Name: assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface
Uploaded: 2020-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (Bundesministerium f'r Bildung und Forschung, BMBF, Alemania (Grant 031A581, subproyecto A-D)) y por la Fundación Alemana de Investigación (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Grupo de Formación en Investigación GRK 2338).

NOTA: El protocolo de un experimento de exposición abarca un período de tres días.
Día 1
1. Preparaciones generales y cultivo de células
NOTA: La línea celular epitelial del adenocarcinoma pulmonar humano A549 se utilizó para experimentos de exposición. Las células deben manipularse en condiciones estériles. Se pueden utilizar otras líneas celulares aptas para el cultivo en la ALI.
<ol><li>Preparar el medio de crecimiento (Me...

<ol>
	<li>Faber, S. C., McCullough, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+the+Looking+Glass:+In+vitro+Models+for+Inhalation+Toxicology+and+Interindividual+Variability+in+the+Airway.">Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).</li><li>De Matteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+challenges+in+occupational+lung+diseases.">Current and new challenges in occupational lung diseases.</a> European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).</li><li>LANUV Nordrhein-Westfalen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).</li><li>B&#233;rub&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Inhalation+Toxicity+and+Disease.+The+report+of+a+FRAME+workshop.">In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop.</a> Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).</li><li>Lopez, A. D., Murray, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+disease,+1990-2020.">The global burden of disease, 1990-2020.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).</li><li>Clippinger, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+approaches+for+acute+inhalation+toxicity+testing+to+address+global+regulatory+and+non-regulatory+data+requirements:+An+international+workshop+report.">Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report.</a> Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).</li><li>Agrawal, M. 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J., Birch, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+GS-NS0+myeloma+cells+to+pH+shifts+and+pH+perturbations.">The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+Guideline+433:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2018).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , (2018).</li></ol>

En los últimos años se han desarrollado muchos modelos de pruebas de toxicidad por inhalación no animal con el fin de obtener información sobre el riesgo agudo de inhalación de partículas inhalables y para reducir y sustituir los experimentos con animales de acuerdo con el principio 3R25.
En términos de modelos de cultivo celular, la exposición de células se puede hacer en condiciones sumergidas o en la ALI. La exposición de células en condiciones sumergidas ...

La inhalación de partículas tóxicas en el aire es un problema de salud pública, lo que lleva a una multitud de riesgos para la salud en todo el mundo y muchos millones de muertes al año1,2. El cambio climático, el desarrollo industrial en curso y la creciente demanda de productos energéticos, agrícolas y de consumo han contribuido al aumento de las enfermedades pulmonares en los últimos años3,4,5,6. El conocimiento y la evaluación de sustancias inhalables en relación con su toxicidad aguda por inhalación proporcionan la base para la evaluación del peligro y la gestión del riesgo, pero esta información sigue faltando para una amplia gama de estas sustancias7,8. Desde 2006, la legislación química de la UE REACH (Registro, Evaluación, Autorización y Restricción de Productos Químicos) exige que los productos ya existentes y de nueva introducción se sometan a una caracterización toxicológica, incluida la vía de inhalación antes de su comercialización. Por lo tanto, REACH se centra en métodos alternativos y libres de animales, la aplicación del principio "3R" (reemplazo, refinamiento y reducción de experimentos con animales) y el uso de modelos in vitro apropiados9. En los últimos años, se han desarrollado muchos modelos de prueba de toxicidad por inhalación no animal diferentes y adecuados (por ejemplo, cultivos de células in vitro, modelos de pulmón en un chip, rodajas pulmonares cortadas de precisión (PCLS)) con el fin de evaluar la toxicidad aguda por inhalación de partículas en el aire5,7,10,11. En términos de modelos de cultivo celular in vitro, las células cultivadas pueden exponerse en condiciones sumergidas o en la ALI(Figura 1). Sin embargo, la validez de los estudios de exposición sumergida es limitada con respecto a la evaluación de la toxicidad de los compuestos en el aire, especialmente las partículas. Las técnicas de exposición sumergida no se corresponden con la situación humana in vivo; el medio de cultivo celular que cubre las células puede afectar a las propiedades fisicoquímicas y, por lo tanto, las propiedades tóxicas de una sustancia de ensayo12,13. Los modelos de inhalación in vitro DE ALI permiten la exposición directa de las células a las sustancias de ensayo sin interferencias del medio de cultivo celular con partículas de ensayo, imitando así la exposición humana con mayor similitud fisiológica y biológica que las exposiciones sumergidas12,14.
No obstante, en el caso de procesos reglamentarios como REACH, sólo se dispone de modelos animales en el ámbito de la toxicología aguda por inhalación, ya que hasta el momento no se han validado suficientemente suficientemente y aceptado oficialmente métodos in vitroalternativos. A tal fin, los modelos de ensayo deben validarse de acuerdo con los requisitos del Laboratorio de Referencia de la Unión Europea para alternativas a ensayos con animales (EURL-ECVAM) sobre la validez de los ensayos15.
Un antiguo estudio de prevalidación y un estudio de validación recientemente completado demostraron con éxito el área de aplicación del sistema de exposición CULTEX RFS y su transferibilidad, estabilidad y reproducibilidad13. Este sistema de exposición es un sistema de exposición in vitro basado en células que permite la exposición homogénea de las células a gases, partículas o atmósferas complejas (por ejemplo, humo de cigarrillo) en la ALI debido a su concepto de distribución radial de aerosoles y la conducción del aerosol de ensayo en un flujo continuo sobre las células16. El módulo básico de este sistema de flujo radial consiste en el adaptador de entrada, el módulo de guía de aerosol con una distribución radial de aerosoles, el módulo de muestreo y zócalo, y un módulo de bloqueo con una rueda de mano(Figura 2). Las partículas generadas llegan a las células a través del adaptador de entrada y el módulo de guiado de aerosol y se depositan en las plaquitas de cultivo celular, que se encuentran en las tres cámaras de exposición dispuestas radialmente del módulo de muestreo. El módulo de guía de aerosoles, así como el módulo de muestreo se pueden calentar mediante la conexión a un baño de agua externo17.
En el marco de ambos estudios, se utilizaron células A549 para todos los experimentos de exposición. La línea celular A549 es una línea celular epitelial inmortalizada humana que está muy bien caracterizada y se ha utilizado como modelo in vitro para células epiteliales alveolares de tipo II en numerosos estudios toxicológicos. Las células se caracterizan por cuerpos lamelares, la producción de surfactante y una serie de factores relevantes para la inflamación18. También muestran propiedades de las células epiteliales bronquiales debido a su producción de moco19. Además, se pueden cultivar en la ALI. Aunque esta línea celular es deficiente en la construcción de contactos de células celulares, el cultivo de estas células es mucho más conveniente, menos costoso costo y los resultados derivados de las mismas son independientes del donante en comparación con las células primarias20.
Las células A549 fueron sembradas en insertos de cultivo celular de 6 polos (membrana PET, 4,67 cm2,tamaño de poro 0,4 mm) con una densidad de 3,0 x 105 células por inserto y se cultivaron durante 24 h en condiciones sumergidas. Las células fueron expuestas en tres laboratorios independientes para limpiar el aire y tres dosis de exposición diferentes (25, 50 y 100 g/cm2) de 20 sustancias de ensayo en la ALI. La dosis de exposición se correlaciona con el tiempo de deposición, lo que da como resultado una velocidad de partícula constante de 25 g/cm2, 50 g/cm2 y 100 g/cm2 en las células después de 15, 30 o 60 min, respectivamente. Las partículas depositadas, sin embargo, no fueron lavadas después de la deposición, sino que permanecieron en las células durante 24 h. Los tiempos de deposición de las partículas eran por lo tanto 15, 30 y 60 min, pero la exposición de las células duró 24 h en total. La tasa de deposición de las sustancias de ensayo se determinó en experimentos preliminares de acuerdo con los métodos anteriores17.
La viabilidad celular como indicador de toxicidad se evaluó 24 horas después de la deposición de partículas utilizando un ensayo de viabilidad celular. Se centró especial mente en la calidad de los controles de aire limpio, la optimización y el refinamiento del protocolo de exposición, la reproducibilidad intra e interlaboratorio y el establecimiento de un modelo de predicción (PM). Sustancias que llevaron a una disminución de la viabilidad celular por debajo del 50% (PM 50%) o 75% (PM 75%) en cualquiera de las tres dosis de exposición se consideró que ejercen un riesgo agudo de inhalación. Los resultados se compararon entonces con los datos in vivo existentes (basados en al menos un estudio fiable según la directriz de ensayo de la OCDE (TG) 403 o TG 43621,22), lo que llevó a una concordancia global del 85%, con una especificidad del 83% y una sensibilidad del 88%23.
Además de la medición de la viabilidad celular, se pueden evaluar otros puntos finales como la liberación de citoquinas, el examen del lisado celular o la integridad de la membrana a través del ensayo LDH, pero no fueron necesarios para el estudio de validación. Así, el sistema de exposición (por ejemplo, CULTEX RFS) se demostró como un sistema de cribado predictivo para la evaluación cualitativa de la toxicidad aguda por inhalación de las partículas transmitidas por el aire probadas, lo que representa un método alternativo prometedor a las pruebas en animales. El siguiente protocolo se recomienda para experimentos de exposición a partículas en el aire utilizando este sistema de exposición.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium and supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>FG 0415</td>
			<td>used as growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td>22320</td>
			<td>used as exposure medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S 0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10mg/mL)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>A 2710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Th. Geyer, Renningen, Germany</td>
			<td>L 0180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 2143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cups</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3516</td>
			<td>6&#173;-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell cell culture inserts</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3450</td>
			<td>24mm inserts; 6-&#173;well plates; 0.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASYton</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Air (DIN EN 12021)</td>
			<td>Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td>2290152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab155902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments + equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cell Counter</td>
			<td>Sch&#228;rfe System GmbH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation thermostat</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline RE 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX HyP - Hydraulic Press</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX insert sleeve</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (large)</td>
			<td>Munktell &#38; Filtrak GmbH, Sachsen, Germany</td>
			<td>LP-050</td>
			<td>Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency &#62; 99,999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (small)</td>
			<td>Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany</td>
			<td>9933-05-DQ</td>
			<td>Balston disposable filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pump</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td>Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser</td>
			<td>digital peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader Infinite M200 Pro</td>
			<td>Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vakuum pump</td>
			<td>KNF, Freiburg, Germany</td>
			<td>N86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#246;gtlin mass flow controller 0,2-10 l/min</td>
			<td>TrigasFI GmbH</td>
			<td>V&#246;gtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline Staredition RE 104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface

Aquí, presentamos un sistema modular de exposición in vitro especialmente diseñado que permite la exposición homogénea de células pulmonares humanas cultivadas en la ALI a gases, partículas o atmósferas complejas (por ejemplo, humo de cigarrillo), proporcionando así exposición de la superficie apical de la región alveolar humana al aire. A diferencia de los modelos de exposición secuencial con guía lineal de aerosoles, el diseño modular del sistema de flujo radial cumple con todos los requisitos para la generación y transporte continuo de la atmósfera de prueba a las células, una distribución y deposición homogénea de las partículas y la eliminación continua de la atmósfera. Este método de exposición está diseñado principalmente para la exposición de células a partículas en el aire, pero puede adaptarse a la exposición de aerosoles líquidos y gases altamente tóxicos y agresivos dependiendo del método de generación de aerosoles y el material de los módulos de exposición .
En el marco de un estudio de validación recientemente completado, este sistema de exposición se demostró como un método de cribado transferible, reproducible y predictivo para la evaluación cualitativa de la citotoxicidad pulmonar aguda de partículas en el aire, potencialmente reducir o reemplazar experimentos con animales que normalmente proporcionarían esta evaluación toxicológica.

El CULTEX RFS es un sistema modular de exposición in vitro especialmente diseñado que permite la exposición directa y homogénea de las células en la ALI. En un estudio previo a la validación anterior, se demostró con éxito la aplicabilidad general de este sistema de exposición y su transferibilidad, estabilidad y reproducibilidad. En un proyecto de investigación reciente financiado por el Ministerio Federal de Educación e Investigación de Alemania, el sistema de exposición fu...

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Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Presentamos un sistema de exposición in vitro robusto, transferible y predictivo para el cribado y seguimiento de partículas transmitidas por el aire relativas a su citotoxicidad pulmonar aguda mediante la exposición de células pulmonares humanas cultivadas en la interfaz aire-líquido (ALI).

Evaluación de la toxicidad aguda por inhalación de partículas transmitidas por el aire mediante la exposición de células pulmonares humanas cultivadas en la interfaz aire-líquido

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

El cribado de partículas en el aire relativas a la citotoxicidad pulmonar aguda mediante la exposición de células pulmonares humanas cultivadas en el ALI utilizando este sistema de exposición in vitro puede ayudar a reducir los experimentos con animales. La principal ventaja de este sistema de exposición es el concepto de distribución radial de aerosoles que conduce a una distribución homogénea y la posición de las partículas en las células. Antes de sembrar las células, añadir 2,5 mililitros de medio de crecimiento templado a cada pozo de una placa de seis pozos.Coloque las inserciones de cultivo celular sin células cuidadosamente dentro de los pozos y agregue un mililitro de medio de crecimiento a cada inserción de cultivo celular. Incubar las placas durante 30 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de la tripsinización de las células, diluir 100 microlitros de la suspensión del cultivo celular en una taza llena de 10 mililitros de solución isotónica.Incline la copa lentamente sin agitar. En un contador de celdas, determine el número de células viables por mililitro y la viabilidad celular en función de los parámetros de medición específicos de la celda de las células A549. Después del templado de la placa, aspirar el medio dentro del cultivo celular inserta y siembra un mililitro de células A549 con una densidad de tres veces 10 a las quintas células por mililitros en cada inserto de cultivo celular.Distribuya la suspensión celular por balanceo suave e incubar durante 24 horas. Ajuste el tiempo de prensado mediante el control de tiempo en la parte frontal de la prensa. Abra el suministro de aire comprimido en la válvula de aire comprimido.Usando el regulador de presión en la parte frontal de la prensa, ajuste la presión de aire comprimido a aproximadamente dos bar. Extraiga el cajón, pulse el botón Pulse y lea la presión de presión en el interruptor de presión digital. Llene el recipiente de la sustancia con una pequeña cantidad de la sustancia de ensayo.Inserte el émbolo en el recipiente de la sustancia y gire ligeramente hacia adelante y hacia atrás para distribuir uniformemente el polvo en el recipiente. Coloque el recipiente de la sustancia, con el émbolo, en el cajón y pulse el botón Pulse. Abra el cajón y retire el émbolo.Un paso crítico es el prensado de sustancias de ensayo que deben comprimirse específicamente en una torta de polvo dentro del recipiente de la sustancia para permitir exposiciones estables a partículas. Retire el adaptador de entrada y el reflector de condensado del módulo de guía del aerosol. Cierre los tres orificios de alimentación de aerosoles en el módulo de guiado de aerosoles con tapones y las conexiones de suministro medio en el módulo de muestreo con aletas ficticias.Conecte las líneas de vacío con el conector de tubo del módulo de guía del aerosol. Utilice la rueda de mano para cerrar el módulo y medir el valor de los controladores de flujo. Un par de minutos después del cierre, los valores disminuyen por debajo de cinco mililitros por minuto.Encienda el software del generador de aerosoles. Si el rascador de sustancias no está en la posición más baja, pulse el botón Modo de homing. Coloque el recipiente de la sustancia con el material de ensayo prensado boca abajo sobre el rascador de sustancias.Asegúrese de que el vaso del recipiente de la sustancia esté orientado hacia el frente. Coloque la placa de bloqueo en la ranura sobre el recipiente de la sustancia y apriete el tornillo negro. Cambie los valores de Feed y Rotation a los ajustes deseados.Utilice las flechas hacia abajo para empujar hacia abajo el portaobjetos con el recipiente de la sustancia hasta que el rascador de sustancia esté cerca de la sustancia prensada. Abra el suministro de aire comprimido al generador de aerosoles con un toque del controlador de flujo de masa e inicie la generación de aerosoles haciendo clic en el botón Inicio. Establezca la velocidad de avance en 15 a 20 milímetros por hora para evitar largos tiempos de espera.Controle la generación correcta de partículas observando la nube de polvo fino con una pequeña linterna colocada desde abajo detrás del tubo de vidrio del elutriador. Inicie el suministro medio con un medio de exposición precalentado y llene los módulos de muestreo hasta que las tuberías descendentes estén cubiertas mientras el módulo esté abierto. Inserte inserciones de cultivo de células ciegas en el módulo de exposición, bombee el medio de exposición hasta que las tuberías descendentes estén cubiertas con el medio y el lado inferior de las plaquitas esté en contacto con el medio.Encienda el generador de aerosoles, cierre el módulo de exposición y conecte el módulo de exposición a la salida del módulo de exposición del generador de aerosoles. 30 minutos después del tiempo de entrega, selle la salida del módulo de exposición del elutriador con un tapón de goma y retire las plaquitas ciegas. Vuelva a llenar el medio de exposición hasta que las tuberías descendentes estén cubiertas con un medio.Retire las inserciones de cultivo celular de las placas de seis pozos con la ayuda de pinzas. Vierta el medio de crecimiento cuidadosamente de las inserciones de cultivo celular despeteando las plaquitas y utilice una pipeta para aspirar y desechar el líquido residual. Coloque las plaquitas en las cámaras de exposición de los módulos de exposición y de aire limpio.Cierre los módulos e inicie los experimentos de exposición conectando el módulo de exposición a la salida del módulo de exposición del generador de aerosoles y el módulo de aire limpio al suministro de gas portador simultáneamente. Después de completar el experimento, desconecte los módulos de exposición y aire limpio y selle la salida del módulo de exposición. Detenga el suministro de aire comprimido y el generador de aerosoles haciendo clic en el botón Parar.Abra el módulo de exposición y aire limpio y utilice pinzas para transferir las plaquitas de cultivo celular a las placas de seis pozos preparadas después de la incubación. Incubar las placas de seis pozos, así como los insertos de cultivo celular no explosivos, durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en la interfaz de líquido de aire. 24 horas después de la exposición, inserte los insertos de cultivo celular en las nuevas placas de seis pozos preparadas.Agregue un mililitro de la solución WST1 preparada a cada plaquita de cultivo celular. Mece las placas cuidadosamente para distribuir la solución de forma homogénea en las células. Incubar las seis placas de pozo con el cultivo celular insertos durante una hora a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono.Después de eso, transfiera 100 microlitros del sobrenadante en triplicados de cada placa de seis pozos a una placa de 96 pozos. Con un lector de microplacas, mida la absorbancia a 450 nanómetros con una longitud de onda de referencia de 650 nanómetros. El CULTEX RFS es un sistema modular de exposición in vitro especialmente diseñado que permite la exposición directa y homogénea de las células a partículas en el aire en la interfaz de líquido de aire.La exposición de las células al aire limpio no conduce a una disminución de la viabilidad celular con el tiempo. El sistema de exposición fue validado con éxito y establecido como un modelo de predicción para los peligros agudos de inhalación de los compuestos probados. Exposición de células A549 a diferentes sustancias de ensayo que mostraron toxicidad no, media o fuerte.Asegúrese de mantener estrictamente los plazos que son los tiempos de incubación, el tiempo de entrega de la generación de partículas y los tiempos de deposición de partículas. Este método de exposición está diseñado principalmente para la exposición a partículas de las células, pero puede extenderse a la exposición de aerosoles líquidos y gases mediante la adaptación del método de generación de aerosoles. Este método de cribado permite la evaluación cualitativa de partículas inhalables con respecto a la toxicidad aguda por inhalación in vitro, reduciendo así los ensayos con animales que normalmente proporcionarían esta evaluación toxicológica.No olvide que trabajar con sustancias de ensayo tóxicas puede ser extremadamente peligroso y las precauciones, como el uso de guantes, una máscara, siempre deben tomarse al manipular dichos compuestos.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Investigación

Medicina

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