Name: assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface
Uploaded: 2020-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

Bu çalışma Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Almanya (Grant 031A581, alt proje A-D)) ve Alman Araştırma Vakfı (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Araştırma Eğitim Grubu GRK 2338).

NOT: Bir pozlama deneyinin protokolü üç günlük bir dönemi kapsar.
1. Gün
1. Genel hazırlıklar ve hücrelerin ekimi
NOT: Maruz kalma deneyleri için insan akciğer adenokarsinomu epitel hücre hattı A549 kullanılmıştır. Hücreler steril koşullarda ele alınmalıdır. ALI'de ekime uygun diğer hücre hatları kullanılabilir.
<ol><li>Büyüme ortamını (Dulbecco'nun Minimum Esansiyel Orta (DMEM), %10 fetal sığır serumu ...

<ol>
	<li>Faber, S. C., McCullough, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+the+Looking+Glass:+In+vitro+Models+for+Inhalation+Toxicology+and+Interindividual+Variability+in+the+Airway.">Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).</li><li>De Matteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+new+challenges+in+occupational+lung+diseases.">Current and new challenges in occupational lung diseases.</a> European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).</li><li>LANUV Nordrhein-Westfalen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).</li><li>B&#233;rub&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+of+Inhalation+Toxicity+and+Disease.+The+report+of+a+FRAME+workshop.">In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop.</a> Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).</li><li>Lopez, A. D., Murray, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+disease,+1990-2020.">The global burden of disease, 1990-2020.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).</li><li>Clippinger, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+approaches+for+acute+inhalation+toxicity+testing+to+address+global+regulatory+and+non-regulatory+data+requirements:+An+international+workshop+report.">Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report.</a> Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).</li><li>Agrawal, M. R., Winder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+and+Occurrence+of+LD50+Values+for+Materials+in+the+Workplace.">Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace.</a> Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).</li><li>Amtsblatt der Europ&#228;ischen Union. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verordnung+(EG)+Nr.+1907/2006+des+Europ&#228;ischen+Parlaments+und+des+Rates.">Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europ&#228;ischen Parlaments und des Rates.</a> Europ&#228;ische Union. 860, (2006).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+Organ-Level+Lung+Functions+on+a+Chip.">Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li><li>Fisher, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Human+Lung+Slices+in+Toxicology.">The Use of Human Lung Slices in Toxicology.</a> Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).</li><li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+and+Oxidative+Stress+Responses+of+an+Alveolar+Epithelial+Cell+Line+to+Airborne+Zinc+Oxide+Nanoparticles+at+the+Air-Liquid+Interface.">Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 12, (2013).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+as+an+in+vitro+exposure+method+to+assess+acute+pulmonary+toxicity+of+fine+dusts+and+nanoparticles+with+special+focus+on+the+intra-+and+inter-laboratory+reproducibility.">Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility.</a> Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).</li><li>Lacroix, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-Liquid+Interface+In+vitro+Models+for+Respiratory+Toxicology+Research.">Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).</li><li>Eskes, C., Whelan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, (2016).</li><li>Rach, J., Budde, J., M&#246;hle, N., Aufderheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+exposure+at+the+air-liquid+interface:+Evaluation+of+an+in+vitro+approach+for+simulating+inhalation+of+airborne+substances.">Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances.</a> Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).</li><li>Aufderheide, M., Halter, B., M&#246;hle, N., Hochrainer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CULTEX+RFS:+A+comprehensive+Technical+Approach+for+the+In+vitro+Exposure+of+Airway+Epithelial+Cells+to+the+Particulate+Matter+at+the+Air-Liquid+Interface.">The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 15, (2013).</li><li>Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Carterson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates:+Alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).</li><li>Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+useful+in+vitro+model+for+transport+studies+of+alveolar+epithelial+barrier.">A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier.</a> Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+403:+Acute+Inhalation+Toxicity.">Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+436:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+for+the+assessment+of+the+acute+inhalation+toxicity+of+airborne+particles.">Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles.</a> Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+exposure+system+generating+nebulized+aerosol+of+sulfur+mustard+in+comparison+to+the+standard+submerse+exposure.">A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure.</a> Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).</li><li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+CULTEX+radial+flow+system+for+in+vitro+investigation+of+lung+damaging+agents.">Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents.</a> Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).</li><li>Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+GS-NS0+myeloma+cells+to+pH+shifts+and+pH+perturbations.">The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+Guideline+433:+Acute+Inhalation+Toxicity+–+Acute+Toxic+Class+Method.">Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2018).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , (2018).</li></ol>

Birçok hayvan dışı inhalasyon toksisite testi modelleri son yıllarda inhale edilebilir parçacıkların akut inhalasyon tehlikesi hakkında bilgi edinmek ve 3R prensibine göre hayvan deneylerini azaltmak ve değiştirmek amacıyla geliştirilmiştir25.
Hücre kültürü modelleri açısından, hücrelerin maruz kalma batık koşullar altında veya ALI yapılabilir. Batık koşullar altında hücrelerin maruz fiziko-kimyasal özellikleri ve böylece, bir test madde...

Toksik havadan bulaşan parçacıkların solunması bir halk sağlığı sorunudur, dünya çapında sağlık riskleri çok sayıda yol ve ölümler milyonlarca yıllık1,2. İklim değişikliği, devam eden endüstriyel gelişme ve artan enerji talebi, tarım ve tüketici ürünleri son yıllarda akciğer hastalıklarının artmasına katkıda bulunmuştur3,4,5,6. Bilgi ve akut inhalasyon toksisitesi ile ilgili solunabilir maddelerin değerlendirilmesi tehlike değerlendirmesi ve risk yönetimi için temel sağlamak, ancak bu bilgiler hala bu maddelerin geniş bir yelpazede için eksik7,8. 2006 yılından bu yana, AB kimyasal mevzuatı REACH (Kimyasalların Kaydı, Değerlendirilmesi, Yetkilendirilmesi ve Kısıtlanması) mevcut ve yeni tanıtılan ürünlerin piyasaya sürülmeden önce soluma rotası da dahil olmak üzere toksikolojik bir karakterizasyondan geçmesini gerektirmektedir. Bu nedenle REACH, alternatif ve hayvansız yöntemlere, "3R" prensibinin uygulanmasına (Hayvan deneylerinin değiştirilmesi, İncelmesi ve azaltılması) ve uygun in vitro modellerin in vitro modellerinin kullanımına odaklanmaktadır9. Son yıllarda, birçok farklı ve yeterli hayvan dışı inhalasyon toksisite testi modelleri (örneğin, in vitro hücre kültürleri, akciğer-on-a-chip modelleri, hassas kesilmiş akciğer dilimleri (PCLS)) amacıyla hava daki parçacıkların akut inhalasyon toksisitesi değerlendirmek için geliştirilmiştir5,7,10,11. In vitro hücre kültürü modelleri açısından, ekili hücreler batık koşullarda veya ALI'de maruz kalınabilir (Şekil 1). Ancak, batık maruziyet çalışmalarının geçerliliği, özellikle partiküllerin havadaki bileşiklerin toksisitesinin değerlendirilmesi açısından sınırlıdır. Batık maruzkalma teknikleri in vivo durumuna karşılık gelmez; hücreleri kapsayan hücre kültürü orta fiziko-kimyasal özellikleri etkileyebilir ve böylece, bir test maddesinin toksik özellikleri12,13. ALI in vitro inhalasyon modelleri test parçacıkları ile hücre kültürü ortamının müdahalesi olmadan test maddeleri hücrelerin doğrudan maruz kalma sağlar, böylece, batık pozlama daha yüksek fizyolojik ve biyolojik benzerlik ile insan maruziyeti taklit12,14.
REACH gibi düzenleyici işlemler için, ancak, sadece hayvan modelleri akut inhalasyon toksikoloji alanında mevcuttur, hiçbir alternatif in vitro yöntemleri yeterince doğrulanmış ve resmen şimdiye kadar kabul edilmiştir14. Bu amaçla test modellerinin, test geçerliliğine ilişkin Hayvan TestleriNe Alternatifler Için Avrupa Birliği Referans Laboratuvarı (EURL-ECVAM) ilkelerinin gereklerine göre doğrulanması gerekir15.
Eski bir ön doğrulama çalışması ve yakın zamanda tamamlanan bir doğrulama çalışması cultex RFS maruz kalma sisteminin uygulama alanını ve aktarılabilirliğini, stabilitesini ve tekrarlanabilirliğini başarıyla göstermiştir13. Bu maruz kalma sistemi, radyal aerosol dağılım konsepti ve test aerosolünün hücreler üzerinde sürekli bir akış halinde iletimi nedeniyle ALI'de hücrelerin gazlara, partiküllere veya karmaşık atmosferlere (örn. sigara dumanı) homojen bir şekilde maruz kalmasını sağlayan in vitro hücre tabanlı bir maruz kalma sistemidir16. Bu radyal akış sisteminin temel modülü giriş adaptörü, radyal aerosol dağılımına sahip aerosol kılavuz modülü, numune alma ve soket modülü ve el tekerleği ile kilitleme modülünden oluşur (Şekil 2). Oluşturulan parçacıklar giriş adaptörü ve aerosol kılavuz modülü aracılığıyla hücrelere ulaşır ve örnekleme modülünün radyal olarak düzenlenmiş üç pozlama odasında bulunan hücre kültürü kesici uçlarda birikir. Aerosol kılavuz modülü ve örnekleme modülü harici bir su banyosuna bağlanarak ısıtılabilir17.
Her iki çalışma çerçevesinde tüm maruzkalma deneyleri için A549 hücreleri kullanılmıştır. Hücre hattı A549 çok iyi karakterize ve çok sayıda toksikolojik çalışmalarda tip II alveoler epitel hücreleri için bir in vitro model olarak kullanılmıştır bir insan ölümsüzleştirilmiş epitel hücre hattıdır. Hücreler lamellar cisimler ile karakterizedir, sürfaktan üretimi ve inflamasyon ile ilgili faktörlerin bir dizi18. Ayrıca mukus üretimi nedeniyle bronşiyal epitel hücrelerinin özelliklerini göstermek19. Ayrıca, ONLAR ALI kültürlü olabilir. Bu hücre hattı hücre-hücre temasları bina eksik olmasına rağmen, bu hücrelerin ekimi çok daha uygun, daha az maliyet pahalı ve bunların elde edilen sonuçlar birincil hücrelere göre donör bağımsız20.
A549 hücreleri 6 kuyulu hücre kültürü kesici uçlarda (PET membran, 4.67 cm2, gözenek boyutu 0.4 mm) seri başı 3.0 x 105 hücre yoğunluğu ile tohumlanmış ve batık koşullarda 24 saat ekili olarak eklenmiştir. Hücreler daha sonra havayı temizlemek için üç bağımsız laboratuvarda maruz kaldı ve ALI'de 20 test maddesinden üç farklı maruz kalma dozu (25, 50 ve 100 μg/cm2)alındı. Pozlama dozu, sırasıyla 15, 30 veya 60 dakika sonra hücrelere 25 g/cm2,50 μg/cm2 ve 100 g/cm2 sabit partikül oranı ile sonuçlanan biriktirme süresi ile ilişkilidir. Ancak biriken parçacıklar birikmeden sonra yıkanmamış, ancak 24 saat boyunca hücrelerde kalmıştır. Bu nedenle parçacıkların biriktirme süreleri 15, 30 ve 60 dk idi, ancak hücrelerin maruz kalma toplam 24 saat sürdü. Test maddelerinin biriktirme oranı önceki yöntemlere göre ön deneylerdebelirlenmiştir 17.
Toksisitenin bir göstergesi olarak hücre canlılığı, hücre canlılığı tsayı kullanılarak parçacık birikiminden 24 saat sonra değerlendirildi. Temiz hava kontrollerinin kalitesi, maruz kalma protokolünün optimizasyonu ve iyileştirilmesi, laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası tekrarlanabilirlik ve bir tahmin modelinin (PM) oluşturulması üzerine özel bir odak noktası kurulmuştur. Hücre canlılığının %50'nin altına düşmesine yol açan maddeler (PM %50) veya %75 (PM %75) herhangi üç maruz kalma dozlarında akut inhalasyon tehlikesi uygulamak için kabul edildi. Sonuçlar daha sonra mevcut in vivo verileri ile karşılaştırıldı (OECD test kılavuzuna göre en az bir güvenilir çalışma dayalı (TG) 403 veya TG 43621,22), genel bir uyum yol 85%, bir özgüllük ile 83% ve 88%23duyarlılık .
Hücre canlılığının ölçülmesinin yanı sıra, sitokin salınımı, ldh tetkik yoluyla hücre lisatının incelenmesi veya membran bütünlüğünün incelenmesi gibi diğer uç noktalar değerlendirilebilir ancak doğrulama çalışması için gerekli değildir. Böylece, maruz kalma sistemi (örneğin, CULTEX RFS) test edilen hava partiküllerinin akut inhalasyon toksisitesinin nitel değerlendirilmesi için bir tahmine dayalı tarama sistemi olarak kanıtlanmıştır, hayvan testleri için umut verici bir alternatif yöntem temsil. Bu pozlama sistemini kullanarak havadaki parçacıklara maruz kalma deneyleri için aşağıdaki protokol önerilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium and supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>FG 0415</td>
			<td>used as growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td>22320</td>
			<td>used as exposure medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S 0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin (10mg/mL)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>A 2710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Th. Geyer, Renningen, Germany</td>
			<td>L 0180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L 2143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cups</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3516</td>
			<td>6&#173;-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell cell culture inserts</td>
			<td>Corning, Wiesbaden, Germany</td>
			<td>3450</td>
			<td>24mm inserts; 6-&#173;well plates; 0.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASYton</td>
			<td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td>
			<td>REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Air (DIN EN 12021)</td>
			<td>Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td>2290152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab155902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments + equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cell Counter</td>
			<td>Sch&#228;rfe System GmbH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation thermostat</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline RE 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX HyP - Hydraulic Press</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX insert sleeve</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)</td>
			<td>Cultex&#174; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULTEX supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)</td>
			<td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (large)</td>
			<td>Munktell &#38; Filtrak GmbH, Sachsen, Germany</td>
			<td>LP-050</td>
			<td>Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency &#62; 99,999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters (small)</td>
			<td>Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany</td>
			<td>9933-05-DQ</td>
			<td>Balston disposable filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pump</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td>Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser</td>
			<td>digital peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader Infinite M200 Pro</td>
			<td>Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vakuum pump</td>
			<td>KNF, Freiburg, Germany</td>
			<td>N86 KT.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V&#246;gtlin mass flow controller 0,2-10 l/min</td>
			<td>TrigasFI GmbH</td>
			<td>V&#246;gtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>LAUDA, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>Ecoline Staredition RE 104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface

Burada, ALI'de ekili insan akciğer hücrelerinin gazlara, partiküllere veya karmaşık atmosferlere (örn. sigara dumanı) homojen bir şekilde maruz kalmasını sağlayan özel olarak tasarlanmış modüler in vitro maruziyet sistemi sunarak gerçekçi fizyolojik insan alveolar bölgenin apikal yüzeyinin havaya maruz kalma. Lineer aerosol kılavuzlu sıralı pozlama modellerinin aksine, radyal akış sisteminin modüler tasarımı, test atmosferinin hücrelere sürekli üretimi ve taşınması için tüm gereksinimleri karşılar, homojen bir dağılım ve parçacıklar ve atmosferin sürekli kaldırılması. Bu maruz kalma yöntemi öncelikle havadaki parçacıklara hücrelerin maruz kalma için tasarlanmıştır, ancak aerosol üretim yöntemi ve maruziyet modüllerinin malzeme bağlı olarak sıvı aerosoller ve son derece toksik ve agresif gazların maruz kalma adapte edilebilir .
Yakın zamanda tamamlanan bir doğrulama çalışması çerçevesinde, bu maruziyet sistemi, havadaki parçacıkların akut pulmoner sitotoksisitesinin nitel değerlendirmesi için aktarılabilir, tekrarlanabilir ve öngörülebilir bir tarama yöntemi olarak kanıtlanmıştır, böylece normalde bu toksikolojik değerlendirmeyi sağlayacak hayvan deneylerini potansiyel olarak azaltmak veya değiştirmek.

CULTEX RFS, ALI'deki hücrelerin doğrudan ve homojen bir şekilde maruz kalmasını sağlayan özel olarak tasarlanmış modüler in vitro pozlama sistemidir. Eski bir ön doğrulama çalışması nda, bu maruz kalma sisteminin genel uygulanabilirliği ve aktarılabilirliği, stabilitesi ve tekrarlanabilirliği başarıyla gösterilmiştir. Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı tarafından finanse edilen yakın tarihli bir araştırma projesinde, maruz kalma sistemi başar?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface at JoVE.com

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Hava-sıvı arabiriminde (ALI) ekili insan akciğer hücrelerini teşhir ederek, akut pulmoner sitotoksisite ile ilgili havapartiküllerinin taranması ve izlenmesi için sağlam, aktarılabilir ve tahmine dayalı bir in vitro maruziyet sistemi salıyoruz.

Hava-Sıvı Arabiriminde Ekili İnsan Akciğer Hücrelerinin Açığa Çıkarılması yla Havadaki Partiküllerin Akut İnhalasyon Toksisitesinin Değerlendirilmesi

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Bu in vitro maruzkalma sistemi kullanarak ALI ekili insan akciğer hücreleri açığa tarafından akut pulmoner sitotoksisite ile ilgili hava parçacıklarının taranması hayvan deneylerini azaltmaya yardımcı olabilir. Bu maruz kalma sisteminin en büyük avantajı, homojen bir dağılıma yol açan radyal aerosol dağılım konsepti ve parçacıkların hücrelere konumlandırılmasıdır. Hücreleri tohumlamadan önce, altı kuyu plakaher kuyuya temperli büyüme orta 2,5 mililitre ekleyin.Hücre kültürünü, hücre içermeyen eklerin kuyuların içine dikkatlice yerleştirin ve her hücre kültürü eklemek için bir mililitre büyüme ortamı ekleyin. Plakaları 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte 30 dakika kuluçkaya yatırın. Hücrelerin tripsinizasyonundan sonra, 10 mililitre izotonik çözelti ile dolu bir bardakta hücre kültürünün 100 mikrolitresini seyreltin.Sallamadan bardağı yavaşça yatırın. Bir hücre sayacında, A549 hücrelerinin hücreye özgü ölçüm parametrelerini temel alan mililitre başına canlı hücre sayısını ve hücre canlılığını belirleyin. Plaka nın yumuşadıktan sonra, hücre kültürü içinde orta aspire ekler ve her hücre kültürü eklemek mililitre başına beşinci hücrelere üç kez 10 yoğunluğu ile A549 hücrelerinin bir mililitre tohum.Hücre süspansiyonuna hafif çesitli sallayarak ve kuluçkaya yatırarak 24 saat boyunca dağıtın. Basının ön tarafındaki zaman kontrolü ile basma süresini ayarlayın. Basınçlı hava vanası ile basınçlı hava beslemesini açın.Basının ön tarafındaki basınç regülatörü kullanarak, basınçlı hava basıncını yaklaşık iki bara ayarlayın. Çekmeceyi çekin, Basın düğmesine basın ve dijital basınç düğmesine basma baskısını okuyun. Madde kabını az miktarda test maddesi ile doldurun.Dalgıç madde kabına yerleştirin ve tozu konteynerde eşit olarak dağıtmak için hafifçe ileri geri çevirin. Madde kabını, pistonlu olarak çekmeceye yerleştirin ve Basın düğmesine basın. Çekmeceyi açın ve pistonu çıkarın.Kritik bir adım, kararlı partikül maruziyetleri sağlamak için madde kabı içindeki toz keke özel olarak sıkıştırılması gereken test maddelerinin preslenmesidir. Giriş adaptörlerini ve kondensrefleyi aerosol kılavuz modülünden çıkarın. Aerosol kılavuz modülündeki üç aerosol besleme deliklerini fişlerle ve örnekleme modülündeki orta besleme bağlantılarını sahte kapaklarla kapatın.Vakum hatlarını aerosol kılavuz modülünün tüp konektörüyle bağlayın. Modülü kapatmak ve akış kontrolörlerinin değerini ölçmek için el tekerleğini kullanın. Kapanıştan birkaç dakika sonra, değerler dakikada beş mililitrenin altına düşer.Aerosol jeneratör yazılımını başlatın. Madde kazıyıcı en düşük konumda değilse, Homing Modu düğmesine basın. Madde kabını preslenmiş test malzemesi ile madde kazıyıcının üzerine ters çevirin.Madde kabının camının öne dönük olduğundan emin olun. Kilitleme plakasını madde kabının üzerine yuvaya yerleştirin ve siyah vidayı sıkın. Özet Akışı ve Döndürme değerlerini istenilen ayarlarla değiştirin.Madde kazıyıcı preslenmiş madde yakın olana kadar madde konteyner ile slayt aşağı itmek için aşağı oklar kullanın. Basınçlı hava kaynağını aerosol jeneratörüne kütle akış kontrolörüne dokunarak açın ve Başlat düğmesine tıklayarak aerosol üretimini başlatın. Uzun bekleme sürelerinden kaçınmak için besleme hızını saatte 15 ila 20 milimetreye ayarlayın.Elutriator cam tüp arkasından aşağıdan konumlandırılmış küçük bir el feneri ile ince toz bulutu gözlemleyerek doğru parçacık üretimi kontrol edin. Önceden ısıtılmış pozlama ortamıile orta kaynağı çalıştırın ve modül açıkken alt borular kapsana kadar örnekleme modüllerini doldurun. Pozlama modülüne kör hücre kültürü ekler, alt borular orta ile kaplı ve kesici uçların alt tarafı orta ile temas edene kadar pozlama ortamı aşağı pompalayın.Aerosol jeneratörünü çalıştırın, pozlama modülünü kapatın ve pozlama modülünü aerosol jeneratörün pozlama modülü çıkışına bağlayın. Kurşun süresinden 30 dakika sonra, elutriatörün pozlama modülü çıkışını kauçuk bir fiş ile kapatın ve kör kesici uçları çıkarın. Alt borular orta ile kapsana kadar pozlama ortamını yeniden doldurun.Cımbız yardımıyla altı kuyu plakasından hücre kültürü ekler çıkarın. Hücre kültüründen büyüme ortamını dikkatlice dökün, uçları devirerek sokulur ve artık sıvıyı aspire etmek ve atmak için bir pipet kullanın. Kesici uçları hem pozlama hem de temiz hava modüllerinin pozlama odalarına yerleştirin.Modülleri kapatın ve pozlama modülünü aerosol jeneratörün pozlama modülü çıkışına ve temiz hava modülünü aynı anda taşıyıcı gaz kaynağına bağlayarak pozlama deneylerine başlayın. Deney tamamlandıktan sonra pozlama ve temiz hava modüllerini kapatın ve pozlama modülü çıkışını kapatın. Dur düğmesine tıklayarak basınçlı hava beslemesini ve aerosol jeneratörü durdurun.Pozlama ve temiz hava modüllerini açın ve hücre kültürünü nisbeten kuluçka sonrası altı kuyu plakasına aktarmak için cımbız kullanın. Altı kuyu plakası ve maruz kalmamış hücre kültürü ekler, 37 santigrat derece ve hava sıvı arayüzünde% 5 karbondioksit 24 saat boyunca kuluçka. Maruz kaldıktan 24 saat sonra, hücre kültürünü yeni hazırlanmış altı kuyu plakaya yerleştirin.Her hücre kültürü eklemek için taze hazırlanmış WST1 çözeltisi bir mililitre ekleyin. Çözeltiyi hücrelerüzerinde homojen bir şekilde dağıtmak için plakaları dikkatlice sallayın. Hücre kültürü ile altı kuyu plakaları kuluçka 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit bir saat için ekler.Bundan sonra, her altı kuyu plakasından 96 kuyu plakasına triplicates supernatant 100 mikrolitre aktarın. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, 650 nanometre referans dalga boyu ile 450 nanometre olarak emiciölçün. CULTEX RFS, hücrelerin havadaki parçacıklara doğrudan ve homojen bir şekilde maruz kalmasını sağlayan özel olarak tasarlanmış modüler in vitro pozlama sistemidir.Hücrelerin temiz havaya maruz kalma zaman içinde hücre canlılığı hiçbir azalma yol açar. Maruz kalma sistemi başarıyla doğrulandı ve test edilen bileşiklerin akut inhalasyon tehlikeleri için bir tahmin modeli olarak kurulmuştur. A549 hücrelerinin hiçbir, orta veya güçlü toksisite göstermeyen farklı test maddelerine maruz kalması.Lütfen kuluçka süreleri, partikül oluşturmanın kurşun zamanı ve partikül biriktirme süreleri olan zaman dilimlerini kesinlikle sakladığından emin olun. Bu pozlama yöntemi öncelikle hücrelerin partikül maruziyeti için tasarlanmıştır, ancak aerosol üretim yöntemi uyarlayarak sıvı aerosoller ve gazların maruz kalma uzatılabilir. Bu tarama yöntemi in vitro akut inhalasyon toksisitesi ile ilgili inhalat parçacıkların nitel değerlendirilmesi sağlar, böylece normalde bu toksikolojik değerlendirme sağlayacak hayvan testleri azaltarak.Toksik test maddeleri ile çalışan son derece tehlikeli olabilir ve bu tür bileşikleri kullanırken her zaman eldiven, maske takmak gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Hava Sıvı Arabirimi Fare Solunum Epitel Hücreleri ve Deneysel sigara dumanına maruz kalma izolasyonu

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Sol ön inen arter ligasyonu ile Miyokard İskemi-reperfüzyon Hasarı bir fare modeli

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Çoklu-parametre floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma İnsan lenfatik endotel hücreleri İzolasyonu

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Bir fare Modeli Kullanılarak Akut Radyasyondan Bağlı Cilt zehirlilik Kantitatif Değerlendirme optik tayf Diffüz

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Akut Miyokard İnfarktüsü bir Domuz Modeli İlköğretim Sonuç Değerlendirmesi

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Akut Akciğer Hasarı Açık Trakeostomi Gastrik Asit Aspirasyon Fare Modeli Maksimal Akut Ölümcül olmayan Akciğer Hasarı Sonuçlar

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 Manyetik Rezonans Spektroskopisi: Ölçme için Aracı<em&gt; İn Vivo</emİnsan İskelet Kası içinde&gt; Mitokondriyal Oksidatif Fosforilasyon Kapasitesi

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Doğrudan Intratracheal Lipopolysaccharide Instilasyon ile farelerde akut akciğer hasarının İndükleme

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Oral Health Assessment by Lay Personnel for Older Adults

Yaşlı Yetişkinler için Lay Personel tarafından Ağız Sağlığı Değerlendirmesi

Oral health is an often-undervalued contributor to overall health. The literature, however, underscores the myriad of systemic diseases influenced by oral ...