exposição direta e homogênea das células no ALI. Dentro de um antigo estudo de pré-validação, a aplicabilidade geral desse sistema de exposição e sua transferibilidade, estabilidade e reprodutibilidade foram demonstradas com sucesso. Em um recente projeto de pesquisa financiado pelo Ministério da Educação e Pesquisa da Alemanha, o sistema de exposição foi validado com sucesso e e...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Apresentamos um sistema robusto, transferível e preditivo de exposição in vitro para a triagem e monitoramento de partículas transmitidas pelo ar sobre sua citotoxicidade pulmonar aguda, expondo células pulmonares humanas cultivadas na interface ar-líquido (ALI).

Avaliação da toxicidade da inalação aguda de partículas transmitidas por expor células pulmonares humanas cultivadas na Interface Ar-Líquido

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

A triagem de partículas transmitidas pelo ar sobre a citotoxicidade pulmonar aguda expondo células pulmonares humanas cultivadas no ALI usando este sistema de exposição in vitro pode ajudar a reduzir experimentos em animais. A principal vantagem deste sistema de exposição é o conceito de distribuição de aerossol radial que leva a uma distribuição homogênea e à posição das partículas sobre as células. Antes de semear as células, adicione 2,5 mililitros de meio de crescimento temperado a cada poço de uma placa de seis poços.Coloque as pastilhas de cultura celular sem células cuidadosamente dentro dos poços e adicione um mililitro de meio de crescimento a cada inserção de cultura celular. Incubar as placas por 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a experimentação das células, diluir 100 microliters da suspensão da cultura celular em um copo cheio de 10 mililitros de solução isotônica.Incline o copo lentamente sem tremer. Em um contador celular, determine o número de células viáveis por mililitro e viabilidade celular com base nos parâmetros de medição específicos da célula das células A549. Após o tempero da placa, aspire o meio dentro das inserções da cultura celular e semente um mililitro de células A549 com uma densidade de três vezes 10 para as quintas células por mililitros em cada inserção de cultura celular.Distribua a suspensão da célula por balanço suave e incubar por 24 horas. Defina o tempo de pressão através do controle de tempo na parte frontal da prensa. Abra o fornecimento de ar comprimido na válvula de ar comprimido.Usando o regulador de pressão na parte frontal da prensa, coloque a pressão de ar comprimido em aproximadamente duas barras. Puxe a gaveta, pressione o botão Pressione e leia a pressão no interruptor de pressão digital. Encha o recipiente da substância com uma pequena quantidade da substância de ensaio.Insira o êmbolo no recipiente da substância e gire-o ligeiramente para frente e para trás para distribuir uniformemente o pó no recipiente. Coloque o recipiente de substância, com o êmbolo, na gaveta e pressione o botão Pressione. Abra a gaveta e remova o êmbolo.Um passo crítico é a prensagem de substâncias de teste que devem ser especificamente comprimidas a um bolo de pó dentro do recipiente de substâncias, a fim de permitir exposições estáveis de partículas. Remova o adaptador de entrada e o refletor de condensado do módulo norteador do aerossol. Feche os três furos de alimentação de aerossol no módulo norteador de aerossol com plugues e as conexões médias de alimentação no módulo de amostragem com retalhos falsos.Conecte as linhas de vácuo com o conector do tubo do módulo norteador do aerossol. Use a roda de mão para fechar o módulo e medir o valor dos controladores de fluxo. Alguns minutos após o fechamento, os valores diminuem abaixo de cinco mililitros por minuto.Inicie o software do gerador de aerossol. Se o raspador de substância não estiver na posição mais baixa, pressione o modo homing do botão. Coloque o recipiente de substância com o material de ensaio prensado de cabeça para baixo sobre o raspador de substância.Certifique-se de que o vidro do recipiente de substância está de frente para a frente. Coloque a placa de bloqueio na ranhura sobre o recipiente da substância e aperte o parafuso preto. Altere os valores para Alimentação e Rotação para as configurações desejadas.Use as setas para baixo para empurrar para baixo o slide com o recipiente de substância até que o raspador de substância esteja perto da substância prensada. Abra a fonte de ar comprimido para o gerador de aerossol com um toque do controlador de fluxo de massa e inicie a geração de aerossol clicando no botão Iniciar. Defina a taxa de alimentação para 15 a 20 milímetros por hora para evitar longos tempos de espera.Controle a geração correta de partículas observando a nuvem de poeira fina com uma pequena lanterna posicionada por baixo atrás do tubo de vidro do elutriador. Inicie a oferta média com meio de exposição pré-aquecido e preencha os módulos de amostragem até que os tubos de aduques estejam cobertos enquanto o módulo estiver aberto. Insira inserções de cultura de células cegas no módulo de exposição, bombeie o meio de exposição para baixo até que os tubos de aposição estejam cobertos com meio e o lado inferior das pastilhas esteja em contato com o meio.Inicie o gerador de aerossol, feche o módulo de exposição e conecte o módulo de exposição à saída do módulo de exposição do gerador de aerossol. 30 minutos após o tempo de chumbo, sele a saída do módulo de exposição do elutriador com um plugue de borracha e remova as pastilhas cegas. Reabastecer o meio de exposição até que os tubos de adus estejam cobertos com meio.Remova as pastilhas de cultura celular das seis placas do poço com a ajuda de pinças. Despeje o meio de crescimento cuidadosamente da cultura celular, derrubando as pastilhas e use uma pipeta para aspirar e descartar o líquido residual. Coloque as pastilhas nas câmaras de exposição dos módulos de exposição e ar limpo.Feche os módulos e inicie os experimentos de exposição conectando o módulo de exposição à saída do módulo de exposição do gerador de aerossol e ao módulo de ar limpo ao fornecimento de gás transportador simultaneamente. Após a conclusão do experimento, desconecte os módulos de exposição e ar limpo e sele a saída do módulo de exposição. Pare a fonte de ar comprimido e o gerador de aerossol clicando no botão Parar.Abra o módulo de exposição e ar limpo e use pinças para transferir as pastilhas de cultura celular para as seis placas de poço preparadas pós-incubação. Incubar as seis placas do poço, bem como as pastilhas de cultura celular não expostas, por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono na interface líquida de ar. 24 horas após a exposição, insira as pastilhas de cultura celular nas novas seis placas de poço preparadas.Adicione um mililitro da solução WST1 preparada recentemente para cada inserção de cultura celular. Balance as placas cuidadosamente para distribuir a solução de forma homogênea nas células. Incubar as seis placas do poço com as pastilhas de cultura celular por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Depois disso, transfira 100 microliters do supernatante em triplicados de cada placa de seis poços para uma placa de 96 poços. Usando um leitor de microplaca, meça a absorvância em 450 nanômetros com um comprimento de onda de referência de 650 nanômetros. O CULTEX RFS é um sistema de exposição in vitro modular especialmente projetado que permite a exposição direta e homogênea das células às partículas transmitidas pelo ar na interface líquida do ar.A exposição das células ao ar limpo não leva a nenhuma diminuição da viabilidade celular ao longo do tempo. O sistema de exposição foi validado com sucesso e estabelecido como um modelo de previsão para os riscos agudos de inalação dos compostos testados. Exposição de células A549 a diferentes substâncias de teste que não apresentaram toxicidade, média ou forte.Por favor, certifique-se de manter estritamente os períodos de tempo que são os tempos de incubação, o tempo de chumbo da geração de partículas e os tempos de deposição de partículas. Este método de exposição é projetado principalmente para a exposição de partículas das células, mas pode ser estendido à exposição de aerossóis líquidos e gases por meio da adaptação do método de geração de aerossol. Este método de triagem permite a avaliação qualitativa de partículas inaláveis em relação à toxicidade aguda da inalação in vitro, reduzindo assim os testes em animais que normalmente forneceriam essa avaliação toxicológica.Não se esqueça que trabalhar com substâncias tóxicas de teste pode ser extremamente perigoso e precauções, como usar luvas, uma máscara, devem ser sempre tomadas ao manusear tais compostos.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Isolamento de rato células epiteliais respiratórias e exposição à fumaça de cigarro Experimental da Air interface líquido

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Medicina

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Citometria de Fluxo Ensaio Celular para detectar anticorpos em N-metil-D-aspartato ou dopamina-2 Receptor em Soro Humano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Um modelo murino de isquemia-reperfusão, através da ligadura da artéria Descendente Anterior Esquerda

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolamento de linfático humano endotelial por multi-parâmetro activadas por fluorescência celular

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Difusa espectroscopia óptica para a avaliação quantitativa da Aguda de Radiação Ionizante toxicidade cutânea induzida pelo uso de um modelo de rato

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Avaliação do resultado principal em um modelo suíno de Infarto Agudo do Miocárdio

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Abrir traqueostomia ácido gástrico aspiração Modelo murino de lesão pulmonar aguda Resultados em Maximal aguda não-letal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fósforo-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: uma ferramenta para medir<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacidade mitocondrial fosforilação oxidativo no músculo esquelético humano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Induzindo lesão pulmonar aguda em camundongos por instilação de lipopolissacárido intratraqueal direto

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Oral Health Assessment by Lay Personnel for Older Adults

Avaliação em Saúde Bucal por Leigo para Idosos

Oral health is an often-undervalued contributor to overall health. The literature, however, underscores the myriad of systemic diseases influenced by oral ...