Name: assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface
Uploaded: 2020-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

Detta arbete stöddes av det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Tyskland (Grant 031A581, delprojekt A-D)) och av Den tyska forskningsstiftelsen (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Forskargrupp EN GRK 2338).

PROTOKOLLET för ett exponeringsexperiment omfattar en period på tre dagar.
Dag 1
1. Allmänna beredningar och odling av celler
OBS: Den mänskliga lungadenokarcinomepitelcellinjen A549 användes för exponeringsexperiment. Cellerna måste hanteras under sterila förhållanden. Andra cellinjer som är lämpliga för odling vid ALI kan användas.
<ol><li>Förbered tillväxtmediet (Dulbeccos minsta essentiella medium (DMEM), kompletterat...

<ol>
	<li>Faber, S. C., McCullough, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+the+Looking+Glass:+In+vitro+Models+for+Inhalation+Toxicology+and+Interindividual+Variability+in+the+Airway.">Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).</li><li>De Matteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+challenges+in+occupational+lung+diseases.">Current and new challenges in occupational lung diseases.</a> European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).</li><li>LANUV Nordrhein-Westfalen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).</li><li>B&#233;rub&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Inhalation+Toxicity+and+Disease.+The+report+of+a+FRAME+workshop.">In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop.</a> Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).</li><li>Lopez, A. D., Murray, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+disease,+1990-2020.">The global burden of disease, 1990-2020.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).</li><li>Clippinger, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+approaches+for+acute+inhalation+toxicity+testing+to+address+global+regulatory+and+non-regulatory+data+requirements:+An+international+workshop+report.">Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report.</a> Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).</li><li>Agrawal, M. R., Winder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+and+Occurrence+of+LD50+Values+for+Materials+in+the+Workplace.">Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace.</a> Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).</li><li>Amtsblatt der Europ&#228;ischen Union. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verordnung+(EG)+Nr.+1907/2006+des+Europ&#228;ischen+Parlaments+und+des+Rates.">Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europ&#228;ischen Parlaments und des Rates.</a> Europ&#228;ische Union. 860, (2006).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+Organ-Level+Lung+Functions+on+a+Chip.">Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Fisher, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Human+Lung+Slices+in+Toxicology.">The Use of Human Lung Slices in Toxicology.</a> Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).</li><li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+and+Oxidative+Stress+Responses+of+an+Alveolar+Epithelial+Cell+Line+to+Airborne+Zinc+Oxide+Nanoparticles+at+the+Air-Liquid+Interface.">Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 12, (2013).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+as+an+in+vitro+exposure+method+to+assess+acute+pulmonary+toxicity+of+fine+dusts+and+nanoparticles+with+special+focus+on+the+intra-+and+inter-laboratory+reproducibility.">Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility.</a> Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).</li><li>Lacroix, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-Liquid+Interface+In+vitro+Models+for+Respiratory+Toxicology+Research.">Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).</li><li>Eskes, C., Whelan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, (2016).</li><li>Rach, J., Budde, J., M&#246;hle, N., Aufderheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+exposure+at+the+air-liquid+interface:+Evaluation+of+an+in+vitro+approach+for+simulating+inhalation+of+airborne+substances.">Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances.</a> Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).</li><li>Aufderheide, M., Halter, B., M&#246;hle, N., Hochrainer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CULTEX+RFS:+A+comprehensive+Technical+Approach+for+the+In+vitro+Exposure+of+Airway+Epithelial+Cells+to+the+Particulate+Matter+at+the+Air-Liquid+Interface.">The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 15, (2013).</li><li>Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Carterson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates:+Alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).</li><li>Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+useful+in+vitro+model+for+transport+studies+of+alveolar+epithelial+barrier.">A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier.</a> Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+403:+Acute+Inhalation+Toxicity.">Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+436:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+for+the+assessment+of+the+acute+inhalation+toxicity+of+airborne+particles.">Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles.</a> Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+exposure+system+generating+nebulized+aerosol+of+sulfur+mustard+in+comparison+to+the+standard+submerse+exposure.">A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure.</a> Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+CULTEX+radial+flow+system+for+in+vitro+investigation+of+lung+damaging+agents.">Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents.</a> Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).</li><li>Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+GS-NS0+myeloma+cells+to+pH+shifts+and+pH+perturbations.">The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+Guideline+433:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2018).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , (2018).</li></ol>

Många icke-djurinande toxicitettestmodeller har utvecklats under de senaste åren för att få information om den akuta inhalationsrisken för inandningsbara partiklar och för att minska och ersätta djurförsök enligt 3R-principen25.
När det gäller cellodlingsmodeller kan exponering av celler göras under nedsänkta förhållanden eller vid ALI. Att exponera celler under nedsänkta förhållanden kan påverka de fysikalisk-kemiska egenskaperna och därmed de toxis...

Inandning av giftiga luftburna partiklar är ett folkhälsoproblem, vilket leder till en mängd hälsorisker över hela världen och många miljoner dödsfall årligen1,2. Klimatförändringarna, den pågående industriella utvecklingen och den ökande efterfrågan på energi, jordbruks- och konsumentprodukter har bidragit till ökningen av lungsjukdomar under de senaste åren3,4,5,6. Kunskap och utvärdering av inandningsbara ämnen när det gäller deras akuta inandningstoxicitet utgör grunden för riskbedömning och riskhantering, men denna information saknas fortfarande för ett brett spektrum av dessa ämnen7,8. Sedan 2006 kräver EU:s kemikalielagstiftning Reach (registrering, utvärdering, tillstånd och begränsning av kemikalier) att redan befintliga och nyligen införda produkter genomgår en toxikologisk karakterisering, inklusive inhalationsvägen innan de släpps ut på marknaden. Reach fokuserar därför på alternativa och djurfria metoder, genomförandet av 3R-principen (ersättning, förfining och minskning av djurförsök) och användning av lämpliga in vitro-modeller9. Under de senaste åren har många olika och adekvata icke-djurinande toxicitetstestmodeller (t.ex. in vitro-cellkulturer, lung-on-a-chip-modeller, precisionssnitt lungskivor (PCLS)) utvecklats för att bedöma den akuta inhalationstoxiciteten hos luftburna partiklar5,7,10,11. När det gäller in vitro-cellsodlingsmodeller kan odlade celler exponeras under nedsänkta förhållanden eller vid ALI(figur 1). Giltigheten av studier med nedsänkt exponering är dock begränsad när det gäller utvärderingen av toxiciteten hos luftburna föreningar, särskilt partiklar. Metoder för nedsänkt exponering motsvarar inte den mänskliga in vivo-situationen. Cellodlingsmediet som täcker cellerna kan påverka de fysikalisk-kemiska egenskaperna och därmed de toxiska egenskaperna hos ett testämne12,13. ALI in vitro inhalationsmodeller möjliggör direkt exponering av celler på testämnena utan störningar i cellodlingsmediet med testpartiklar, vilket härmar exponeringen hos människor med högre fysiologiska och biologiska likheter än nedsänktexponering12,14.
För regleringsprocesser som Reach finns dock endast djurmodeller tillgängliga inom området akut inhalationstoxikologi, eftersom inga alternativa in vitro-metoder har validerats tillräckligt och officiellt accepterats hittills14. För detta ändamål måste testmodeller valideras i enlighet med kraven i Europeiska unionens referenslaboratorium för alternativ till djurförsök (EURL-ECVAM) principer om testgiltighet15.
En tidigare prevalideringsstudie och en nyligen avslutad valideringsstudie visade framgångsrikt tillämpningsområdet för CULTEX RFS-exponeringssystemet och dess överlåtbarhet, stabilitet och reproducerbarhet13. Detta exponeringssystem är ett in vitro-cellbaserat exponeringssystem som möjliggör homogen exponering av celler för gaser, partiklar eller komplexa atmosfärer (t.ex. cigarettrök) vid ALI på grund av dess radiella aerosoldistributionskoncept och testaerosolens genomförande i ett kontinuerligt flöde över cellerna16. Grundmodulen i detta radiella flödessystem består av inloppsadaptern, aerosolstyrmodulen med radiell aerosolfördelning, provtagnings- och socketmodulen och en låsmodul med handhjul (figur 2). De genererade partiklarna når cellerna via inloppsadaptern och aerosolledstången och deponeras på cellodlingsskären, som finns i provtagningsmodulens tre radiellt arrangerade exponeringskammare. Aerosolens styrmodul samt provtagningsmodulen kan värmas upp genom att ansluta till ett externt vattenbad17.
Inom ramen för båda studierna användes A549-celler för alla exponeringsexperiment. Cellinjen A549 är en humanförevigad epitelcellinje som är mycket välkarakteriserad och har använts som en in vitro-modell för typ II alveolar epitelceller i många toxikologiska studier. Cellerna kännetecknas av lamellar kroppar, produktion av ytaktiva och ett antal inflammation-relevanta faktorer18. De visar också egenskaper bronkial epitelceller på grund av deras slem produktion19. Dessutom kan de odlas på ALI. Även om denna cellinje är brist på att bygga cell-cell kontakter, är odling av dessa celler mycket bekvämare, billigare dyra och resultat som härrör därav är givaroberoende jämfört med primära celler20.
A549 celler var seedade i 6-brunn cell odling skär (PET membran, 4,67 cm2,por storlek 0,4 mm) med en densitet på 3,0 x 105 celler per skär och odlas för 24 h under nedsänkta förhållanden. Celler exponerades sedan i tre oberoende laboratorier för ren luft och tre olika exponeringsdoser (25, 50 och 100 μg/cm2)av 20 testämnen vid ALI. Exponeringsdosen är korrelerad till deponeringstiden, vilket resulterar i en konstant partikelhastighet på 25 μg/cm2,50 μg/cm2 och 100 μg/cm2 på cellerna efter 15, 30 respektive 60 min. De deponerade partiklarna tvättades dock inte av efter nedfall, utan förblev på cellerna i 24 timmar. Partiklarnas nedfall var därför 15, 30 och 60 min, men cellernas exponering varade i totalt 24 timmar. Testämnenas nedfall spåddes i preliminära experiment enligt tidigare metoder17.
Celllönsamhet som en indikator på toxicitet bedömdes 24 timmar efter partikelnedfall med hjälp av en celllönsamhetsanalys. Särskild vikt lades på kvaliteten på ren luft kontroller, optimering och förfining av exponeringsprotokollet, intra- och inter-laboratory reproducerbarhet och inrättandet av en förutsägelse modell (PM). Ämnen som ledde till en minskning av celllönsamheten under 50 % (PM 50%) eller 75% (PM 75%) vid någon av de tre exponeringsdoserna ansågs utöva en akut inandningsrisk. Resultaten jämfördes sedan med befintliga in vivo-data (baserat på minst en tillförlitlig studie enligt OECD:s testriktlinje (TG) 403 eller TG 43621,22), vilket ledde till en övergripande överensstämmelse på 85 %, med en specificitet på 83 % och en känslighet på 88 %23.
Förutom mätning av celllivskraft kan andra effektmått som cytokinfrisättning, undersökning av celllysat eller membranintegritet via LDH-analys bedömas men inte krävdes för valideringsstudien. Exponeringssystemet (t.ex. CULTEX RFS) har således bevisats som ett prediktivt screeningsystem för kvalitativ bedömning av den akuta inhalationstoxiciteten hos de testade luftburna partiklarna, vilket motsvarar en lovande alternativ metod för djurförsök. Följande protokoll rekommenderas för exponeringsexperiment för luftburna partiklar som använder detta exponeringssystem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium and supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>FG 0415</td>
			<td>used as growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td>22320</td>
			<td>used as exposure medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S 0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10mg/mL)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>A 2710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Th. Geyer, Renningen, Germany</td>
			<td>L 0180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 2143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cups</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3516</td>
			<td>6&#173;-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell cell culture inserts</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3450</td>
			<td>24mm inserts; 6-&#173;well plates; 0.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASYton</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Air (DIN EN 12021)</td>
			<td>Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td>2290152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab155902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments + equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cell Counter</td>
			<td>Sch&#228;rfe System GmbH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation thermostat</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline RE 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX HyP - Hydraulic Press</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX insert sleeve</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (large)</td>
			<td>Munktell &#38; Filtrak GmbH, Sachsen, Germany</td>
			<td>LP-050</td>
			<td>Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency &#62; 99,999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (small)</td>
			<td>Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany</td>
			<td>9933-05-DQ</td>
			<td>Balston disposable filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pump</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td>Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser</td>
			<td>digital peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader Infinite M200 Pro</td>
			<td>Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vakuum pump</td>
			<td>KNF, Freiburg, Germany</td>
			<td>N86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#246;gtlin mass flow controller 0,2-10 l/min</td>
			<td>TrigasFI GmbH</td>
			<td>V&#246;gtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline Staredition RE 104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface

Här presenterar vi ett specialdesignat modulärt in vitro-exponeringssystem som möjliggör homogen exponering av odlade mänskliga lungceller vid ALI för gaser, partiklar eller komplexa atmosfärer (t.ex. cigarettrök), vilket ger realistisk fysiologisk exponering av den apikala ytan av den mänskliga alveolarregionen för luft. I motsats till sekventiella exponeringsmodeller med linjär aerosolvägledning uppfyller den modulära utformningen av det radiella flödessystemet alla krav för kontinuerlig generering och transport av testatmosfären till cellerna, en homogen fördelning och deposition av partiklarna och kontinuerligt avlägsnande av atmosfären. Denna exponeringsmetod är främst utformad för exponering av celler för luftburna partiklar, men kan anpassas till exponeringen av flytande aerosoler och mycket giftiga och aggressiva gaser beroende på aerosolgenereringsmetoden och materialet i exponeringsmodulerna .
Inom ramen för en nyligen avslutad valideringsstudie har detta exponeringssystem bevisats som en överförbar, reproducerbar och prediktiv screeningmetod för kvalitativ bedömning av luftburna partiklars akuta pulmonellcytotoxicitet, och därmed potentiellt minska eller ersätta djurförsök som normalt skulle ge denna toxikologiska bedömning.

CULTEX RFS är ett specialdesignat modulärt in vitro-exponeringssystem som möjliggör direkt och homogen exponering av celler vid ALI. Inom en tidigare undersökning före validering visades den allmänna tillämpligheten av detta exponeringssystem och dess överförbarhet, stabilitet och reproducerbarhet. I ett nyligen genomfört forskningsprojekt finansierat av det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning, var exponeringssystemet framgångsrikt valideras och etablerade...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Vi presenterar ett robust, överförbart och prediktivt in vitro-exponeringssystem för screening och övervakning av luftburna partiklar om deras akuta pulmonell cytotoxicitet genom att exponera odlade mänskliga lungceller vid luftvätskegränssnittet (ALI).

Bedömning av den akuta inandning toxicitet luftburna partiklar genom att exponera odlade mänskliga lungceller vid air-liquid interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Screening av luftburna partiklar rörande den akuta lungcyttoxiciteten genom att exponera odlade mänskliga lungceller vid ALI med hjälp av detta in vitro-exponeringssystem kan bidra till att minska djurförsök. Den största fördelen med detta exponeringssystem är det radiella aerosolfördelningskonceptet som leder till en homogen fördelning och partiklarnas position på cellerna. Innan sådd cellerna, tillsätt 2,5 milliliter härdat tillväxt medium till varje brunn av en sex brunnsplatta.Placera cellodlingen skär utan celler noggrant inuti brunnarna och tillsätt en milliliter tillväxt medium till varje cellodling infoga. Inkubera plattorna i 30 minuter vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. Efter trypsinization av celler, späd 100 mikroliter av cellodlingsupphängningen i en kopp fylld med 10 milliliter isotonlösning.Luta koppen långsamt utan att skaka. På en cellräknare, bestämma antalet livskraftiga celler per milliliter och cellens livskraft baserat på cellens specifika mätparametrar av A549-celler. Efter anlöpning av plattan aspirera mediet inom cellodlingsinsatserna och fröet en milliliter av A549-celler med en densitet på tre gånger 10 till de femte cellerna per milliliter i varje cellodlingsskär.Fördela cellupphängningen genom skonsam gungning och inkubera i 24 timmar. Ställ in presstiden via tidskontrollen på pressens främre sida. Öppna tryckluftstillförseln vid tryckluftsventilen.Med hjälp av tryckregulatorn på pressens främre sida ställer du in tryckluftstrycket på ungefär två stång. Dra ut ritlådan, tryck på tryckknappen och läs presstrycket på den digitala tryckbrytaren. Fyll ämnesbehållaren med en liten mängd av testämnet.Sätt in kolven i ämnesbehållaren och vrid den något fram och tillbaka för att jämnt fördela pulvret i behållaren. Placera ämnesbehållaren, med kolven, i byrålådan och tryck på knappen Tryck. Öppna låda och ta bort kolven.Ett kritiskt steg är pressning av testämnen som måste vara särskilt komprimerade till en pulverkaka i ämnesbehållaren för att möjliggöra stabila partikelexponeringar. Ta bort inloppsadaptorn och kondensatorreflektorn från aerosolledarmodulen. Stäng de tre aerosolmatningsborrningarna i aerosolledarmodulen med pluggar och de medelhöga tillstäcksanslutningarna vid provtagningsmodulen med provdocksklaffar.Anslut vakuumledningarna med rörets kontakt för aerosolens guidningsmodul. Använd handhjulet för att stänga modulen och mäta värdet på flödesregulatorn. Ett par minuter efter stängning minskar värdena under fem milliliter per minut.Starta programvaran för aerosolgeneratorn. Om ämnesskrapa inte är i det lägsta läget, tryck på knappen Homing Mode( Homing Mode). Placera ämnesbehållaren med det pressade testmaterialet upp och ned över ämnesskrapa.Se till att ämnets glasbehållare är vänd mot framsidan. Placera låsplattan i springan över ämnesbehållaren och dra åt den svarta skruven. Ändra värdena för Feed och Rotation till önskade inställningar.Använd de nedåtriktade pilarna för att trycka ner glidbanan med ämnesbehållaren tills ämnesskrapet är nära det pressade ämnet. Öppna tryckluftstillförseln till aerosolgeneratorn med en kran på massflödesregulatorn och starta aerosolgenereringen genom att klicka på Start-knappen. Ställ in matningshastigheten på 15 till 20 millimeter per timme för att undvika långa väntetider.Styr rätt partikelgenerering genom att observera det fina dammmolnet med en liten ficklampa placerad underifrån bakom elutriatorns glasrör. Starta mediumtillförseln med förvärmt exponeringsmedium och fyll på provtagningsmodulerna tills downpipesna täcks medan modulen är öppen. Sätt in blindcellodlingsinsatser i exponeringsmodulen, pumpa exponeringsmediet nedåt tills downpipsen är täckta med medium och skärens nedre sida är i kontakt med medium.Starta aerosolgeneratorn, stäng exponeringsmodulen, och anslut exponeringsmodulen till aerosolgeneratorns exponeringsmodulsutlopp. 30 minuter efter ledtiden, försegla elutriatorns utloppet för exponeringsmodulen med en gummiplugg och ta bort de blinda skären. Fyll på exponeringsmediet tills du har täckta med downpips med medium.Ta bort cellodlingsinsatserna från de sex brunnsplattorna med hjälp av pincett. Häll tillväxtmediet försiktigt från cellkulturens insatser av genom att störta skären och använd en pipett för att aspirera och kassera restvätskan. Placera skären i exponeringskamrarna för både exponerings- och renluftsmodulerna.Stäng modulerna och starta exponeringsexperimenten genom att ansluta exponeringsmodulen till aerosolgeneratorns exponeringsmodulutlopp och renluftsmodulen till bärarens gasförsörjning samtidigt. Efter avslutad experiment, koppla bort exponeringen och ren luft moduler och täta exponeringsmodulen utlopp. Stoppa tryckluftstillförseln och aerosolgeneratorn genom att klicka på Stop-knappen.Öppna exponeringen och ren luft modul och använd pincett för att överföra cellodlingsinsatserna till de förberedda efterinkubationen sex brunnsplattor. Inkubera de sex brunnsplattorna, liksom de oexponerade cellodlingsinsatserna, i 24 timmar vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid vid luftvätskegränssnittet. 24 timmar efter exponeringen, sätt cellodlingsinsatserna i de nya beredda sex brunnsplattorna.Lägg till en milliliter av den färska beredda WST1-lösningen till varje cellodlingsskär. Rock plattorna försiktigt för att distribuera lösningen homogent på cellerna. Inkubera de sex brunnsplattorna med cellodlingsinsatserna i en timme vid 37 grader Celsius och 5 %-koldioxid.Därefter överför du 100 mikroliter av supernatanten i tre exemplar från varje sex brunnsplatta till en 96 brunnsplatta. Med hjälp av en mikroplattläsare mäter du absorbansen vid 450 nanometer med en referensvåglängd på 650 nanometer. CULTEX RFS är ett specialdesignat modulärt in vitro-exponeringssystem som möjliggör cellernas direkta och homogena exponering för luftburna partiklar vid luftflytande gränssnitt.Exponering av celler för ren luft leder till ingen minskning av cellernas viabilitet över tiden. Exponeringssystemet validerades framgångsrikt och fastställdes som en förutsägelsemodell för akuta inhalationsrisker hos de testade föreningarna. Exponering av A549-celler för olika testämnen som uppvisade ingen, medelhög eller stark toxicitet.Vänligen se till att du strikt håller de tidsramar som är inkubationstiderna, ledtiden för partikelgenerering och partikeldepositionstiderna. Denna exponeringsmetod är främst utformad för partikelexponering av celler, men kan utvidgas till exponering av flytande aerosoler och gaser genom anpassning av metoden för aerosolgenerering. Denna screeningmetod möjliggör en kvalitativ bedömning av inhalerbara partiklar avseende den akuta inhalationstoxiciteten in vitro och minskar därigenom djurförsök som normalt skulle ge denna toxikologiska bedömning.Glöm inte att arbeta med giftiga testämnen kan vara extremt farligt och försiktighetsåtgärder, såsom att bära handskar, en mask, bör alltid vidtas vid hantering av sådana föreningar.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Isolering av Mouse Respiratory epitelceller och exponering för experimentell cigarettrök på Air Liquid Interface

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flödescytometri cellbaserad analys för att detektera antikroppar till N-metyl-D-aspartat-receptor-eller dopamin-2-receptor i humant serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

En mus modell av ischemi-reperfusion skada genom Ligation i vänstra främre nedåt Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolering av Human Lymphatic endotelceller från Multi-parameter fluorescensaktiverad cellsortering

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Diffus optisk spektroskopi för kvantitativ bedömning av akut joniserande strålning inducerad Skin toxicitet med hjälp av en musmodell

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Primära effektvariabeln i en grismodell av akut hjärtinfarkt

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Öppna Trakeostomituber Gastric Acid aspiration Murina Modell av akut lungskada Resultat i Maximal Akut nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31-magnetisk resonansspektroskopi: ett verktyg för att mäta<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial oxidativ fosforylering Kapacitet i human skelettmuskel

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Inducera akut lung skada hos möss genom direkt Intratracheal Lipopolysaccharide instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Oral Health Assessment by Lay Personnel for Older Adults

Oral hälsobedömning av lekpersonal för äldre vuxna

Oral health is an often-undervalued contributor to overall health. The literature, however, underscores the myriad of systemic diseases influenced by oral ...