Name: whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae at JoVE.com

التمويل من المعاهد القومية للصحة منحة 8P20GM103436 14.

تمت الموافقة على إجراءات العمل مع البالغين والمستثرين من تربية سمك الحمار الوحشي الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسي للحيوانات في جامعة ولاية موراي.
1. جمع الأجنة والتثبيت
<ol><li>إعداد خزانات التفريخ عن طريق وضع أزواج الجنس المختلط حمار وحشي ال...

<ol>
	<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+and+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+and+efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+the+CRISPR/Cas9+system.">Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).</li><li>van der Ploeg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+nucleic+acid+research+during+the+twentieth+century.">Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century.</a> European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).</li><li>Marrack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+Antibodies.">Nature of Antibodies.</a> Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Lopez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+in+situ+Hybridization/Immunohistochemistry+(ISH/IH)+on+Free-floating+Vibratome+Tissue+Sections.">Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections.</a> Bio-protocol. 4 (18), (2014).</li><li>Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glucocorticoid+receptor+immunoreactivity+and+mRNA+in+the+rat+brain:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).</li><li>Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+combined+immunohistochemistry+and+in-situ+hybridization+in+fresh-frozen,+cryocut+mouse+brain+sections.">A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections.</a> Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).</li><li>Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+and+duodenal+homeobox-1+nuclear+localization+is+regulated+by+glucose+in+dispersed+rat+islets+but+not+in+insulin-secreting+cell+lines.">Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines.</a> Islets. 6 (4), e982376 (2014).</li><li>Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glis3+is+associated+with+primary+cilia+and+Wwtr1/TAZ+and+implicated+in+polycystic+kidney+disease.">Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).</li><li>Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+expression+and+colocalization+of+somatostatin,+carboxypeptidase-E+and+prohormone+convertases+1+and+2+in+rat+brain.">Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain.</a> Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+preparation+for+observation+and+analysis+of+zebrafish+embryo+specimens+stained+by+whole+mount+in+situ+hybridization.">Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li><li>Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine+and+calcium+signalling+regulates+muscle+fibre+formation+in+the+zebrafish+embryo.">Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo.</a> Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).</li><li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+of+muscle+acetylcholine+receptors+requires+motoneurons+in+live+embryos,+but+not+in+cell+culture.">Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture.</a> The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).</li><li>Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotransmitter-receptor+matching+at+the+neuromuscular+junction.">Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).</li><li>Brunelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+reinnervation+through+peripheral+nerve+graft+dictates+assembly+of+glutamatergic+synapses+at+rat+skeletal+muscle.">Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).</li><li>Hans, F., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+phosphorylation+and+cell+division.">Histone H3 phosphorylation and cell division.</a> Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).</li><li>Yee, N. S., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+pancreatic+cancer+research.">Zebrafish as a model for pancreatic cancer research.</a> Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).</li><li>Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+use+of+zebrafish+to+model+metabolic+disease.">The emerging use of zebrafish to model metabolic disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).</li><li>Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+utility+of+zebrafish+models+of+neurological+and+neuropsychiatric+disorders:+A+critical+review.">The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review.</a> Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li><li>Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+as+a+weak+activator+of+aryl+hydrocarbon+receptor+inhibiting+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced+CYP1A1+transcription+in+zebrafish+embryo.">Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo.</a> Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS one. 6 (8), e22991 (2011).</li><li>Inoue, D., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+for+all--a+highly+efficient+and+versatile+method+for+fluorescent+immunostaining+in+fish+embryos.">One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos.</a> PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).</li></ol>

المناعة هي أداة متعددة الاستخدامات التي يمكن استخدامها لتوصيف التعبير المكاني والزماني من أي بروتين تقريبا من الفائدة في كائن حي. يستخدم الكيمياء المناعية على مجموعة واسعة من الأنسجة والكائنات الحية النموذجية. وقد تم تحسين هذا البروتوكول للاستخدام في حمار وحشي. قد تتطلب الكيمياء المناع?...

ظهر سمك الحمار الوحشي(Danio rerio)كنموذج قوي لدراسة العمليات البيولوجية لعدة أسباب بما في ذلك وقت الجيل القصير ، والتطور السريع ، وسهولة التقنيات الوراثية. ونتيجة لذلك، تستخدم عادة حمار وحشي في المستويات العالية من الإنتاجية الصغيرة الجزيئات شاشات للبحوث السمية واكتشاف المخدرات. كما أن سمك الحمار الوحشي هو نموذج جذاب لدراسة عمليات النمو بالنظر إلى أن أنثى واحدة يمكنها إنتاج 50-300 بيضة بشكل روتيني في كل مرة، وأن الأجنة الواضحة بصريًا تتطور خارجيًا مما يسمح بالتصور الفعال لعمليات النمو. ومع ذلك، اعتمدت الأبحاث المبكرة في الغالب على الشاشات الوراثية الأمامية باستخدام N-إيثيل-ن-نيتروسوريا (ENU) أو غيرها من المغيرات بسبب التحديات في إنشاء تقنيات وراثية عكسية. منذ ما يقرب من عقدين من الزمان ، تم استخدام موربولينو لأول مرة في حمار وحشي لضرب الجينات المستهدفة1. مورفولينوس هي قلة القلة المضادة للشعور الصغيرة التي تمنع ترجمة مرنا المستهدفة بعد الحقن المجهري في الجنين في مرحلة مبكرة من النمو. نقطة ضعف رئيسية من موربولينوس هو أنها مخففة كما تنقسم الخلايا وتفقد فعاليتها عموما من قبل 72 ساعة بعد الإخصاب (hpf). في حين أن morpholinos لا تزال أداة قوية لتعطيل الجينات حمار وحشي، النسخ المنشط مثل تأثير nucleases (TALENs)، nucleases الزنك الإصبع (ZFNs)، ومتجمعة بانتظام يكرر palindromic قصيرة (CRISPRs) يتم استخدامها في الآونة الأخيرة لاستهداف الجينوم حمار وحشي مباشرة2،3. وقد أنشأت هذه الاستراتيجيات الجينية العكسية، إلى جانب علم الوراثة إلى الأمام وشاشات الإنتاجية العالية، سمك الحمار الوحشي كنموذج قوي لدراسة التعبير الجيني والوظيفة.
تتطلب القدرة على دراسة وظيفة الجينات بشكل عام تقييمًا للتوزيع المكاني والزمني للتعبير عن الجينات أو المنتجات الجينية. الأسلوبان الأكثر استخداماً لتصور أنماط التعبير هذه أثناء التطوير المبكر هما التهجين في الموقع (ISH) وكيمياء الهيستوكيميائية الكاملة (IHC). في الموقع تم تطوير التهجين لأول مرة في عام 1969 ويعتمد على استخدام مسابير الحمض النووي الريبي المضادة للتحسس للكشف عن تعبير مرنا في كائن حي4. في المقابل، يتم استخدام الأجسام المضادة المسماة في الكيمياء المناعية لتصور التعبير البروتيني. تعود فكرة وضع العلامات على البروتينات للكشف عنها إلىعام 1930 و5 وتم نشر أول تجربة للسنة الدولية للخدمات الإنسانية في عام 1941 عندما تم استخدام الأجسام المضادة المسماة FITC للكشف عن البكتيريا المسببة للأمراض في الأنسجة المصابة6. وقد تطورت ISH وIHC بشكل ملحوظ على مدى العقود اللاحقة ، وتستخدم الآن على حد سواء بشكل روتيني في مختبر البحوث الجزيئية والتشخيصية7،8،9،10،11. في حين أن كلا التقنيتين لها مزايا وعيوب ، تقدم المدينة العالمية للخدمات الإنسانية العديد من الفوائد على ISH. عمليا ، هو أقل بكثير من الوقت المستهلكة من ISH وعموما أقل تكلفة اعتمادا على تكلفة الأجسام المضادة الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، التعبير مرنا ليست دائما مقياس موثوق به من التعبير البروتين كما ثبت في الفئران والبشر أن حوالي ثلث فقط من البروتين وفرة الاختلاف يمكن تفسيره من قبل وفرة مرنا12. لهذا السبب، تعد المدينة العالمية للخدمات الإنسانية مكملاً هاماً لتأكيد بيانات ISH، عندما يكون ذلك ممكناً. وأخيراً، يمكن أن توفر المدينة العالمية للخدمات الإنسانية بيانات دون خلوية وبيانات توطين مشترك لا يمكن تحديدها بواسطة ISH13و14و15. هنا ، نصف طريقة خطوة بخطوة للكشف الموثوق عن البروتينات عن طريق الكيمياء المناعية في أجنة ويرقات حمار وحشي جبل كامل. الهدف من هذه التقنية هو تحديد التعبير المكاني والزماني لبروتين مهم في الجنين بأكمله. تستخدم هذه التقنية الأجسام المضادة الأولية الخاصة بالمستضدات والأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلور. البروتوكول قابل للتكيف بسهولة للاستخدام على أقسام الأنسجة المثبتة على الشرائح وللاستخدام مع ركائز كروموجينية بدلاً من الفلورسينس. باستخدام هذا البروتوكول, ونحن نثبت أن تطوير حمار وحشي العضلات الهيكل العظمي يعبر عن مستقبلات الغلوتامات ionotropic, بالإضافة إلى مستقبلات أستيل. NMDA من نوع الغلوتامات مستقبلات الوحدات الفرعية يمكن الكشف عنها على العضلات الطولية في 23 hpf.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil, heavy duty</td>
			<td>Kirkland</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NMDA antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>05-598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABN832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate [Ca(NO3)2]</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Sally Hanson</td>
			<td></td>
			<td>Any nail polish or hardener may be subsituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression (concavity) slide</td>
			<td>Electron Miscroscopy Sciences</td>
			<td>71878-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1855920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, Danieau, 30%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, E2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating tube holder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>59744015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence compound microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>M165-FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 18 x 18</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22 x 60</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-050-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humid chamber with lid</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M920-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunedge pap pen</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins, size 00</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>5213323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4 &#183; 7H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh strainer</td>
			<td>Oneida</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-tube cap lock</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>145062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Toastmaster</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S02L1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBTriton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1% TritonX-100 in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (glass)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3160100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (plastic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>207250250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 1x</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1x made from 10x stock diluted in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P250-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spawning tank with lid and insert</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperBlock PBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost + slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue gel</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, ultrapure/double distilled</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W2-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae

المناعة هي تقنية تستخدم على نطاق واسع لاستكشاف التعبير عن البروتين وتوطينه خلال كل من حالات النمو والأمراض الطبيعية. على الرغم من أن العديد من بروتوكولات الكيمياء المناعية قد تم تحسينها لأنسجة الثدييات وأقسام الأنسجة ، فإن هذه البروتوكولات غالبًا ما تتطلب التعديل والتحسين للكائنات النموذجية غير الثديية. تستخدم سمكة الحمار الوحشي بشكل متزايد كنظام نموذجي في البحوث الأساسية والطبية الحيوية والانتقالية للتحقيق في الآليات الجزيئية والوراثية والبيولوجية للخلايا في عمليات التطوير. حمار وحشي تقدم العديد من المزايا كنظام نموذجي ولكن أيضا تتطلب تقنيات معدلة للكشف عن البروتين الأمثل. هنا ، نقدم بروتوكولنا لكامل جبل الفلورالكيمياء المناعية في أجنة حمار وحشي واليرقات. ويصف هذا البروتوكول بالإضافة إلى ذلك عدة استراتيجيات مختلفة للتركيب يمكن استخدامها ونظرة عامة على المزايا والعيوب التي توفرها كل استراتيجية. كما نصف أيضًا التعديلات المدخلة على هذا البروتوكول للسماح بالكشف عن ركائز الكروموجين في أنسجة اليتصاعد الكاملة والكشف عن الفلورسينس في أنسجة اليرقات المقطعة. ينطبق هذا البروتوكول بشكل عام على دراسة العديد من مراحل النمو والهياكل الجنينية.

كامل جبل المناعةhistochemistry يستخدم الأجسام المضادة للكشف عن النمط المكاني للتعبير البروتين في الحيوان سليمة. سير العمل الأساسي للكيمياء المناعية (الموضحة في الشكل 1)ينطوي على تربية سمك الحمار الوحشي ، ورفع وإعداد الأجنة ، ومنع المستضدات غير محددة ، وذلك باس?...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae at JoVE.com

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

هنا ، نقدم بروتوكولًا للكشف عن الأجسام المضادة الفلورية بوساطة البروتينات في الاستعدادات الكاملة لأجنة ويرقات سمك الحمار الوحشي.

كامل جبل المناعة الكيمياء في الأجنة حمار وحشي واليرقات

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

إن الكيمياء المناعية الكاملة هي تقنية سريعة وبسيطة نسبيًا تسمح بالملاحظة المكانية والزمانية للبروتينات مباشرة في الأنسجة أو الكائن الحي باستخدام أجسام مضادة تحمل علامات. فائدة هذه التقنية هي أنها تسمح لتلطيخ نسيج سليم أو كائن حي دون الحاجة إلى القسم الأول ويمكن استخدام المجهر الناسج لتوليد تمثيل ثلاثي الأبعاد لنمط التعبير البروتيني. يستخدم علم الكيمياء المناعية على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية لفهم المسببات والآليات الجزيئية التي تكمن وراء المرض.كما أنها أداة تشخيصية قيمة لتحديد الأورام في العينات المرضية. للبدء، إعداد خزانات التفريخ مليئة بالماء النظام ومع شبكة أو بطانة مشقوق في مكان. وضع حمار وحشي الكبار مختلطة أزواج الجنس في مجموعات في الدبابات بين عشية وضحاها.استخدم دورة ضوئية/داكنة لمدة 14 ساعة/10 ساعات مع إضاءة 9 .m. في صباح اليوم التالي، مع الأضواء على، وتغيير مياه خزان تفريخ مع المياه النظام العذب لإزالة البراز. مرة واحدة يتم وضع البيض، والعودة الكبار إلى الدبابات المنزل.جمع البيض عن طريق رسمها باستخدام ماصة نقل. نقل 50 بيضة إلى كل طبق بيتري مليئة في منتصف الطريق مع متوسط الجنين. إزالة أي بيض مبهمة وغائمة التي هي ميتة أو فشل في تقسيم.احتضان طبق البيض في 28.5 درجة مئوية حتى 23 ساعة بعد الإخصاب. إذا كانت الأجنة أكبر من 24 ساعة بعد الإخصاب، مع ماصة نقل الأجنة إلى 200 وحدة حرارية بريطانية ميكرومولار في متوسط الجنين لمنع تكوين الميلانوجين. تحت مجهر ستيريو، اغفور الأجنة غير المهزّم باستخدام ملقط طرف فائقة الدقة.باستخدام ماصات باستور المصقولة بالنيران لتقليل الضرر ، قم بنقلها إلى أطباق بيتري زجاجية أو بلاستيكية مغلفة بنسبة 1-2٪agarose المذابة في وسط الجنين. ثم نقل الأجنة إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة بلاستيكية أو مصقولة على النار. إزالة متوسط الجنين مع ميكروسيبيت.اتركي سائلاً كافياً فقط لتغطية الأجنة فقط. إصلاح الأجنة في 4٪ PFA لمدة ساعة إلى ساعتين مع هزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بغسل الأجنة ثلاث مرات في برنامج PBS 1X و1٪ PBTriton لمدة خمس دقائق.استخدم الأجنة على الفور أو قم بتخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. للتخزين على المدى الطويل، وتجفيف وتخزين الأجنة في الميثانول 100٪ في ناقص 20 درجة مئوية. لإعادة هيدرات الأجنة، قم بإجراء حضانات متسلسلة خمس دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة مع انخفاض كميات الميثانول وبرنامج تلفزيوني وPPTriton للغسيل النهائي.المضي قدما في إعداد الجنين وفقا للمخطوطة. حدد حل حظر مطابقة الأنواع المضيفة للأجسام المضادة الثانوية، على سبيل المثال مصل الماعز 10٪ في PBTriton مع أو بدون ملليغرام لكل ملليلتر من BSA. إضافة 0.5 ملليلتر من محلول الحجب في الأنبوب الذي يحتوي على الجنين ووضع الأنبوب على الروك لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة.ثم احتضان الجنين في الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الحجب وPPTriton بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية أثناء الهزاز. في الصباح، يغسل الجنين خمس مرات في PBTriton لمدة 10 دقائق في كل درجة حرارة الغرفة أثناء هزاز. ثم حدد الأجسام المضادة الثانوية على أساس الأنواع المضيفة للجسم المضاد الأساسي والطول الموجي المطلوب عند 488 نانومتر.أضف الجسم المضاد الثانوي المخفف في محلول الحجب في الأنبوب الذي يحتوي على الجنين. تغطية أنبوب مع رقائق الألومنيوم واحتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في حين هزاز. بعد ذلك ، قم بغسل الأجنة ثلاث مرات في PBTriton لمدة 10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة أثناء تغطيتها برقائق الألومنيوم وهزاز.مع ماصة، نقل الأجنة إلى محلول الجلسرين 50٪ في برنامج تلفزيوني على سرير من 2٪ agarose في متوسط الجنين. لإزالة صفار، نقل 200 ميكرولترات من 1X PBS إلى شريحة الاكتئاب أو شريحة الزجاج العادي. استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل جنين أو أكثر إلى قطرات PBS.استخدام ملقط فائقة غرامة ودبابيس مزدوجة صفر دبابيس الحشرات لكسر صفار وكشط جدا بلطف حبيبات صفار من السطح البطني للجنين. إزالة حبيبات صفار وتجديد مع برنامج تلفزيوني حسب الحاجة. بعد التركيب، ضع العينة على مرحلة المجهر.حدد موقع المنطقة ذات الأهمية عن طريق اختيار مثال مشرق نسبيا. ضبط التعرض للكاميرا وكسب بحيث إشارة مشرقة بما فيه الكفاية دون تشبع. عند المقارنة بين الأجنة التجريبية التي تحمل علامات الأجسام المضادة والتحكم في الأجنة المضادة، استخدم نفس إعدادات التعرض.هذا البروتوكول من كامل جبل المناعة هيستوتشيستريا أداة قيمة لدراسة التعبير عن البروتين المكاني والزماني باستخدام تطوير سمك الحمار الوحشي. كشفت الوحدة الفرعية GluN1 من مستقبلات الغلوتامات من نوع NMDA عن التعبير عن وحدات فرعية لمستقبلات الغلوتامات في جميع أنحاء تطوير عضلات الحمار الوحشي في 23 ساعة بعد الإخصاب. تم تركيب أجزاء مجمدة من أجنة الإخصاب لمدة 72 ساعة على الشرائح والمصابة بالمناعة للفوسفو-H3، وهي علامة على الخلايا المتكاثرة.وأعربت عدة خلايا عن فوسفو-H3 وكان التعبير الأكثر بروزا في المناطق البطينية. كشف جسم مضاد التحكم في IgG الماوس واستبعاد الأجسام المضادة الأولية مستوى منخفض من التعبير غير محددة. من المهم تحديد حلول الحجب المناسبة والأجسام المضادة الثانوية استنادًا إلى الأنواع المضادة الرئيسية المضيفة لضمان الكشف عن البقع غير المحددة وتقليلها.يجب التحقق من علم المناعة لضمان أن الإشارة التي لوحظت هي في الواقع البروتين من الفائدة. وعادة ما تنطوي تجارب المتابعة على استخدام كائنات معدلة وراثيا أو بيئيا. تمنح الكيمياء المناعية الباحثين القدرة على مراقبة البروتينات في الموقع ، مما يسرع إلى حد كبير فهمنا للعديد من الأنظمة في كل من البيولوجيا الأساسية والتطبيقية خاصة أثناء نمو الجنين.الميثانول والفورمالديهايد سامان وينبغي التعامل مع بعناية. وينبغي جمع النفايات والتخلص منها وفقاً للإجراءات المؤسسية.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

متعددة الهدف اللونية الجامع جبل<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين لمقارنة الجينات مجالات التعبير في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

طرق لفحص الليمفاوية الغدة وHemocytes في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

بيوسنسينغ موتور الخلايا العصبية الغشاء المحتملة في الأجنة الزرد الحية

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

تصور الخلايا مولتيسيلياتيد في الزرد من خلال بروتوكول مجتمعة في الموقع كله جبل فلوري التهجين والفلوره

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

طريقه تركيب طبقات لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة بفواصل زمنيه طويلة

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

التهجين الكامل في الموقع في أجنة حمار وحشي وأنبوب تشكيل اساي في iPSC-ECs لدراسة دور Endoglin في التنمية الوعائية

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

التصور والتحليل من الشرايين القوس البلعوم ية باستخدام كامل جبل الكيمياء المناعية وإعادة الإعمار 3D

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...