Name: assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface
Uploaded: 2020-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

Эта работа была поддержана Федеральным министерством образования и исследований Германии (Bundesministerium f'r Bildung und Forschung, BMBF, Германия (Grant 031A581, подпроект A-D)) и Немецким исследовательским фондом (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Исследовательская учебная группа GRK 2338).

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол одного эксперимента воздействия охватывает три дня.
День 1
1. Общие препараты и культивирование клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Аденокарцинома человека аденокарциномы линии эпителиальной клетки A549 был использован для воздействия эк...

<ol>
	<li>Faber, S. C., McCullough, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+the+Looking+Glass:+In+vitro+Models+for+Inhalation+Toxicology+and+Interindividual+Variability+in+the+Airway.">Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).</li><li>De Matteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+challenges+in+occupational+lung+diseases.">Current and new challenges in occupational lung diseases.</a> European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).</li><li>LANUV Nordrhein-Westfalen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).</li><li>B&#233;rub&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Inhalation+Toxicity+and+Disease.+The+report+of+a+FRAME+workshop.">In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop.</a> Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).</li><li>Lopez, A. D., Murray, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+disease,+1990-2020.">The global burden of disease, 1990-2020.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).</li><li>Clippinger, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+approaches+for+acute+inhalation+toxicity+testing+to+address+global+regulatory+and+non-regulatory+data+requirements:+An+international+workshop+report.">Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report.</a> Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).</li><li>Agrawal, M. R., Winder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+and+Occurrence+of+LD50+Values+for+Materials+in+the+Workplace.">Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace.</a> Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).</li><li>Amtsblatt der Europ&#228;ischen Union. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verordnung+(EG)+Nr.+1907/2006+des+Europ&#228;ischen+Parlaments+und+des+Rates.">Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europ&#228;ischen Parlaments und des Rates.</a> Europ&#228;ische Union. 860, (2006).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+Organ-Level+Lung+Functions+on+a+Chip.">Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Fisher, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Human+Lung+Slices+in+Toxicology.">The Use of Human Lung Slices in Toxicology.</a> Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).</li><li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+and+Oxidative+Stress+Responses+of+an+Alveolar+Epithelial+Cell+Line+to+Airborne+Zinc+Oxide+Nanoparticles+at+the+Air-Liquid+Interface.">Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 12, (2013).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+as+an+in+vitro+exposure+method+to+assess+acute+pulmonary+toxicity+of+fine+dusts+and+nanoparticles+with+special+focus+on+the+intra-+and+inter-laboratory+reproducibility.">Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility.</a> Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).</li><li>Lacroix, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-Liquid+Interface+In+vitro+Models+for+Respiratory+Toxicology+Research.">Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).</li><li>Eskes, C., Whelan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, (2016).</li><li>Rach, J., Budde, J., M&#246;hle, N., Aufderheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+exposure+at+the+air-liquid+interface:+Evaluation+of+an+in+vitro+approach+for+simulating+inhalation+of+airborne+substances.">Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances.</a> Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).</li><li>Aufderheide, M., Halter, B., M&#246;hle, N., Hochrainer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CULTEX+RFS:+A+comprehensive+Technical+Approach+for+the+In+vitro+Exposure+of+Airway+Epithelial+Cells+to+the+Particulate+Matter+at+the+Air-Liquid+Interface.">The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 15, (2013).</li><li>Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Carterson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates:+Alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).</li><li>Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+useful+in+vitro+model+for+transport+studies+of+alveolar+epithelial+barrier.">A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier.</a> Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+403:+Acute+Inhalation+Toxicity.">Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+436:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+for+the+assessment+of+the+acute+inhalation+toxicity+of+airborne+particles.">Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles.</a> Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+exposure+system+generating+nebulized+aerosol+of+sulfur+mustard+in+comparison+to+the+standard+submerse+exposure.">A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure.</a> Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+CULTEX+radial+flow+system+for+in+vitro+investigation+of+lung+damaging+agents.">Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents.</a> Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).</li><li>Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+GS-NS0+myeloma+cells+to+pH+shifts+and+pH+perturbations.">The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+Guideline+433:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2018).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , (2018).</li></ol>

Многие неживотные модели тестирования токсичности ингаляции были разработаны в последние годы для того, чтобы получить информацию об острой опасности ингаляции ингаляционных частиц и уменьшить и заменить эксперименты на животных в соответствии с принципом 3R25.
<p class="jove...

Вдыхание токсичных частиц воздушно-капельным путем является проблемой общественного здравоохранения, что приводит к множеству рисков для здоровья во всем мире и многим миллионам смертей ежегодно1,2. Изменение климата, продолжающееся промышленное развитие и растущий спрос на энергию, сельскохозяйственную и потребительские товары способствовали росту легочных заболеваний за последние годы3,4,5,6. Знания и оценка ингаляционных веществ относительно их острой ингаляционной токсичности являются основой для оценки опасности и управления рисками, но эта информация по-прежнему отсутствует для широкого спектра этих веществ7,8. С 2006 года химическое законодательство ЕС REACH (регистрация, оценка, авторизация и ограничение химических веществ) требует, чтобы уже существующие и вновь введенные продукты подвергали токсикологическую характеристику, включая ингаляционный маршрут перед тем, как быть выставленными на рынок. Поэтому REACH фокусируется на альтернативных и бесживотных методах, реализации принципа «3R» (Замена, уточнение и сокращение экспериментов на животных) и использовании соответствующих моделей in vitro9. В последние годы, много различных и адекватных неживотных ингаляционной токсичности модели тестирования (например, в пробирке клеток культур, легких на чипе модели, точность сократить легких ломтики (PCLS)) были разработаны для того, чтобы оценить острую токсичность ингаляции частиц в воздухе5,7,10,11. С точки зрения моделей культуры клеток in vitro, культивируемые клетки могут подвергаться воздействию в условиях погружения или в АЛИ(рисунок 1). Однако достоверность исследований, связанных с воздействием на воду, ограничена в том, что касается оценки токсичности соединений, передающихся воздушно-капельным путем, особенно частиц. Методы воздействия подводных человек не соответствуют ситуации в живо человека; среда культуры клетки покрывая клетки может повлиять на физико-химические свойства и таким образом, токсические свойства испытательного вещества12,13. Модели ингаляции ALI in vitro позволяют прямое воздействие клеток на испытательные вещества без вмешательства среды клеточной культуры с испытательными частицами, таким образом, имитируя воздействие человека с более высоким физиологическим и биологическим сходством, чем погруженные воздействия12,14.
Для регулирующих процессов, таких как REACH, однако, только животные модели доступны в области острой ингаляции токсикологии, так как никаких альтернативных методов in vitro были достаточно проверены и официально приняты до сих пор14. Для этого тестовые модели должны быть проверены в соответствии с требованиями Справочной лаборатории Европейского союза по альтернативам тестированию на животных (EURL-ECVAM) в отношении действия теста15.
Бывшее предварительное исследование проверки и недавно завершенное исследование проверки успешно продемонстрировали область применения системы выдержки CULTEX RFS и ее переносимость, стабильность и воспроизводимость13. Эта система воздействия является системой воздействия на основе клеток in vitro, которая позволяет однородное воздействие клеток на газы, частицы или сложные атмосферы (например, сигаретный дым) в ALI из-за своей концепции распределения радиальных аэрозолей и проведения испытательного аэрозоля в непрерывном потоке над клетками16. Основной модуль этой системы радиального потока состоит из адаптера входе, аэрозоля направляющий модуль с распределением радиального аэрозоля, модуля выборки и розетки, и блокирующего модуля с ручным колесом(рисунок 2). Генерируемые частицы достигают клеток через адаптер ввода и аэрозольный направляющий модуль и откладываются на вставках клеточной культуры, которые расположены в трех радиографически расположенных камерах модуля выборки. Аэрозольный направляющий модуль, а также модуль отбора проб можно нагревать, подключившись к внешней водяной бане17.
В рамках обоих исследований, A549 клетки были использованы для всех экспериментов воздействия. Клеточная линия A549 является увековеченной эпителиальной линией клеток человека, которая очень хорошо характеризуется и используется в качестве модели in vitro для альвеолярных эпителиальных клеток II типа в многочисленных токсикологических исследованиях. Клетки характеризуются ламеллярными телами, производством сурфактанта и рядом воспаления-соответствующих факторов18. Они также показывают свойства бронхиальных эпителиальных клеток из-за их производства слизи19. Кроме того, они могут быть культивированы в ALI. Хотя эта клеточная линия не хватает в создании клеток клеток контактов, выращивание этих клеток является гораздо более удобным, дешевле дорогих и результаты, полученные из них являются донорами-независимыми по сравнению с первичными клетками20.
A549 клетки были посеяны в 6-колодцклеточной культуры вставки (ПЭТ мембрана, 4,67 см2,размер пор 0,4 мм) с плотностью 3,0 х 105 клеток на вставку и культивируется для 24 ч погруженных в условиях. Затем клетки были выставлены в трех независимых лабораториях для очистки воздуха и трех различных доз воздействия (25, 50 и 100 мкг/см2) 20 испытательных веществ в АЛИ. Доза воздействия коррелирует с временем осаждения, что приводит к постоянной скорости частиц 25 мкг/см2,50 мкг/см2 и 100 мкг/см2 на клетки после 15, 30 или 60 мин, соответственно. Отложенные частицы, однако, не были смыты после осаждения, а оставались на клетках в течение 24 ч. Таким образом, время осаждения частиц составляло 15, 30 и 60 мин, но воздействие клеток длилось в общей сложности 24 ч. Скорость осаждения испытательных веществ была определена в предварительных экспериментах по предыдущим методам17.
Жизнеспособность клеток как индикатор токсичности оценивалась 24 ч после осаждения частиц с помощью анализа жизнеспособности клеток. Особое внимание было уделено качеству контроля за чистым воздухом, оптимизации и уточнению протокола воздействия, внутри- и межлабораторной воспроизводимости и созданию модели прогнозирования (ТЧ). Вещества, которые привели к снижению жизнеспособности клеток ниже 50% (PM 50%) или 75% (PM 75%) в любой из трех доз воздействия считалось, что оказывают острую опасность ингаляции. Результаты были затем по сравнению с существующими данными in vivo (на основе по крайней мере одного надежного исследования в соответствии с руководящим принципом испытаний ОЭСР (TG) 403 или TG 43621,22),что привело к общему согласованию 85%, со специфичностью 83% и чувствительностью 88%23.
Помимо измерения жизнеспособности клеток, другие конечные точки, такие как высвобождение цитокинов, изучение клеточного лизата или мембранной целостности с помощью анализа LDH, могут быть оценены, но не были необходимы для исследования проверки. Таким образом, система воздействия (например, CULTEX RFS) была доказана как система прогностического скрининга для качественной оценки острой ингаляционной токсичности исследуемых частиц, передающихся воздушно-капельным путем, что представляет собой перспективный альтернативный метод тестирования на животных. Следующий протокол рекомендуется для экспериментов воздействия на частицы в воздухе с помощью этой системы воздействия.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium and supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>FG 0415</td>
			<td>used as growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td>22320</td>
			<td>used as exposure medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S 0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10mg/mL)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>A 2710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Th. Geyer, Renningen, Germany</td>
			<td>L 0180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 2143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cups</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3516</td>
			<td>6&#173;-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell cell culture inserts</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3450</td>
			<td>24mm inserts; 6-&#173;well plates; 0.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASYton</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Air (DIN EN 12021)</td>
			<td>Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td>2290152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab155902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments + equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cell Counter</td>
			<td>Sch&#228;rfe System GmbH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation thermostat</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline RE 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX HyP - Hydraulic Press</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX insert sleeve</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (large)</td>
			<td>Munktell &#38; Filtrak GmbH, Sachsen, Germany</td>
			<td>LP-050</td>
			<td>Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency &#62; 99,999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (small)</td>
			<td>Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany</td>
			<td>9933-05-DQ</td>
			<td>Balston disposable filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pump</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td>Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser</td>
			<td>digital peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader Infinite M200 Pro</td>
			<td>Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vakuum pump</td>
			<td>KNF, Freiburg, Germany</td>
			<td>N86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#246;gtlin mass flow controller 0,2-10 l/min</td>
			<td>TrigasFI GmbH</td>
			<td>V&#246;gtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline Staredition RE 104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface

Здесь мы представляем специально разработанную модульную систему воздействия in vitro, которая позволяет однородное воздействие культивируемых клеток легких человека в АЛИ на газы, частицы или сложные атмосферы (например, сигаретный дым), обеспечивая тем самым реалистичные физиологические воздействие актической поверхности альвеолярной области человека в воздух. В отличие от последовательных моделей воздействия с линейным аэрозолем, модульная конструкция системы радиального потока отвечает всем требованиям для непрерывного генерации и транспортировки испытательной атмосферы в клетки, однородного распределения и осаждения частиц и непрерывное удаление атмосферы. Этот метод воздействия в первую очередь предназначен для воздействия клеток на частицы, передаваемые воздушно-капельным путем, но может быть адаптирован к воздействию жидких аэрозолей и высокотоксичных и агрессивных газов в зависимости от метода генерации аэрозолей и материала модулей воздействия .
В рамках недавно завершенного исследования валидации эта система воздействия была доказана как переносимый, воспроизводимый и прогностический метод скрининга для качественной оценки острой легочной цитотоксичности частиц, передаваемых воздушно-капельным путем, тем самым потенциальное сокращение или замена экспериментов на животных, которые, как правило, обеспечивают эту токсикологические оценки.

CULTEX RFS является специально разработанной модульной системой воздействия in vitro, которая обеспечивает прямое и однородное воздействие клеток на ALI. В рамках бывшего предварительного исследования были успешно продемонстрирована общая применимость этой системы воздейс?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Мы представляем надежную, переносимую и прогностическую систему воздействия in vitro для скрининга и мониторинга частиц, передающихся воздушно-капельным путем, относительно их острой легочной цитотоксичности, подвергая культивируемые клетки легких человека в воздушно-жидком интерфейсе (АЛИ).

Оценка острой ингаляционной токсичности воздушно-капельных частиц путем разоблачения культивируемых клеток легких человека на воздушно-жидком интерфейсе

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Скрининг частиц, передающихся воздушно-капельным путем, касающихся острой цитотоксичности легких, путем разоблачения культивируемых клеток легких человека в АЛИ с помощью этой системы воздействия in vitro может помочь уменьшить эксперименты на животных. Основным преимуществом этой системы воздействия является концепция распределения радиальных аэрозолей, ведущая к однородной распределению и положению частиц на клетках. Перед посевом клеток добавьте 2,5 миллилитров закаленной среды роста к каждому хорошо из шести хорошо пластины.Поместите вставки клеточной культуры без клеток тщательно внутри колодцев и добавьте один миллилитр среды роста к каждой вставки культуры клеток. Инкубировать пластины в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия и 5%углекислого газа. После трипсинизации клеток разбавьте 100 микролитров подвески клеточной культуры в чашку, наполненную 10 миллилитров изотонического раствора.Наклоните чашку медленно, не встряхивая. На клеточном счетчике определите количество жизнеспособных клеток на миллилитр и жизнеспособность клеток на основе конкретных параметров измерения клеток A549. После закалки пластины, аспирировать среды в клеточной культуры вставки и семена один миллилитр A549 клеток с плотностью от трех раз от 10 до пятой клетки на миллилитр в каждой клетке культуры вставки.Распределите подвеску клетки нежным качания и инкубации в течение 24 часов. Установите время нажатия с помощью контроля времени на передней стороне пресса. Откройте сжатый воздух на сжатом воздушном клапане.Используя регулятор давления на передней стороне пресса, установите давление сжатого воздуха примерно до двух бар. Вытащите ящик, нажмите кнопку «Нажмите» и прочитайте нажатие на выключатель цифрового давления. Заполните контейнер вещества небольшим количеством испытательного вещества.Вставьте поршень в контейнер вещества и поверните его немного вперед и назад, чтобы равномерно распределить порошок в контейнере. Поместите контейнер с веществом с поршенем в ящик и нажмите кнопку «Нажмите». Откройте ящик и удалите поршень.Важным шагом является нажатие испытательных веществ, которые должны быть специально сжаты к порошковому торту в контейнере вещества, с тем чтобы обеспечить стабильное воздействие твердых частиц. Удалите адаптер в входе и конденсатный отражатель из аэрозольного направляющий модуль. Закройте три аэрозольные кормовые скважины в аэрозольный направляющий модуль вилками и средними соединениями питания в модуле отбора проб манекенами.Соедините вакуумные линии с разъемом трубки аэрозольного направляющий модуль. Используйте ручное колесо, чтобы закрыть модуль и измерить значение контроллеров потока. Через пару минут после закрытия значения снижаются ниже пяти миллилитров в минуту.Запустите программное обеспечение аэрозольного генератора. Если скребок вещества находится не в самом низком положении, нажмите кнопку Режим самонаведения. Поместите контейнер вещества с прессованным испытательным материалом вверх дном над веществом скребок.Убедитесь, что стекло контейнера вещества выходит на фронт. Поместите запирая пластину в слот над контейнером вещества и затяните черный винт. Измените значения для Feed и Rotation на нужные настройки.Используйте нисходящие стрелки, чтобы нажать вниз слайд с веществом контейнера, пока вещество скребок находится рядом с нажатой вещества. Откройте подачу сжатого воздуха для аэрозольного генератора одним нажатием контроллера массового потока и начните генерацию аэрозолей, нажав на кнопку «Пуск». Установите скорость подачи до 15 до 20 миллиметров в час, чтобы избежать длительного времени ожидания.Контролйте правильное генерацию частиц, наблюдая за мелким облаком пыли с помощью небольшого фонарика, расположенного снизу за стеклянной трубкой элютриатора. Запустите средний запас с разогретой средой экспозиции и заполните модули выборки до тех пор, пока не будут покрыты трубы, пока модуль открыт. Вставьте слепые клетки культуры вставки в модуль экспозиции, насос воздействия среды вниз до тех пор, пока даунпайпы покрыты средой и нижней стороне вставки находятся в контакте со средой.Запустите аэрозольный генератор, закройте модуль экспозиции и подключите модуль экспозиции к выходу модуля экспозиции аэрозольного генератора. Через 30 минут после времени ведения, печать экспозиции модуль розетки элютриатора с резиновой вилкой и удалить слепые вставки. Пополнить среду экспозиции до тех пор, пока выхлопные трубы не будут покрыты средой.Удалите вставки клеточной культуры из шести пластин хорошо с помощью пинцета. Налейте среды роста тщательно из клеточной культуры вставляет покинуть путем свержения вставки и использовать пипетку, чтобы аспирировать и отказаться от остаточной жидкости. Поместите вставки в камеры экспозиции как экспозиции, так и модулей чистого воздуха.Закройте модули и начните эксперименты по экспозиции, подключив модуль экспозиции к выходу модуля экспозиции аэрозольного генератора и модуля чистого воздуха к газоснабжения перевозчика одновременно. После завершения эксперимента отключите модули экспозиции и чистого воздуха и запечатав розетку модуля экспозиции. Остановите подачу сжатого воздуха и аэрозольный генератор, нажав на кнопку Stop.Откройте экспозицию и модуль чистого воздуха и используйте пинцет для передачи вставки культуры клеток в подготовленные после инкубации шесть пластин хорошо. Инкубировать шесть пластин хорошо, а также неэкспонированных клеток культуры вставки, в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в воздухе жидкого интерфейса. Через 24 часа после экспозиции вставьте вставки культуры клеток в новые подготовленные шесть пластин хорошо.Добавьте один миллилитр свежего готового решения WST1 в каждую вставку культуры клеток. Тщательно раскачивайте пластины, чтобы равномерно распределить раствор по клеткам. Инкубировать шесть пластин хорошо с клеточной культуры вставки в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.После этого перенесите 100 микролитров супернатанта в три пластины с каждой шести хорошо пластины на пластину 96 хорошо. Используя считыватель микропластиц, измерьте абсорбанс на 450 нанометров со эталонной длиной волны 650 нанометров. CULTEX RFS является специально разработанной модульной системой воздействия in vitro, которая позволяет прямое и однородное воздействие клеток на частицы воздуха в воздушном жидком интерфейсе.Воздействие клеток на чистый воздух не приводит к снижению жизнеспособности клеток с течением времени. Система воздействия была успешно проверена и создана в качестве модели прогнозирования острых ингаляционных опасностей испытанных соединений. Воздействие клеток A549 на различные испытательные вещества, которые не проявляли никакой, средней или сильной токсичности.Пожалуйста, убедитесь, что вы строго сохранить временные рамки, которые инкубации раз, время времени времени генерации твердых частиц, и время осаждения твердых частиц. Этот метод воздействия в первую очередь предназначен для воздействия твердых частиц клеток, но может быть распространен на воздействие жидких аэрозолей и газов путем адаптации метода генерации аэрозолей. Этот метод скрининга позволяет качественно оценить ингаляционные частицы в отношении острой ингаляционной токсичности in vitro, тем самым уменьшая тестирование на животных, которое обычно дает эту токсикологическую оценку.Не забывайте, что работа с токсичными испытательными веществами может быть чрезвычайно опасной и меры предосторожности, такие как ношение перчаток, маски, всегда должны быть приняты при обращении с такими соединениями.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Выделение мышью Респираторные эпителиальных клеток и воздействие экспериментальный сигаретный дым в воздухе жидкость

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Высокая пропускная проточной цитометрии Клеточная Анализ для выявления антител к N-метил-D-аспартат рецепторов или допамин-2 рецепторов в сыворотке человека

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Мышиной модели ишемии миокарда-реперфузии через перевязки левой передней нисходящей артерии

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Выделение человека эндотелиальных клеток лимфатической от нескольких параметров флуоресценции активирован сортировки клеток

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Диффузный оптической спектроскопии для количественной оценки острой токсичности ионизирующей радиации, индуцированный кожи с помощью модели мыши

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Первичная оценка Результат в Pig модели острого инфаркта миокарда

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Открыть Трахеостомия Желудочный кислота Аспирация мышиной модели острого повреждения легких Результаты в Максимальный Острый несмертельного повреждения легких

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Фосфор-31 спектроскопии магнитного резонанса: Прибор для измерения<em&gt; В Vivo</em&gt; Митохондриальной окислительное фосфорилирование потенциала в скелетных мышцах человека

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Индуцирование острая травма легких у мышей путем прямого внутричехального липополисахарида интиллация

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Oral Health Assessment by Lay Personnel for Older Adults

Оценка здоровья полости рта lay персоналом для пожилых людей

Oral health is an often-undervalued contributor to overall health. The literature, however, underscores the myriad of systemic diseases influenced by oral ...