Name: whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae at JoVE.com

Finansiering fra NIH tilskud 8P20GM103436 14.

Procedurerne for arbejde med zebrafisk avl voksne og embryoner, der er beskrevet i denne protokol blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee på Murray State University.
1. Indsamling og fiksering af embryoner
<ol><li>Forbered gydetanke ved at placere voksne zebrafisk blandet køn par eller grupper i tanke med en maske eller slidset liner fyldt med systemvand natten over.</li>
	<li>Ved lys tændt, ændre gydetank vand til frisk system vand for at fjerne afføring. Brug en 1...

<ol>
	<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+and+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+and+efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+the+CRISPR/Cas9+system.">Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).</li><li>van der Ploeg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+nucleic+acid+research+during+the+twentieth+century.">Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century.</a> European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).</li><li>Marrack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+Antibodies.">Nature of Antibodies.</a> Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Lopez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+in+situ+Hybridization/Immunohistochemistry+(ISH/IH)+on+Free-floating+Vibratome+Tissue+Sections.">Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections.</a> Bio-protocol. 4 (18), (2014).</li><li>Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glucocorticoid+receptor+immunoreactivity+and+mRNA+in+the+rat+brain:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).</li><li>Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+combined+immunohistochemistry+and+in-situ+hybridization+in+fresh-frozen,+cryocut+mouse+brain+sections.">A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections.</a> Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).</li><li>Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+and+duodenal+homeobox-1+nuclear+localization+is+regulated+by+glucose+in+dispersed+rat+islets+but+not+in+insulin-secreting+cell+lines.">Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines.</a> Islets. 6 (4), e982376 (2014).</li><li>Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glis3+is+associated+with+primary+cilia+and+Wwtr1/TAZ+and+implicated+in+polycystic+kidney+disease.">Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).</li><li>Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+expression+and+colocalization+of+somatostatin,+carboxypeptidase-E+and+prohormone+convertases+1+and+2+in+rat+brain.">Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain.</a> Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+preparation+for+observation+and+analysis+of+zebrafish+embryo+specimens+stained+by+whole+mount+in+situ+hybridization.">Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li><li>Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine+and+calcium+signalling+regulates+muscle+fibre+formation+in+the+zebrafish+embryo.">Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo.</a> Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).</li><li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+of+muscle+acetylcholine+receptors+requires+motoneurons+in+live+embryos,+but+not+in+cell+culture.">Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture.</a> The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).</li><li>Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotransmitter-receptor+matching+at+the+neuromuscular+junction.">Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).</li><li>Brunelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+reinnervation+through+peripheral+nerve+graft+dictates+assembly+of+glutamatergic+synapses+at+rat+skeletal+muscle.">Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).</li><li>Hans, F., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+phosphorylation+and+cell+division.">Histone H3 phosphorylation and cell division.</a> Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).</li><li>Yee, N. S., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+pancreatic+cancer+research.">Zebrafish as a model for pancreatic cancer research.</a> Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).</li><li>Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+use+of+zebrafish+to+model+metabolic+disease.">The emerging use of zebrafish to model metabolic disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).</li><li>Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+utility+of+zebrafish+models+of+neurological+and+neuropsychiatric+disorders:+A+critical+review.">The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review.</a> Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li><li>Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+as+a+weak+activator+of+aryl+hydrocarbon+receptor+inhibiting+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced+CYP1A1+transcription+in+zebrafish+embryo.">Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo.</a> Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS one. 6 (8), e22991 (2011).</li><li>Inoue, D., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+for+all--a+highly+efficient+and+versatile+method+for+fluorescent+immunostaining+in+fish+embryos.">One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos.</a> PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).</li></ol>

Immunhistokemi er et alsidigt værktøj, der kan bruges til at karakterisere spatio-tidsmæssige udtryk for stort set ethvert protein af interesse i en organisme. Immunhistokemi anvendes på en bred vifte af væv og model organismer. Denne protokol er optimeret til brug i zebrafisk. Immunhistokemi hos forskellige arter kan kræve forskellige fikserings- og håndteringsteknikker, blokeringsopløsninger afhængigt af arter og tilstedeværelsen af endogenperoxidaser og inkubationstider på grund af vævs tykkelse og sammens...

Zebrafisken (Danio rerio) har vist sig som en stærk model for studiet af biologiske processer af flere årsager, herunder kort produktionstid, hurtig udvikling og faciliteter over for genetiske teknikker. Som et resultat, zebrafisk er almindeligt anvendt i høj gennemløb små molekyle skærme til toksikologisk forskning og narkotika opdagelse. Zebrafisk er også en attraktiv model for studiet af udviklingsprocesser, da en enkelt kvinde rutinemæssigt kan producere 50-300 æg ad gangen, og de optisk klare embryoner udvikler sig eksternt, hvilket giver mulighed for effektiv visualisering af udviklingsprocesser. Men tidlig forskning var mest baseret på fremadrettede genetiske skærme ved hjælp af N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) eller andre mutagener på grund af udfordringer i etableringen af omvendt genetiske teknikker. Omkring to årtier siden, morpholinos blev første gang brugt i zebrafisk til knockdown målrettede gener1. Morpholinos er små antisense oligonucleotider, der hæmmer oversættelsen af mål mRNA efter mikroinjektion til et foster på et tidligt udviklingsstadie. En stor svaghed ved morfoinos er, at de er fortyndet som cellerne kløft og generelt mister effektivitet med 72 timer efter-befrugtning (hpf). Mens morfoinos fortsat er et kraftfuldt værktøj til zebrafisk genforstyrrelser, transskription aktivator-lignende effector nucleases (TALENs), zink-finger nucleases (ZFNs), og grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromic gentagelser (CRISPRs) er for nylig bruges til direkte at målrette zebrafisk genom2,3. Disse omvendte genetiske strategier, i kombination med fremgenetik og høj gennemløb skærme, har etableret zebrafisk som en kraftfuld model til at studere genekspression og funktion.
Evnen til at studere genfunktion kræver generelt en evaluering af den spatio-tidsmæssige fordeling af gen- eller genproduktekspression. De to mest almindeligt anvendte teknikker til at visualisere sådanne udtryksmønstre under tidlig udvikling er in situ hybridisering (ISH) og hele mount immunhistokemi (IHC). In situ hybridisering blev først udviklet i 1969 og er afhængig af brugen af mærket antisense RNA sonder til at detektere mRNA udtryk i en organisme4. I modsætning hertil anvendes mærkede antistoffer i immunhistokemi til at visualisere proteinekspression. Ideen om mærkning af proteiner til påvisning går tilbage til 1930'erne5 og det første IHC-eksperiment blev offentliggjort i 1941, da FITC-mærkede antistoffer blev brugt til at detektere patogene bakterier i inficeret væv6. ISH og IHC har udviklet sig og forbedret betydeligt i de efterfølgende årtier og anvendes nu begge rutinemæssigt i det molekylære og diagnostiske forskningslaboratorium7,8,9,10,11. Mens begge teknikker har fordele og ulemper, IHC tilbyder flere fordele i forhold til ISH. Praktisk, IHC er langt mindre tidskrævende end ISH og er generelt billigere afhængigt af omkostningerne ved den primære antistof. Desuden er mRNA-udtryk ikke altid en pålidelig metrisk proteinekspression, da det er blevet påvist hos mus og mennesker, at kun omkring en tredjedel af proteintæthedsvariationen kan forklares ved mRNA-tæthed12. Af denne grund, IHC er et vigtigt supplement til at bekræfte ISH data, når det er muligt. Endelig kan IHC levere subcellulære og co-lokaliseringsdata , der ikke kan bestemmes af ISH13,14,15. Her beskriver vi en trinvis metode til pålideligt at opdage proteiner ved immunhistokemi i hele mount zebrafisk embryoner og larver. Formålet med denne teknik er at bestemme det rumlige og tidsmæssige udtryk for et protein af interesse for hele fosteret. Denne teknologi anvender antigenspecifikke primære antistoffer og fluorescerende mærkede sekundære antistoffer. Protokollen kan let tilpasses til brug på glidemonterede vævssektioner og til brug med kromoogenesubstrater i stedet for fluorescens. Ved hjælp af denne protokol, Vi viser, at udvikle zebrafisk skeletmuskulatur udtrykker ionotropic glutamat receptorer, ud over acetylcholin receptorer. NMDA-type glutamat receptor underenheder kan påvises på langsgående muskel på 23 hpf.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil, heavy duty</td>
			<td>Kirkland</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NMDA antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>05-598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABN832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate [Ca(NO3)2]</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Sally Hanson</td>
			<td></td>
			<td>Any nail polish or hardener may be subsituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression (concavity) slide</td>
			<td>Electron Miscroscopy Sciences</td>
			<td>71878-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1855920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, Danieau, 30%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, E2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating tube holder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>59744015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence compound microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>M165-FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 18 x 18</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22 x 60</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-050-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humid chamber with lid</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M920-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunedge pap pen</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins, size 00</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>5213323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4 &#183; 7H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh strainer</td>
			<td>Oneida</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-tube cap lock</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>145062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Toastmaster</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S02L1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBTriton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1% TritonX-100 in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (glass)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3160100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (plastic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>207250250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 1x</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1x made from 10x stock diluted in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P250-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spawning tank with lid and insert</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperBlock PBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost + slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue gel</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, ultrapure/double distilled</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W2-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae

Immunhistokemi er en udbredt teknik til at udforske protein udtryk og lokalisering under både normal udviklingsmæssige og sygdomstilstande. Selv om mange immunhistokemi protokoller er blevet optimeret til pattedyr væv og væv sektioner, disse protokoller kræver ofte ændring og optimering for ikke-pattedyr model organismer. Zebrafisk bruges i stigende grad som et modelsystem inden for grundlæggende, biomedicinsk og translationel forskning for at undersøge de molekylære, genetiske og cellebiologiske mekanismer i udviklingsprocesser. Zebrafisk tilbyder mange fordele som modelsystem, men kræver også modificerede teknikker for optimal proteindetektion. Her leverer vi vores protokol for hel-mount fluorescens immunhistokemi i zebrafisk embryoner og larver. Denne protokol beskriver desuden flere forskellige monteringsstrategier, der kan anvendes, og en oversigt over de fordele og ulemper, som hver strategi giver. Vi beskriver også ændringer af denne protokol for at gøre det muligt at påvise kromogene substrater i hele mount væv og fluorescens detektion i opdelt larvevæv. Denne protokol finder stort set anvendelse på studiet af mange udviklingsstadier og embryonale strukturer.

Hele mount immunhistokemi bruger antistoffer til at detektere det rumlige mønster af protein udtryk i intakt e-dyr. Den grundlæggende arbejdsgang for immunhistokemi (afbildet i figur 1) omfatter avl af zebrafisk, opdræt og forberedelse af embryoner, blokering af ikke-specifikke antigener, brug af et antigenspecifikt primært antistof til at målrette proteinet af interesse, detektere, at primære antistof med et mærket sekundært antistof, montering af pr...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae at JoVE.com

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Her præsenterer vi en protokol for fluorescerende antistofmedieret påvisning af proteiner i hele præparater af zebrafiskembryoner og larver.

Hele Mount Immunhistokemi i Zebrafish Embryoner og Larver

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Hele mount immunohistochemistry er en forholdsvis hurtig og enkel teknik, der giver mulighed for rumlig og tidsmæssig observation af proteiner direkte i et væv eller organisme ved hjælp af mærkede antistoffer. Nytten af denne teknik er, at det giver mulighed for farvning af en intakt væv eller en organisme uden at skulle første afsnit det og konfokal mikroskopi kan bruges til at generere en tre-dimensionel repræsentation af proteinudtryk mønster. Immunohistokæmi er meget udbredt i biomedicinsk forskning for at forstå ætiologi og molekylære mekanismer, der ligger til grund for sygdom.Det er også et værdifuldt diagnostisk værktøj til at identificere tumorer i patologiske prøver. Til at begynde, forberede gydetanke fyldt med systemvand og med en mesh eller slidset liner på plads. Placer voksne zebrafisk blandet køn par i grupper i tankene natten over.Brug en 14-timers/10-timers lys/mørk cyklus med lys, der tændes på 9 a.m. Den næste morgen, med lysene tændt, ændre gydetank vand med frisk systemvand for at fjerne afføring. Når æggene er lagt, returnere de voksne til hjem tanke.Indsamle æggene ved at trække dem op ved hjælp af en overførsel pipette. Overfør 50 æg til hver petriskål fyldt halvvejs med embryo medium. Fjern uigennemsigtige og uklare æg, der er døde eller ikke kunne opdeles.Inkuber skålen af æg ved 28,5 grader Celsius indtil 23 timer efter befrugtning. Hvis embryonerne er ældre end 24 timer efter befrugtningen, overføres embryonerne med en pipette til 200 mikromolar PTU i embryomedium for at forhindre melanogenese. Under et stereomikroskop dechorionate de unhatched embryoner ved hjælp af ultra fine tip hfug.Brug brand-poleret Pasteur pipetter for at minimere skader, overføre dem til glas eller plast petriskåle belagt med 1-2% agarose opløst i embryo medium. Overfør embryonerne til 1,5 milliliter centrifugerør med en plastik- eller brandpoleret pipette. Embryomediet fjernes med en mikropipette.Lad kun nok væske til bare at dække embryoner. Fastgør embryonerne i 4% PFA i en til to timer med blid rokkende ved stuetemperatur. Dernæst vaskes embryonerne tre gange i 1X PBS og 1%PBTriton i fem minutter.Brug embryonerne straks eller opbevares ved fire grader Celsius i op til en uge. Til langtidsopbevaring dehydreres og opbevares embryonerne i 100 % methanol ved minus 20 grader Celsius. For at rehydrere embryonerne udføres serielle inkubationer fem minutter hver ved stuetemperatur med faldende mængder methanol og PBS og PBTriton til den endelige vask.Fortsæt med embryonpræparatet i henhold til manuskriptet. Vælg en blokerende opløsning, der matcher de sekundære antistofværtsarter, for eksempel 10% gedeserum i PBTriton med eller uden to milligram pr. milliliter BSA. Der tilsættes 0,5 milliliter blokeringsopløsningen i det rør, der indeholder embryonet, og røret anbringes på en rocker i en til tre timer ved stuetemperatur.Derefter inkuberes embryonet i primær antistof fortyndet i blokerende opløsning og PBTriton natten over ved fire grader Celsius, mens rokkende. Om morgenen vaskes fosteret fem gange i PBTriton i 10 minutter hver ved stuetemperatur, mens du rokker. Vælg derefter et sekundært antistof baseret på værtsarterne i det primære antistof og den ønskede bølgelængde ved 488 nanometer.Det sekundære antistof fortyndes ved blokerende opløsning i det rør, der indeholder embryonet. Dæk røret med aluminiumsfolie og inkubere i to timer ved stuetemperatur, mens rokkende. Derefter vaskes embryonerne tre gange i PBTriton i 10 minutter hver ved stuetemperatur, mens de er dækket med aluminiumsfolie og rokkende.Med en pipette overføres embryonerne til en 50% glycerolopløsning i PBS over en seng på 2%agarose i embryomedium. For at fjerne æggeblomme, overføre 200 mikroliter af 1X PBS til en depression dias eller en almindelig glas dias. Brug en plastoverførselspipette til at flytte et eller flere embryoner til PBS-dråben.Brug ultra fine pincet og dobbelt nul insekt stifter til at bryde fra hinanden æggeblomme og meget forsigtigt skrabe æggeblomme granulat fra den ventrale overflade af fosteret. Fjern æggeblommegranulat og genopfyld med PBS efter behov. Efter montering anbringes prøven på mikroskopstadiet.Find interesseområdet ved at vælge et relativt lyst eksempel. Juster kameraets eksponering, og forstærkning, så signalet er tilstrækkeligt lyst uden at mætte. Når man sammenligner de eksperimentelle antistofmærkede embryoner og antistofembryoner, skal du anvende de samme eksponeringsindstillinger.Denne protokol af hele mount immunohistochemistry er et værdifuldt redskab til undersøgelse af rumlige og tidsmæssige protein udtryk ved hjælp af zebrafisk udvikling. Den GluN1 underenhed af NMDA type glutamat receptor afslørede udtryk for glutamat receptor underenheder hele udvikle zebrafisk muskler på 23 timer efter befrugtning. Frosne dele af 72-timers post befrugtning embryoner blev monteret på dias og immunstained for fosfor-H3, en markør for prolifererende celler.Flere celler udtrykte fosfor-H3 og udtrykket var mest bemærkelsesværdigt i ventrikulære zoner. Mus IgG kontrol antistof og eksklusive primære antistoffer afslørede et lavt niveau af ikke-specifikke udtryk. Det er vigtigt at vælge passende blokerende opløsninger og sekundære antistoffer baseret på de primære antistoffer værtsarter for at sikre påvisning og for at minimere ikke-specifikke farvning.Immunohistokemi skal verificeres for at sikre, at det observerede signal faktisk er det protein af interesse. Opfølgende forsøg indebærer normalt brug af genetisk eller miljøificeret organismer. Immunohistochemistry giver forskerne mulighed for at observere proteiner in situ, hvilket i høj grad fremskynder vores forståelse af mange systemer i både grundlæggende og anvendt biologi, især under embryoudvikling.Methanol og formaldehyd er giftige og bør håndteres omhyggeligt. Affald skal indsamles og bortskaffes i henhold til institutionelle procedurer.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering til sammenligning genekspression domæner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoner

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Metoder til at undersøge lymfeknuder kirtel og hæmocytter i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Motor Neuron Membran Potential i Live Zebrafish Embryoer

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisere Multiciliated celler i zebrafisk gennem en kombineret protokol af hele Mount fluorescerende In Situ hybridisering og immunfluorescens

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitative hele-mount immunofluorescens analyse af Cardiac stamfader populationer i mus embryoner

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

En lagdelt monteringsmetode til forlænget tidsforskudt Konfokal mikroskopi af hele Zebrafish-embryoner

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Whole-Mount In Situ Hybridization i Zebrafish Embryoner og Tube Formation Assay i iPSC-ECs at studere den rolle, Endoglin i vaskulær udvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Visualisering og analyse af Pharyngeal Arch Arterier ved hjælp af fuld-mount Immunohistochemistry og 3D Rekonstruktion

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...