Name: whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae at JoVE.com

Finanzierung aus dem NIH-Zuschuss 8P20GM103436 14.

Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren für die Arbeit mit Zebrafischen, die Erwachsene und Embryonen züchten, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Murray State University genehmigt.
1. Embryo-Sammlung und -Fixierung
<ol><li>Bereiten Sie Laichbecken vor, indem Sie erwachsene Zebrafische gemischte Sexpaare oder -gruppen in Tanks mit einem Netz oder einem geschlitzten Liner platzieren, der über Nacht mit Systemwasser gefüllt ist.</li>
	<li>Wechseln Sie bei ein...

<ol>
	<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+and+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+and+efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+the+CRISPR/Cas9+system.">Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).</li><li>van der Ploeg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+nucleic+acid+research+during+the+twentieth+century.">Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century.</a> European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).</li><li>Marrack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+Antibodies.">Nature of Antibodies.</a> Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Lopez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+in+situ+Hybridization/Immunohistochemistry+(ISH/IH)+on+Free-floating+Vibratome+Tissue+Sections.">Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections.</a> Bio-protocol. 4 (18), (2014).</li><li>Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glucocorticoid+receptor+immunoreactivity+and+mRNA+in+the+rat+brain:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).</li><li>Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+combined+immunohistochemistry+and+in-situ+hybridization+in+fresh-frozen,+cryocut+mouse+brain+sections.">A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections.</a> Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).</li><li>Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+and+duodenal+homeobox-1+nuclear+localization+is+regulated+by+glucose+in+dispersed+rat+islets+but+not+in+insulin-secreting+cell+lines.">Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines.</a> Islets. 6 (4), e982376 (2014).</li><li>Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glis3+is+associated+with+primary+cilia+and+Wwtr1/TAZ+and+implicated+in+polycystic+kidney+disease.">Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).</li><li>Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+expression+and+colocalization+of+somatostatin,+carboxypeptidase-E+and+prohormone+convertases+1+and+2+in+rat+brain.">Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain.</a> Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+preparation+for+observation+and+analysis+of+zebrafish+embryo+specimens+stained+by+whole+mount+in+situ+hybridization.">Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li><li>Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine+and+calcium+signalling+regulates+muscle+fibre+formation+in+the+zebrafish+embryo.">Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo.</a> Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).</li><li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+of+muscle+acetylcholine+receptors+requires+motoneurons+in+live+embryos,+but+not+in+cell+culture.">Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture.</a> The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).</li><li>Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotransmitter-receptor+matching+at+the+neuromuscular+junction.">Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).</li><li>Brunelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+reinnervation+through+peripheral+nerve+graft+dictates+assembly+of+glutamatergic+synapses+at+rat+skeletal+muscle.">Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).</li><li>Hans, F., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+phosphorylation+and+cell+division.">Histone H3 phosphorylation and cell division.</a> Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).</li><li>Yee, N. S., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+pancreatic+cancer+research.">Zebrafish as a model for pancreatic cancer research.</a> Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).</li><li>Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+use+of+zebrafish+to+model+metabolic+disease.">The emerging use of zebrafish to model metabolic disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).</li><li>Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+utility+of+zebrafish+models+of+neurological+and+neuropsychiatric+disorders:+A+critical+review.">The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review.</a> Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li><li>Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+as+a+weak+activator+of+aryl+hydrocarbon+receptor+inhibiting+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced+CYP1A1+transcription+in+zebrafish+embryo.">Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo.</a> Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS one. 6 (8), e22991 (2011).</li><li>Inoue, D., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+for+all--a+highly+efficient+and+versatile+method+for+fluorescent+immunostaining+in+fish+embryos.">One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos.</a> PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).</li></ol>

Die Immunhistochemie ist ein vielseitiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die räumlich-zeitliche Expression praktisch jedes Proteins zu charakterisieren, das für einen Organismus von Interesse ist. Immunhistochemie wird bei einer Vielzahl von Geweben und Modellorganismen eingesetzt. Dieses Protokoll wurde für den Einsatz in Zebrafischen optimiert. Die Immunhistochemie bei verschiedenen Arten kann unterschiedliche Befestigungs- und Handhabungstechniken erfordern, die je nach Art und Dementogen von Endogenen Per...

Der Zebrafisch (Danio rerio) hat sich als ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung biologischer Prozesse aus mehreren Gründen, einschließlich kurzer Erzeugungszeit, schnelle Entwicklung, und Freundlichkeit zu genetischen Techniken. Als Ergebnis, Zebrafische werden häufig in hohen Durchsatz kleine Molekül-Screens für toxikologische Forschung und Arzneimittelforschung verwendet. Zebrafische sind auch ein attraktives Modell für die Untersuchung von Entwicklungsprozessen, da ein einzelnes Weibchen routinemäßig 50-300 Eier gleichzeitig produzieren kann und die optisch klaren Embryonen extern entwickeln, was eine effiziente Visualisierung von Entwicklungsprozessen ermöglicht. Die frühe Forschung stützte sich jedoch hauptsächlich auf vorwärts gerichtete genetische Screens, die N-Ethyl-N-Nitrosourea (ENU) oder andere Mutagene nutzten, da es herausforderungen war, umgekehrte genetische Techniken zu etablieren. Vor etwa zwei Jahrzehnten wurden Morpholinos zum ersten Mal in Zebrafischen verwendet, um gezielte Gene1abzuschlagen. Morpholinos sind kleine Antisense-Oligonukleotide, die die Translation von Ziel-mRNA nach Mikroinjektion in einen Embryo in einem frühen Entwicklungsstadium hemmen. Eine große Schwäche von Morpholinos ist, dass sie verdünnt werden, wenn sich die Zellen teilen und in der Regel durch 72 Stunden Nachbefruchtung (hpf) an Wirksamkeit verlieren. Während Morpholinos ein leistungsfähiges Werkzeug für Zebrafisch-Genstörungen bleiben, werden Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENs), Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und gruppierte, regelmäßig interspaced short palindromic Repeats (CRISPRs) in jüngerer Zeit verwendet, um direkt auf das Zebrafischgenom2,3zu zielen. Diese umgekehrten genetischen Strategien, in Kombination mit Vorwärtsgenetik und Bildschirmen mit hohem Durchsatz, haben den Zebrafisch als ein leistungsfähiges Modell zur Erforschung der Genexpression und -funktion etabliert.
Die Fähigkeit, die Genfunktion zu untersuchen, erfordert in der Regel eine Bewertung der räumlich-zeitlichen Verteilung der Gen- oder Genproduktexpression. Die beiden am häufigsten verwendeten Techniken zur Visualisierung solcher Expressionsmuster während der frühen Entwicklung sind die In-situ-Hybridisierung (ISH) und die gesamte Mount-Immunhistochemie (IHC). Die In-situ-Hybridisierung wurde erstmals 1969 entwickelt und stützt sich auf die Verwendung von markierten Antisense-RNA-Sonden zum Nachweis der mRNA-Expression in einem Organismus4. Im Gegensatz dazu werden markierte Antikörper in der Immunhistochemie verwendet, um die Proteinexpression zu visualisieren. Die Idee, Proteine für den Nachweis zu kennzeichnen, geht auf die5. Jahre der 1930er Jahre zurück und das erste IHC-Experiment wurde 1941 veröffentlicht, als FITC-markierte Antikörper verwendet wurden, um pathogene Bakterien in infizierten Geweben zu erkennen6. ISH und IHC haben sich in den folgenden Jahrzehnten deutlich weiterentwickelt und verbessert und werden nun sowohl routinemäßig im molekularen als auch im diagnostischen Forschungslabor7,8,9,10,11eingesetzt. Während beide Techniken Vor- und Nachteile haben, bietet IHC mehrere Vorteile gegenüber der ISH. Praktisch ist IHC viel weniger zeitaufwändig als ISH und ist in der Regel weniger teuer, abhängig von den Kosten des primären Antikörpers. Darüber hinaus ist die mRNA-Expression nicht immer eine zuverlässige Metrik der Proteinexpression, da bei Mäusen und Menschen nachgewiesen wurde, dass nur etwa ein Drittel der Proteinüberflussvariation durch mRNA-Überfluss12erklärt werden kann. Aus diesem Grund ist IHC eine wichtige Ergänzung, um ISH-Daten zu bestätigen, wenn möglich. Schließlich kann IHC subzelluläre und Co-Lokalisierungsdaten bereitstellen, die nicht von ISH13,14,15bestimmt werden können. Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Methode zum zuverlässigen Nachweis von Proteinen durch Immunhistochemie in ganzen Zebrafischembryonen und Larven. Das Ziel dieser Technik ist es, die räumliche und zeitliche Expression eines Proteins von Interesse im gesamten Embryo zu bestimmen. Diese Technologie verwendet antigenspezifische primäre Antikörper und fluoreszierend markierte sekundäre Antikörper. Das Protokoll ist leicht anpassbar für den Einsatz auf gleitmontierten Gewebeabschnitten und für die Verwendung mit chromogenen Substraten anstelle der Fluoreszenz. Mit diesem Protokoll, Wir zeigen, dass die Entwicklung Zebrafisch Skelettmuskel drückt ionotrope Glutamat-Rezeptoren, zusätzlich zu Acetylcholin-Rezeptoren. NMDA-Typ Glutamat-Rezeptor-Subunits sind auf dem Längsmuskel bei 23 hpf nachweisbar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil, heavy duty</td>
			<td>Kirkland</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NMDA antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>05-598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABN832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate [Ca(NO3)2]</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Sally Hanson</td>
			<td></td>
			<td>Any nail polish or hardener may be subsituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression (concavity) slide</td>
			<td>Electron Miscroscopy Sciences</td>
			<td>71878-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1855920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, Danieau, 30%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, E2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating tube holder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>59744015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence compound microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>M165-FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 18 x 18</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22 x 60</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-050-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humid chamber with lid</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M920-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunedge pap pen</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins, size 00</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>5213323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4 &#183; 7H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh strainer</td>
			<td>Oneida</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-tube cap lock</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>145062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Toastmaster</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S02L1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBTriton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1% TritonX-100 in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (glass)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3160100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (plastic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>207250250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 1x</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1x made from 10x stock diluted in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P250-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spawning tank with lid and insert</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperBlock PBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost + slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue gel</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, ultrapure/double distilled</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W2-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae

Immunhistochemie ist eine weit verbreitete Technik zur Erforschung der Proteinexpression und Lokalisierung sowohl während der normalen Entwicklungs- als auch der Krankheitszustände. Obwohl viele Immunhistochemieprotokolle für Säugetiergewebe- und Gewebeabschnitte optimiert wurden, erfordern diese Protokolle häufig eine Modifikation und Optimierung für nicht-mammalianische Modellorganismen. Zebrafische werden zunehmend als Modellsystem in der Grundlagen-, Biomedizinischen und translationalen Forschung eingesetzt, um die molekularen, genetischen und zellbiologischen Mechanismen von Entwicklungsprozessen zu untersuchen. Zebrafische bieten viele Vorteile als Modellsystem, erfordern aber auch modifizierte Techniken für eine optimale Proteindetektion. Hier stellen wir unser Protokoll für die Fluoreszenzimmunhistochemie in Zebrafischembryonen und Larven zur Verfügung. Dieses Protokoll beschreibt zusätzlich verschiedene Montagestrategien, die eingesetzt werden können, und einen Überblick über die Vor- und Nachteile, die jede Strategie bietet. Wir beschreiben auch Änderungen an diesem Protokoll, um den Nachweis von chromogenen Substraten im gesamten Mountgewebe und Fluoreszenznachweis im geschnittenen Larvengewebe zu ermöglichen. Dieses Protokoll ist weitgehend auf die Untersuchung vieler Entwicklungsstadien und embryonaler Strukturen anwendbar.

Die Immunhistochemie der ganzen Halterung verwendet Antikörper, um das räumliche Muster der Proteinexpression im intakten Tier zu detektieren. Der grundlegende Arbeitsablauf der Immunhistochemie (dargestellt in Abbildung 1) besteht darin, Zebrafische zu züchten, Embryonen zu züchten und zu präzisieren, unspezifische Antigene zu blockieren, einen antigenspezifischen Primärantikörper zu verwenden, um das Protein von Interesse zu zielen, diesen primären ...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae at JoVE.com

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Hier stellen wir ein Protokoll zum fluoreszierenden Antikörper-vermittelten Nachweis von Proteinen in ganzen Präparaten von Zebrafischembryonen und Larven vor.

Ganzer Berg Immunhistochemie in Zebrafisch Embryonen und Larven

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Die Immunhistochemie ist eine relativ schnelle und einfache Technik, die die räumliche und zeitliche Beobachtung von Proteinen direkt in einem Gewebe oder Organismus mit markierten Antikörpern ermöglicht. Der Nutzen dieser Technik besteht darin, dass sie die Färbung eines intakten Gewebes oder eines Organismus ermöglicht, ohne es zuerst abschnitten zu müssen, und die konfokale Mikroskopie kann verwendet werden, um eine dreidimensionale Darstellung des Proteinexpressionsmusters zu erzeugen. Die Immunhistochemie wird in der biomedizinischen Forschung häufig eingesetzt, um die Ätiologie und die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Krankheit zugrunde liegen.Es ist auch ein wertvolles diagnostisches Werkzeug, um Tumore in pathologischen Proben zu identifizieren. Bereiten Sie zunächst Laichtanks vor, die mit Systemwasser und einem Netz oder schlitzgeschlitzten Linern gefüllt sind. Platzieren Sie erwachsene Zebrafische gemischte Sexpaare in Gruppen in den Tanks über Nacht.Verwenden Sie einen 14-Stunden/10-Stunden-Licht-/Dunkelzyklus mit Lichtern, die um 9 .m eintreffen. Am nächsten Morgen, wenn die Lichter eingeschaltet sind, wechseln Sie das Laichbeckenwasser mit frischem Systemwasser, um Kot zu entfernen. Sobald die Eier gelegt sind, kehren Sie die Erwachsenen in die Tanks zurück.Sammeln Sie die Eier, indem Sie sie mit einer Transferpipette aufziehen. Übertragen Sie 50 Eier auf jede Petrischale, die auf halbem Weg mit Embryo-Medium gefüllt ist. Entfernen Sie alle undurchsichtigen und trüben Eier, die tot sind oder nicht geteilt werden konnten.Die Schale der Eier bei 28,5 Grad Celsius bis 23 Stunden nach der Befruchtung bebrüten. Wenn Embryonen älter als 24 Stunden nach der Befruchtung sind, übertragen Sie die Embryonen mit einer Pipette auf 200 mikromolare PTU im Embryomedium, um eine Melanogenese zu verhindern. Dechorionate die ungeschlüpften Embryonen unter einem Stereomikroskop mit ultrafeinen Spitzenzangen.Mit feuerpolierten Pasteur Pipetten, um Schäden zu minimieren, übertragen Sie sie in Glas oder Kunststoff Petrischalen mit 1-2%Agarose in Embryo-Medium gelöst beschichtet. Dann übertragen Sie die Embryonen mit einer Kunststoff- oder feuerpolierten Pipette in 1,5 Milliliter Zentrifugenrohre. Embryomedium mit einer Mikropipette entfernen.Lassen Sie nur genug Flüssigkeit, um nur die Embryonen zu bedecken. Fixieren Sie die Embryonen in 4%PFA für ein bis zwei Stunden mit sanftem Schaukeln bei Raumtemperatur. Als nächstes waschen Sie die Embryonen dreimal in 1X PBS und 1%PBTriton für fünf Minuten.Verwenden Sie die Embryonen sofort oder lagern Sie bei vier Grad Celsius bis zu einer Woche. Zur Langzeitlagerung die Embryonen bei minus 20 Grad Celsius in 100% Methanol dehydrieren und lagern. Um die Embryonen zu rehydrieren, führen Sie serielle Inkubationen jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur mit abnehmenden Mengen an Methanol und PBS und PBTriton für die Endwäsche durch.Fahren Sie mit der Embryovorbereitung gemäß dem Manuskript fort. Wählen Sie eine Blockierlösung aus, die der sekundären Antikörper-Wirtsart entspricht, z. B. 10%Ziegenserum in PBTriton mit oder ohne zwei Milligramm pro Milliliter BSA. Fügen Sie 0,5 Milliliter der Blockierlösung in die Röhre, die den Embryo enthält, und legen Sie das Rohr für ein bis drei Stunden bei Raumtemperatur auf eine Wippe.Dann inkubieren Sie den Embryo in primären Antikörper in Blockierlösung verdünnt und PBTriton über Nacht bei vier Grad Celsius beim Schaukeln. Am Morgen den Embryo fünfmal in PBTriton für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur beim Schaukeln waschen. Wählen Sie dann einen sekundären Antikörper basierend auf der Wirtsart des primären Antikörpers und der gewünschten Wellenlänge bei 488 Nanometern aus.Fügen Sie den sekundären Antikörper, der in einer Blockierenden Lösung verdünnt wird, in das Rohr, das den Embryo enthält. Bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie für zwei Stunden bei Raumtemperatur beim Schaukeln. Danach waschen Sie die Embryonen dreimal in PBTriton für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur, während sie mit Aluminiumfolie bedeckt und schaukeln.Mit einer Pipette die Embryonen in eine 50%glyzerinlösung in PBS über ein Bett von 2%Agarose im Embryomedium übertragen. Um das Eigelb zu entfernen, übertragen Sie 200 Mikroliter 1X PBS auf eine Vertiefungsfolie oder eine schlichte Glasrutsche. Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um einen oder mehrere Embryonen in das PBS-Tröpfchen zu bewegen.Verwenden Sie ultrafeine Zangen und Doppelnull Insektenstifte, um das Eigelb auseinander zu brechen und sehr sanft schaltigen DotterGranulat von der ventralen Oberfläche des Embryos. Entfernen Sie das Dottergranulat und füllen Sie es bei Bedarf mit PBS auf. Legen Sie die Probe nach der Montage auf die Mikroskopstufe.Suchen Sie die Region von Interesse, indem Sie ein relativ helles Beispiel auswählen. Stellen Sie die Kamerabelichtung und -verstärkung so ein, dass das Signal ausreichend hell ist, ohne zu sättieren. Verwenden Sie beim Vergleich zwischen den experimentellen Antikörper-markierten Embryonen und Kontrollantikörperembryonen die gleichen Expositionseinstellungen.Dieses Protokoll der ganzen Mount-Immunhistochemie ist ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der räumlichen und zeitlichen Proteinexpression mittels Zebrafischentwicklung. Die GluN1-Untereinheit des NMDA-Typ-Glutamatrezeptors zeigte die Expression von Glutamatrezeptor-Untereinheiten während der Entwicklung von Zebrafischmuskeln nach 23 Stunden nach der Befruchtung. Gefrorene Abschnitte von 72-stündigen Embryos nach der Befruchtung wurden auf Dias montiert und immunstainiert für Phospho-H3, einen Marker von sich ausbreitenden Zellen.Mehrere Zellen exprimieren Phospho-H3 und die Expression war am bemerkenswertesten in den ventrikulären Zonen. Maus-IgG-Kontrollantikörper und ohne primäre Antikörper ergaben einen geringen Grad an unspezifischer Expression. Es ist wichtig, geeignete Blockierlösungen und sekundäre Antikörper auf der Grundlage der primären Antikörper-Wirtsarten auszuwählen, um den Nachweis zu gewährleisten und unspezifische Färbungen zu minimieren.Die Immunhistochemie muss überprüft werden, um sicherzustellen, dass das beobachtete Signal tatsächlich das Protein von Interesse ist. Folgeexperimente beinhalten in der Regel die Verwendung genetisch oder umweltverträglicher Organismen. Die Immunhistochemie gibt Forschern die Möglichkeit, Proteine vor Ort zu beobachten, was unser Verständnis zahlreicher Systeme sowohl in der Grundlagen- als auch in der angewandten Biologie, insbesondere während der Embryoentwicklung, erheblich beschleunigt.Methanol und Formaldehyd sind giftig und sollten sorgfältig behandelt werden. Abfälle müssen nach institutionellen Verfahren gesammelt und entsorgt werden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-Target-Chromogenic Whole-mount<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung zum Vergleich Genexpression Domains in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methoden, um die Lymphdrüsen und Blutzellen zu prüfen, die in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Ganz-Mount-In-Situ-Hybridisierung in Zebrafisch-Embryonen und Tube-Formations-Assay in iPSC-ECs zur Untersuchung der Rolle von Endoglin in der Gefäßentwicklung

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Visualisierung und Analyse von Pharyngeal Arch Arterien mittels ganzer Immunhistochemie und 3D-Rekonstruktion

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...