Name: whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae at JoVE.com

מימון מ-NIH גרנט 8P20GM103436 14.

ההליכים לעבודה עם מבוגרים הרבייה והעוברים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת מורי סטייט.
1. איסוף העובר וקיבוע
<ol><li>הכנת טנקים המכינות ידי הצבת דג זברה מבוגרים זוגות סקס או קבוצות בטנקים עם רשת שינוי או הצמד ממולא מים מערכת בליל...

<ol>
	<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+and+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+and+efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+the+CRISPR/Cas9+system.">Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).</li><li>van der Ploeg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+nucleic+acid+research+during+the+twentieth+century.">Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century.</a> European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).</li><li>Marrack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+Antibodies.">Nature of Antibodies.</a> Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Lopez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+in+situ+Hybridization/Immunohistochemistry+(ISH/IH)+on+Free-floating+Vibratome+Tissue+Sections.">Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections.</a> Bio-protocol. 4 (18), (2014).</li><li>Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glucocorticoid+receptor+immunoreactivity+and+mRNA+in+the+rat+brain:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).</li><li>Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+combined+immunohistochemistry+and+in-situ+hybridization+in+fresh-frozen,+cryocut+mouse+brain+sections.">A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections.</a> Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).</li><li>Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+and+duodenal+homeobox-1+nuclear+localization+is+regulated+by+glucose+in+dispersed+rat+islets+but+not+in+insulin-secreting+cell+lines.">Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines.</a> Islets. 6 (4), e982376 (2014).</li><li>Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glis3+is+associated+with+primary+cilia+and+Wwtr1/TAZ+and+implicated+in+polycystic+kidney+disease.">Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).</li><li>Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+expression+and+colocalization+of+somatostatin,+carboxypeptidase-E+and+prohormone+convertases+1+and+2+in+rat+brain.">Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain.</a> Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+preparation+for+observation+and+analysis+of+zebrafish+embryo+specimens+stained+by+whole+mount+in+situ+hybridization.">Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li><li>Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine+and+calcium+signalling+regulates+muscle+fibre+formation+in+the+zebrafish+embryo.">Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo.</a> Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).</li><li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+of+muscle+acetylcholine+receptors+requires+motoneurons+in+live+embryos,+but+not+in+cell+culture.">Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture.</a> The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).</li><li>Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotransmitter-receptor+matching+at+the+neuromuscular+junction.">Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).</li><li>Brunelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+reinnervation+through+peripheral+nerve+graft+dictates+assembly+of+glutamatergic+synapses+at+rat+skeletal+muscle.">Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).</li><li>Hans, F., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+phosphorylation+and+cell+division.">Histone H3 phosphorylation and cell division.</a> Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).</li><li>Yee, N. S., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+pancreatic+cancer+research.">Zebrafish as a model for pancreatic cancer research.</a> Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).</li><li>Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+use+of+zebrafish+to+model+metabolic+disease.">The emerging use of zebrafish to model metabolic disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).</li><li>Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+utility+of+zebrafish+models+of+neurological+and+neuropsychiatric+disorders:+A+critical+review.">The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review.</a> Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li><li>Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+as+a+weak+activator+of+aryl+hydrocarbon+receptor+inhibiting+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced+CYP1A1+transcription+in+zebrafish+embryo.">Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo.</a> Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS one. 6 (8), e22991 (2011).</li><li>Inoue, D., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+for+all--a+highly+efficient+and+versatile+method+for+fluorescent+immunostaining+in+fish+embryos.">One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos.</a> PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).</li></ol>

אימונוהיסטוכימיה הוא כלי רב-תכליתי שניתן להשתמש בו כדי לאפיין את הביטוי הזמני-מיותר של חלבון כמעט כל עניין של אורגניזם. אימונוהיסטוכימיה משמש על מגוון רחב של רקמות ואורגניזמים מודל. פרוטוקול זה הותאם במיוחד לשימוש ב-zebrafish. אימונוהיסטוכימיה במינים שונים עשויים לדרוש קיבוע שונים וטכניקות ?...

הדגים (danio rerio) התפתחה כמודל רב עוצמה לחקר תהליכים ביולוגיים מכמה סיבות כולל זמן הדור הקצר, התפתחות מהירה, ואת היכולת הגנטית לטכניקות גנטיות. כתוצאה מכך, הדגים משמשים בדרך כלל בתפוקה גבוהה של מולקולת מולקולה קטנה עבור מחקר הרעילות וגילוי הסמים. Zebrafish הם גם מודל אטרקטיבי למחקר של תהליכים התפתחותיים בהתחשב כי נקבה אחת יכולה לייצר באופן שגרתי 50-300 ביצים בכל פעם, העוברים ברורים באופן ברור לפתח באופן חיצוני המאפשר הדמיה יעילה של תהליכים התפתחותיים. עם זאת, מחקר מוקדם הסתמך בעיקר על מסכי גנטיות קדימה באמצעות N-אתיל-N-הניטרוסוראה (אנו) או אחרים מוטגנים בשל אתגרים בהקמת טכניקות גנטיות הפוכה. בערך לפני שני עשורים, שורגוולנוס. השתמשו לראשונה ב-"דג" כדי להוריד גנים ממוקדים1 מורגוולנוס הם מיעוט אנטי-היגיון קטן, העכב את התרגום של mRNA המטרה לאחר ההזרקה לעובר בשלב התפתחותי מוקדם. החולשה העיקרית של מורגוולנוס היא שהם מדולל כמו תאים הפער בדרך כלל לאבד את היעילות על ידי 72 שעות לאחר הפריה (hpf). בעוד מורגוולנוס להישאר כלי רב עוצמה עבור דג זברה גנים שיבוש, שעתוק activator כמו אפקטור נוקלאוסיס (talens), אבץ-האצבעות הנוקלאוטיות (zfns), ו מקובצים באופן קבוע במרווחים קבועים palin,הגנוםהקצר (crisprs) הם יותר לאחרונה בשימוש ישירות המטרה הגנטית zebra אלה אסטרטגיות גנטיות הפוכה, בשילוב עם גנטיקה קדימה מסכי תפוקה גבוהה, הקימו את דג זברה כמודל רב עוצמה כדי ללמוד ביטוי גנים ותפקוד.
היכולת ללמוד את פונקציית הגנים דורשת בדרך כלל הערכה של התפלגות הזמן הזמני של גנים או ביטוי מוצר גנטי. שתי הטכניקות הנפוצות ביותר כדי להמחיש דפוסי ביטוי כאלה במהלך ההתפתחות המוקדמת נמצאים היברידיזציה באתרו (ISH) ואת כל הר אימונוהיסטוכימיה (IHC). באתר היברידיזציה פותחה לראשונה בשנת 1969 ומסתמך על השימוש בבדיקות אנטי-RNA המותווית נגד היגיון כדי לזהות ביטוי mRNA באורגניזם4. לעומת זאת, נוגדנים המסומנים בתווית משמשים ב אימונוהיסטוכימיה כדי להמחיש את הביטוי חלבון. הרעיון של תיוג חלבונים לאיתור תאריכיםשל שנות ה -30 ו- ihc הראשון הניסוי פורסם בשנת 1941 כאשר נוגדנים fitc התווית שימשו כדי לזהות חיידקים פתוגניים ברקמות הנגועות6. ISH ו-ihc התפתחו והשתפרו באופן משמעותי במהלך העשורים הבאים וכעת הן בשימוש שגרתי במעבדת המחקר המולקולרית והאבחוני7,8,9,10,11. בעוד שתי טכניקות יש יתרונות וחסרונות, IHC מציע מספר יתרונות על ISH. למעשה, IHC הוא הרבה פחות זמן רב מאשר ISH והוא בדרך כלל פחות יקר בהתאם לעלות של הנוגדן העיקרי. בנוסף, ביטוי mRNA אינו תמיד ממדד אמין של חלבון ביטוי כפי שהוא הוכח עכברים ואנשים שרק על שליש של וריאציה שפע של חלבון ניתן להסביר על ידי mRNA שפע12. מסיבה זו, IHC היא תוספת חשובה לאישור נתוני ISH, כאשר הדבר אפשרי. לבסוף, ihc יכולים לספק נתוני התאמה לשפות משנה ולוקליזציה משותפים שאינם ניתנים לקביעה על-ידי ISH13,14,15. כאן, אנו מתארים שיטה צעד אחר צעד כדי לזהות באופן מהימן חלבונים על ידי אימונוהיסטוכימיה בכל העוברים הר דג זברה וזחלים. המטרה של טכניקה זו היא לקבוע את הביטוי המרחבי והזמני של חלבון מעניין בעובר כולו. טכנולוגיה זו משתמשת אנטיגן העיקרי נוגדנים ומתויג באמצעות נוגדנים משניים מסומנים. הפרוטוקול הוא להתאמה בקלות לשימוש על מקטעים רקמה רכוב שקופיות לשימוש עם מצעים כרומוגניים במקום של זריחה. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מדגימים כי פיתוח שריר השלד דג זברה מבטא קולטני גלוטמט ביונוספטרופי, בנוסף קולטני אצטילכולין. NMDA-type גלוטמט לקולטן תת יחידות לזיהוי על שריר האורך ב -23 hpf.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil, heavy duty</td>
			<td>Kirkland</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NMDA antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>05-598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABN832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate [Ca(NO3)2]</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Sally Hanson</td>
			<td></td>
			<td>Any nail polish or hardener may be subsituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression (concavity) slide</td>
			<td>Electron Miscroscopy Sciences</td>
			<td>71878-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1855920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, Danieau, 30%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, E2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating tube holder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>59744015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence compound microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>M165-FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 18 x 18</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22 x 60</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-050-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humid chamber with lid</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M920-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunedge pap pen</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins, size 00</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>5213323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4 &#183; 7H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh strainer</td>
			<td>Oneida</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-tube cap lock</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>145062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Toastmaster</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S02L1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBTriton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1% TritonX-100 in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (glass)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3160100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (plastic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>207250250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 1x</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1x made from 10x stock diluted in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P250-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spawning tank with lid and insert</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperBlock PBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost + slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue gel</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, ultrapure/double distilled</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W2-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה נפוצה לחקור ביטוי חלבונים ולוקליזציה במהלך מצבי התפתחות נורמלית ומחלות. למרות שפרוטוקולים אימונוהיסטוכימיה רבים הוטלו לצורך מקטעי רקמות ורקמות, פרוטוקולים אלה דורשים לעתים קרובות שינוי ואופטימיזציה עבור אורגניזמים מודל שאינם יונקים. מערכת זברפיש משמשת יותר ויותר כמערכת מודל במחקר בסיסי, ביולוגי וטרנסלזמי לחקירת מנגנוני ההתפתחות המולקולריים, הגנטיים והסלולאריים של התהליכים ההתפתחותיים. Zebrafish מציעים יתרונות רבים כמערכת מודל, אבל גם דורשים טכניקות שונות עבור זיהוי חלבון אופטימלי. כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול שלנו לגבי. פרוטוקול זה מתאר בנוסף כמה אסטרטגיות הרכבה שונות שניתן ליישם וסקירה של היתרונות והחסרונות שכל האסטרטגיה מספקת. כמו כן, אנו מתארים שינויים בפרוטוקול זה כדי לאפשר זיהוי של מצעים כרומוגניים ברקמות הר שלמות וזיהוי של קרינה ברקמת זחל מנות. פרוטוקול זה חל באופן כללי על חקר שלבים ומבנים עובריים רבים.

כל הר אימונוהיסטוכימיה משתמש בנוגדנים כדי לזהות את התבנית המרחבית של ביטוי החלבון בבעל החיים שלמים. זרימת העבודה הבסיסית של אימונוהיסטוכימיה (מתוארת באיור 1) כרוכה הרבייה דגים, העלאת והכנת העוברים, חסימת אנטיגנים שאינם ספציפיים, באמצעות נוגדנים העיקרי א?...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae at JoVE.com

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוגדן הפלורסנט בתיווך זיהוי של חלבונים בהכנות שלמות של עוברי הדגים והזחלים.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

אימונוהיסטוכימיה שלמה היא טכניקה מהירה ופשוטה יחסית המאפשרת התבוננות מרחבית וזמן של חלבונים ישירות ברקמה או באורגניזם באמצעות נוגדנים מסומנים. התועלת של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת הכתמה של רקמה שלמה או אורגניזם מבלי לאורך החלק הראשון שלה מיקרוסקופ קונפוקל יכול לשמש כדי ליצור ייצוג תלת מימדי של דפוס ביטוי החלבון. אימונוהיסטוכימיה נמצאת בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי כדי להבין את האטיולוגיה ואת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס המחלה.זהו גם כלי אבחון רב ערך לזיהוי גידולים בדגימות פתולוגיות. כדי להתחיל, להכין מיכלי השרצת מלא מי מערכת עם רשת או אניה מחוררת במקום. מניחים זוגות סקס מעורבים של דגי זברה בוגרים בקבוצות בטנקים בן לילה.השתמש במחזור אור/כהה של 14 שעות/10 שעות עם אורות דולקים בשעה 9 בבוקר.m. למחרת בבוקר, עם האורות דולקים, לשנות את מי מיכל השרץ עם מים במערכת טרייה כדי להסיר צואה. ברגע שהביצים מונחות, החזירו את המבוגרים למיכלים ביתיים.לאסוף את הביצים על ידי ציור אותם באמצעות פיפטה העברה. מעבירים 50 ביצים לכל צלחת פטרי המלאה באמצע הדרך במדיום העובר. הסר את כל הביצים אטומות ומעונן כי הם מתים או לא הצליחו לחלק.דגירה צלחת של ביצים ב 28.5 מעלות צלזיוס עד 23 שעות לאחר ההפריה. אם העוברים מבוגרים מ -24 שעות לאחר ההפריה, עם פיפטה להעביר את העוברים ל 200 PTU מיקרומולרי במדיום העובר כדי למנוע מלנוגנזה. תחת מיקרוסקופ סטריאו, dechorionate העוברים unhatched באמצעות מדחפי קצה דקים במיוחד.שימוש בפיפטות פסטר מלוטשות באש כדי למזער את הנזק, מעבירים אותן לצלחות פטרי מזכוכית או מפלסטיק מצופות 1-2% אגוזה מומסת במדיום העובר. לאחר מכן להעביר את העוברים 1.5 צינורות צנטריפוגה מיליליטר באמצעות פלסטיק או פיפטה מלוטש אש. הסר מדיום עובר עם מיקרופיגט.השאירו רק מספיק נוזלים רק כדי לכסות את העוברים. תקן את העוברים ב 4% PFA במשך שעה עד שעתיים עם נדנדה עדינה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את העוברים שלוש פעמים ב 1X PBS ו 1% PBTriton במשך חמש דקות.יש להשתמש בעוברים באופן מיידי או לאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. לאחסון ארוך טווח, התייבשו ואחסנו את העוברים ב-100% מתנול במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי rehydrate העוברים, לבצע דגירה סדרתית חמש דקות כל אחד בטמפרטורת החדר עם כמויות יורדות של מתנול PBS ו PBTriton לשטוף הסופי.המשך עם הכנת העובר על פי כתב היד. בחר פתרון חסימה התואם את המין המארח של הנוגדנים המשניים, לדוגמה 10% סרום עיזים ב- PBTriton עם או בלי שני מיליגרם למיליליטר של BSA. מוסיפים 0.5 מיליליטר של פתרון החסימה בצינור המכיל את העובר ומ מניחים את הצינור על נדנדה במשך שעה עד שלוש שעות בטמפרטורת החדר.ואז להדק את העובר בנוגדן העיקרי מדולל בתתבר חסימה PBTriton לילה בארבע מעלות צלזיוס תוך נדנדה. בבוקר, לשטוף את העובר חמש פעמים PBTriton במשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר תוך נדנדה. לאחר מכן בחרו נוגדן משני המבוסס על המין המארח של הנוגדן העיקרי ואורך הגל הרצוי ב-488 ננומטר.מוסיפים את הנוגדן המשני מדולל בתסימת חסימה לתוך הצינור המכיל את העובר. מכסים את הצינור בנייר אלומיניום ודגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר תוך כדי נדנדה. לאחר מכן, לשטוף את העוברים שלוש פעמים PBTriton במשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר בעוד מכוסה רדיד אלומיניום ונדנדה.עם פיפטה, מעבירים את העוברים לתסכולת 50%גליצרול ב- PBS מעל מיטה של 2% agarose במדיום העובר. כדי להסיר את החלמון, להעביר 200 microliters של 1X PBS לשקופית דיכאון או שקופית זכוכית רגילה. השתמש פיפטה העברת פלסטיק להעביר עובר אחד או יותר טיפת PBS.השתמש מלקחיים דקים במיוחד כפול אפס סיכות חרקים כדי לשבור את החלמון בעדינות רבה לגרד גרגירי חלמון מפני השטח הגחוני של העובר. הסר את גרגירי החלמון וחדש עם PBS לפי הצורך. לאחר ההרכבה, מניחים את הדגימה על שלב המיקרוסקופ.אתר את אזור העניין על-ידי בחירת דוגמה בהירה יחסית. כוונן את החשיפה למצלמה והשיג כך שהאות יהיה בהיר מספיק ללא רוויה. כאשר משווים בין העוברים הניסיוניים המסווים בנוגדנים לבין עוברי נוגדני בקרה, השתמש באותן הגדרות חשיפה.פרוטוקול זה של אימונוהיסטוכימיה של הר שלם הוא כלי רב ערך לחקר ביטוי חלבון מרחבי וזקתי באמצעות פיתוח זברה-דג. תת-אחת GluN1 של קולטן גלוטמט מסוג NMDA חשפה ביטוי של תת-יוניטים קולטן גלוטמט לאורך פיתוח שרירי הזברה ב 23 שעות לאחר ההפריה. חלקים קפואים של עוברי הפריה 72 שעות לאחר ההפריה הורכבו על מגלשות ו immunostained עבור פוספו-H3, סמן של תאים מתרבים.מספר תאים הביעו פוספו-H3 והביטוי היה הבולט ביותר באזורי החדר. נוגדן בקרת IgG של עכברים והדרת נוגדנים ראשוניים חשפו רמה נמוכה של ביטוי לא ספציפי. חשוב לבחור פתרונות חסימה מתאימים ונוגדנים משניים המבוססים על הנוגדנים העיקריים המארחים מינים כדי להבטיח זיהוי ולמזער כתמים לא ספציפיים.יש לאמת את האימונוהיסטוכימיה כדי להבטיח שהאות שנצפה הוא למעשה החלבון המעניין. ניסויי מעקב כרוכים בדרך כלל בשימוש באורגניזמים מהונדסים גנטית או סביבתית. אימונוהיסטוכימיה מעניקה לחוקרים את היכולת להתבונן בחלבונים במקום, ומאיצה מאוד את הבנתנו במערכות רבות בביולוגיה בסיסית ויישמת במיוחד במהלך התפתחות העוברים.מתנול ופורמלדהיד רעילים ויש לטפל בהם בזהירות. יש לאסוף פסולת ולהיפטר מהן בהתאם לנהלים המוסדיים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

שיטות לבדיקת בלוטת לימפה hemocytes ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

הדמיה וניתוח עורקי קשת והלוע באמצעות שחזור-הר אימונוהיסטוכימיה ותלת מימד

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...