Name: whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae at JoVE.com

Financement de la subvention des NIH 8P20GM103436 14.

Les procédures de travail avec les adultes reproducteurs de poissons zèbres et les embryons décrits dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université d'État de Murray.
1. Collection d'embryons et fixation
<ol><li>Préparer les réservoirs de frai en plaçant des paires ou des groupes mixtes de poissons-zèbres adultes dans des réservoirs avec un maillage ou une doublure à fentes remplies d'eau du système pendan...

<ol>
	<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. 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S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+combined+immunohistochemistry+and+in-situ+hybridization+in+fresh-frozen,+cryocut+mouse+brain+sections.">A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections.</a> Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).</li><li>Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+and+duodenal+homeobox-1+nuclear+localization+is+regulated+by+glucose+in+dispersed+rat+islets+but+not+in+insulin-secreting+cell+lines.">Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines.</a> Islets. 6 (4), e982376 (2014).</li><li>Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. 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S., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+pancreatic+cancer+research.">Zebrafish as a model for pancreatic cancer research.</a> Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).</li><li>Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+use+of+zebrafish+to+model+metabolic+disease.">The emerging use of zebrafish to model metabolic disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).</li><li>Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+utility+of+zebrafish+models+of+neurological+and+neuropsychiatric+disorders:+A+critical+review.">The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review.</a> Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li><li>Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+as+a+weak+activator+of+aryl+hydrocarbon+receptor+inhibiting+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced+CYP1A1+transcription+in+zebrafish+embryo.">Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo.</a> Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS one. 6 (8), e22991 (2011).</li><li>Inoue, D., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+for+all--a+highly+efficient+and+versatile+method+for+fluorescent+immunostaining+in+fish+embryos.">One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos.</a> PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).</li></ol>

L'immunohistochimie est un outil polyvalent qui peut être utilisé pour caractériser l'expression spatio-temporelle de pratiquement n'importe quelle protéine d'intérêt dans un organisme. L'immunohistochimie est utilisée sur une grande variété de tissus et d'organismes modèles. Ce protocole a été optimisé pour une utilisation chez le poisson zèbre. L'immunohistochimie chez différentes espèces peut nécessiter différentes techniques de fixation et de manipulation, bloquant les solutions selon les espèces e...

Le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un modèle puissant pour l'étude des processus biologiques pour plusieurs raisons, y compris le temps de génération court, le développement rapide, et l'agréabilité aux techniques génétiques. En conséquence, le poisson zèbre est couramment utilisé dans les écrans à haut débit de petites molécules pour la recherche toxicologique et la découverte de médicaments. Le poisson zèbre est également un modèle attrayant pour l'étude des processus de développement étant donné qu'une seule femelle peut régulièrement produire 50-300 œufs à la fois et les embryons optiquement clairs se développent à l'extérieur permettant une visualisation efficace des processus de développement. Cependant, les premières recherches se sont surtout appuyées sur des écrans génétiques avancés utilisant n-éthyle-N-nitrosourea (ENU) ou d'autres mutagènes en raison de difficultés à établir des techniques génétiques inversées. Il y a environ deux décennies, les morpholinos ont été utilisés pour la première fois chez le poisson zèbre pour éliminer les gènes ciblés1. Les morpholinos sont de petits oligonucléotides antisens qui inhibent la traduction de l'ARNm cible après la microinjection dans un embryon à un stade de développement précoce. Une faiblesse majeure des morpholinos est qu'ils sont dilués pendant que les cellules se divisent et perdent généralement l'efficacité par 72 heures après la fertilisation (hpf). Tandis que les morpholinos restent un outil puissant pour la perturbation de gène de poisson-zèbre, les nucléases d'effecteur de transcription-comme d'activateur (TALENs), les nucléases de zinc-doigt (ZFNs), et les groupés régulièrement interspaced courtes répétitions palindromic (CRISPRs) sont plus récemment employés pour cibler directement le génome de poisson zèbre2,3. Ces stratégies génétiques inversées, combinées à la génétique avancée et aux écrans à haut débit, ont établi le poisson zèbre comme un modèle puissant pour étudier l'expression et la fonction des gènes.
La capacité d'étudier la fonction de gène exige généralement une évaluation de la distribution spatio-temporelle de l'expression de gène ou de produit de gène. Les deux techniques les plus couramment utilisées pour visualiser de tels modèles d'expression au début du développement sont l'hybridation in situ (ISH) et l'immunohistochimie de montage entier (IHC). L'hybridation in situ a été développée pour la première fois en 1969 et repose sur l'utilisation de sondes d'ARN antisens étiquetées pour détecter l'expression de l'ARNm dans un organisme4. En revanche, les anticorps étiquetés sont utilisés dans l'immunohistochimie pour visualiser l'expression des protéines. L'idée d'étiqueter les protéines pour la détection remonte auxannées 5 des années 1930 et la première expérience du CIH a été publiée en 1941 lorsque des anticorps étiquetés FITC ont été utilisés pour détecter les bactéries pathogènes dans les tissus infectés6. ISH et IHC ont évolué et amélioré de manière significative au cours des décennies suivantes et sont maintenant à la fois couramment utilisés dans le laboratoire de recherche moléculaire et diagnostique7,8,9,10,11. Bien que les deux techniques présentent des avantages et des inconvénients, le CSI offre plusieurs avantages par rapport à l'ISH. Pratiquement, le CSI prend beaucoup moins de temps qu'ISH et est généralement moins coûteux en fonction du coût de l'anticorps primaire. En outre, l'expression de l'ARNm n'est pas toujours une mesure fiable de l'expression des protéines, car il a été démontré chez les souris et les humains que seulement environ un tiers de la variation de l'abondance des protéines peut être expliquée par l'abondance de l'ARNm12. Pour cette raison, IHC est un supplément important pour confirmer les données ISH, si possible. Enfin, le CSI peut fournir des données subcellulaires et de co-localisation qui ne peuvent pas être déterminées par ISH13,14,15. Ici, nous décrivons une méthode étape par étape pour détecter de façon fiable des protéines par immunohistochimie dans les embryons et les larves de poissons zèbres de monture entière. Le but de cette technique est de déterminer l'expression spatiale et temporelle d'une protéine d'intérêt dans l'embryon entier. Cette technologie utilise des anticorps primaires spécifiques à l'antigène et des anticorps secondaires étiquetés fluorescents. Le protocole est facilement adaptable pour une utilisation sur les sections de tissu montés sur la diapositive et pour une utilisation avec des substrats chromogéniques au lieu de la fluorescence. Utilisant ce protocole, nous démontrons que le développement du muscle squelettique de poisson zèbre exprime des récepteurs ionotropic de glutamate, en plus des récepteurs d'acétylcholine. Les sous-unités de récepteur de glutamate de type NMDA sont détectables sur le muscle longitudinal à 23 hpf.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil, heavy duty</td>
			<td>Kirkland</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NMDA antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>05-598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABN832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate [Ca(NO3)2]</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Sally Hanson</td>
			<td></td>
			<td>Any nail polish or hardener may be subsituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression (concavity) slide</td>
			<td>Electron Miscroscopy Sciences</td>
			<td>71878-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1855920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, Danieau, 30%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, E2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating tube holder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>59744015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence compound microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>M165-FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 18 x 18</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22 x 60</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-050-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humid chamber with lid</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M920-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunedge pap pen</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins, size 00</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>5213323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4 &#183; 7H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh strainer</td>
			<td>Oneida</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-tube cap lock</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>145062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Toastmaster</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S02L1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBTriton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1% TritonX-100 in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (glass)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3160100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (plastic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>207250250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 1x</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1x made from 10x stock diluted in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P250-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spawning tank with lid and insert</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperBlock PBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost + slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue gel</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, ultrapure/double distilled</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W2-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae

L'immunohistochimie est une technique largement utilisée pour explorer l'expression et la localisation des protéines pendant les états normaux de développement et de maladie. Bien que de nombreux protocoles d'immunohistochimie aient été optimisés pour les sections des tissus et des tissus des mammifères, ces protocoles nécessitent souvent une modification et une optimisation pour les organismes modèles non mammifères. Le poisson zèbre est de plus en plus utilisé comme système modèle dans la recherche fondamentale, biomédicale et translationnelle pour étudier les mécanismes moléculaires, génétiques et biologiques cellulaires des processus de développement. Le poisson zèbre offre de nombreux avantages en tant que système modèle, mais nécessite également des techniques modifiées pour une détection optimale des protéines. Ici, nous fournissons notre protocole pour l'immunohistochimie de fluorescence de montage entier dans les embryons et les larves de poissons-zèbres. Ce protocole décrit en outre plusieurs stratégies de montage différentes qui peuvent être utilisées et une vue d'ensemble des avantages et des inconvénients de chaque stratégie fournit. Nous décrivons également des modifications à ce protocole pour permettre la détection des substrats chromogéniques dans le tissu entier de montage et la détection de fluorescence dans le tissu larvaire sectionné. Ce protocole est largement applicable à l'étude de nombreux stades de développement et structures embryonnaires.

L'immunohistochimie de montage entier emploie des anticorps pour détecter le modèle spatial de l'expression de protéine dans l'animal intact. Le flux de travail de base de l'immunohistochimie (représenté à la figure 1) consiste à élever le poisson zèbre, à élever et à préparer des embryons, à bloquer les antigènes non spécifiques, à utiliser un anticorps primaire spécifique à l'antigène pour cibler la protéine d'intérêt, à détecter ce...

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Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Ici, nous présentons un protocole pour la détection fluorescente des protéines par anticorps dans des préparations entières d'embryons et de larves de poissons zèbres.

Immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

L’immunohistochimie de montage entier est une technique relativement rapide et simple qui permet l’observation spatiale et temporelle des protéines directement dans un tissu ou un organisme utilisant des anticorps étiquetés. L’utilité de cette technique est qu’elle permet la coloration d’un tissu intact ou d’un organisme sans avoir à le sectionner d’abord et la microscopie confoccale peut être utilisée pour générer une représentation tridimensionnelle du modèle d’expression protéique. L’immunohistochimie est largement utilisée dans la recherche biomédicale pour comprendre l’étiologie et les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la maladie.C’est également un outil diagnostique valable pour identifier des tumeurs dans des échantillons pathologiques. Pour commencer, préparez des réservoirs de frai remplis d’eau du système et d’une maille ou d’un revêtement fendté en place. Placer les couples de sexe mixte adultes de poisson zèbre en groupes dans les réservoirs pendant la nuit.Utilisez un cycle lumière/obscurité de 14 heures/10 heures avec des lumières qui s’allument à 9 .m. Le lendemain matin, avec les lumières allumées, changer l’eau du réservoir de frai avec de l’eau du système frais pour enlever les excréments. Une fois les œufs pondus, retourner les adultes dans des réservoirs à la maison.Recueillir les œufs en les dessinant à l’aide d’une pipette de transfert. Transférer 50 œufs dans chaque boîte de Pétri remplie à mi-chemin avec un milieu embryonnaire. Enlevez tous les œufs opaques et nuageux qui sont morts ou qui n’ont pas réussi à se diviser.Incuber le plat d’œufs à 28,5 degrés Celsius jusqu’à 23 heures après la fécondation. Si les embryons sont plus âgés que 24 heures après la fécondation, avec une pipette transférer les embryons à 200 PTU micromolaire dans le milieu embryonnaire pour prévenir la mélanogenèse. Au microscope stéréo, déchorionner les embryons non hachés à l’aide de forceps à pointe ultra fine.À l’aide de pipettes Pasteur polies par le feu pour minimiser les dommages, transférez-les dans des boîtes de Pétri en verre ou en plastique recouvertes de 1 à 2 % d’agarose dissoute dans un milieu embryonnaire. Transférez ensuite les embryons dans des tubes de centrifugeuse de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette en plastique ou polie par le feu. Retirer le milieu embryonnaire à l’aide d’une micropipette.Ne laissez que suffisamment de liquide pour couvrir les embryons. Fixer les embryons en 4%PFA pendant une à deux heures avec un basculement doux à température ambiante. Ensuite, lavez les embryons trois fois en 1X PBS et 1%PBTriton pendant cinq minutes.Utilisez les embryons immédiatement ou conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Pour le stockage à long terme, déshydrater et stocker les embryons dans 100% méthanol à moins 20 degrés Celsius. Pour réhydrater les embryons, effectuez des incubations en série cinq minutes chacune à température ambiante avec des quantités décroissantes de méthanol et de PBS et de PBTriton pour le lavage final.Procéder à la préparation de l’embryon selon le manuscrit. Choisissez une solution de blocage correspondant à l’espèce hôte secondaire d’anticorps, par exemple 10% sérum de chèvre dans PBTriton avec ou sans deux milligrammes par millilitre de BSA. Ajouter 0,5 millilitres de la solution de blocage dans le tube contenant l’embryon et placer le tube sur un rocker pendant une à trois heures à température ambiante.Puis incuber l’embryon dans l’anticorps primaire dilué dans la solution de blocage et PBTriton pendant la nuit à quatre degrés Celsius tout en berçant. Le matin, laver l’embryon cinq fois dans PBTriton pendant 10 minutes chacun à température ambiante tout en basculant. Choisissez ensuite un anticorps secondaire basé sur l’espèce hôte de l’anticorps primaire et la longueur d’onde désirée à 488 nanomètres.Ajouter l’anticorps secondaire dilué dans la solution de blocage dans le tube contenant l’embryon. Couvrir le tube de papier d’aluminium et incuber pendant deux heures à température ambiante pendant le basculement. Après cela, laver les embryons trois fois dans PBTriton pendant 10 minutes chacun à température ambiante tout en étant recouvert de papier d’aluminium et de bascule.Avec une pipette, transférer les embryons à une solution de 50% glycérol dans PBS sur un lit de 2% agarose dans le milieu embryonnaire. Pour enlever le jaune, transférer 200 microlitres de 1X PBS sur une glissade de dépression ou une glissière en verre ordinaire. Utilisez une pipette de transfert en plastique pour déplacer un ou plusieurs embryons vers la gouttelette PBS.Utilisez des forceps ultra fins et des broches à double zéro insecte pour briser le jaune et gratter très doucement les granules jaunes de la surface ventrale de l’embryon. Retirer les granules jaunes et les reconstituer en PBS au besoin. Après montage, placez l’échantillon au microscope.Localisez la région d’intérêt en choisissant un exemple relativement lumineux. Ajustez l’exposition à la caméra et gagnez de sorte que le signal soit suffisamment lumineux sans saturer. Lorsque vous comparez entre les embryons expérimentaux étiquetés anticorps et les embryons d’anticorps de contrôle, utilisez les mêmes paramètres d’exposition.Ce protocole de l’immunohistochimie de montage entier est un outil valable pour l’étude de l’expression spatiale et temporelle de protéine utilisant le développement de zebrafish. La sous-unité GluN1 du récepteur du glutamate de type NMDA a révélé l’expression de sous-unités de récepteur de glutamate dans l’ensemble des muscles du poisson zèbre en développement à 23 heures après la fécondation. Des sections congelées d’embryons post fertilisants de 72 heures ont été montées sur des toboggans et immunotachées pour le phospho-H3, un marqueur des cellules proliférantes.Plusieurs cellules ont exprimé le phospho-H3 et l’expression était la plus notable aux zones ventriculaires. L’anticorps de contrôle d’IgG de souris et à l’exclusion des anticorps primaires a indiqué un bas niveau d’expression non spécifique. Il est important de choisir des solutions de blocage appropriées et des anticorps secondaires basés sur les anticorps primaires des espèces hôtes afin d’assurer la détection et de minimiser les taches non spécifiques.L’immunohistochimie doit être vérifiée pour s’assurer que le signal observé est en fait la protéine d’intérêt. Les expériences de suivi impliquent habituellement l’utilisation d’organismes génétiquement ou écologiquement modifiés. L’immunohistochimie permet aux chercheurs d’observer les protéines in situ, accélérant considérablement notre compréhension de nombreux systèmes en biologie fondamentale et appliquée, en particulier pendant le développement embryonnaire.Le méthanol et le formaldéhyde sont toxiques et doivent être manipulés avec soin. Les déchets doivent être collectés et éliminés selon les procédures institutionnelles.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Recherche

Biologie du développement

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-cible chromogénique totalité montage<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation pour la comparaison des gènes domaines d&#39;expression dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Méthodes pour examiner la lymphe et Gland hémocytes dans<em&gt; Drosophila</em&gt; larves

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Potentiel de membrane de neurones moteurs dans les embryons vivants de zébrés

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisation des cellules multiciliées dans le poisson-zèbre à travers un protocole combiné de toute monture Fluorescent In Situ hybridation et Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Analyse quantitative Immunofluorescence entier-montent des Populations de progéniteurs cardiaques chez des embryons de souris

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiser le nœud et la notochorde plaque en Gastrulating des embryons de souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage et toute monture Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Une méthode de montage en couches pour la microscopie confocale de temps-lapse prolongée des embryons entiers de poisson zèbre

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hybridation in situ à monture entière chez les embryons de poissons zèbres et l’essai de formation de tubes dans iPSC-ECs pour étudier le rôle de l’Endoglin dans le développement vasculaire

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Visualisation et analyse des artères pharyngées à l’aide de l’immunohistochimie à monture entière et de la reconstruction 3D

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...