Name: whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00
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एनआईएच ग्रांट 8P20GM103436 14 से फंडिंग।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित जेब्राफिश प्रजनन वयस्कों और भ्रूण के साथ काम करने की प्रक्रियाओं को मरे स्टेट यूनिवर्सिटी में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।
1. भ्रू...

<ol>
	<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. 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H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Lopez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+in+situ+Hybridization/Immunohistochemistry+(ISH/IH)+on+Free-floating+Vibratome+Tissue+Sections.">Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections.</a> Bio-protocol. 4 (18), (2014).</li><li>Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glucocorticoid+receptor+immunoreactivity+and+mRNA+in+the+rat+brain:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).</li><li>Newton, S. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).</li><li>Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+and+duodenal+homeobox-1+nuclear+localization+is+regulated+by+glucose+in+dispersed+rat+islets+but+not+in+insulin-secreting+cell+lines.">Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines.</a> Islets. 6 (4), e982376 (2014).</li><li>Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glis3+is+associated+with+primary+cilia+and+Wwtr1/TAZ+and+implicated+in+polycystic+kidney+disease.">Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).</li><li>Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+expression+and+colocalization+of+somatostatin,+carboxypeptidase-E+and+prohormone+convertases+1+and+2+in+rat+brain.">Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain.</a> Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Cheng, C. 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S., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+pancreatic+cancer+research.">Zebrafish as a model for pancreatic cancer research.</a> Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).</li><li>Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+use+of+zebrafish+to+model+metabolic+disease.">The emerging use of zebrafish to model metabolic disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).</li><li>Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+utility+of+zebrafish+models+of+neurological+and+neuropsychiatric+disorders:+A+critical+review.">The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review.</a> Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li><li>Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+as+a+weak+activator+of+aryl+hydrocarbon+receptor+inhibiting+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced+CYP1A1+transcription+in+zebrafish+embryo.">Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo.</a> Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS one. 6 (8), e22991 (2011).</li><li>Inoue, D., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+for+all--a+highly+efficient+and+versatile+method+for+fluorescent+immunostaining+in+fish+embryos.">One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos.</a> PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).</li></ol>

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री एक बहुमुखी उपकरण है जिसका उपयोग किसी जीव में ब्याज के लगभग किसी भी प्रोटीन की स्थानिक-लौकिक अभिव्यक्ति की विशेषता के लिए किया जा सकता है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग व...

जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)कम पीढ़ी के समय, तेजी से विकास और आनुवंशिक तकनीकों के लिए amenability सहित कई कारणों से जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल के रूप में उभरा है । नतीजतन, जेब्राफिश का उपयोग आमतौर पर विष विज्ञान अनुसंधान और दवा की खोज के लिए उच्च थ्रूपुट छोटे अणु स्क्रीन में किया जाता है। जेब्राफिश विकास प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक आकर्षक मॉडल भी है कि एक महिला नियमित रूप से एक समय में 50-300 अंडे का उत्पादन कर सकती है और ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट भ्रूण विकास प्रक्रियाओं के कुशल दृश्य के लिए बाहरी रूप से विकसित होते हैं। हालांकि, शुरुआती शोध ज्यादातर रिवर्स जेनेटिक तकनीकों की स्थापना में चुनौतियों के कारण एन-एथिल-एन-नाइटरोसौरिया (ENU) या अन्य म्यूटगेन्स का उपयोग करके फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन पर भरोसा करते थे । मोटे तौर पर दो दशक पहले, मॉर्पोलिनोस का उपयोग पहले जेब्राफिश में लक्षित जीन1को नॉकआउट करने के लिए किया गया था। मॉर्पोलिनो छोटे एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स हैं जो शुरुआती विकास के चरण में भ्रूण में माइक्रोइंजेक्शन के बाद लक्ष्य एमआरएनए के अनुवाद को रोकते हैं। मॉर्फोलिनोस की एक बड़ी कमजोरी यह है कि वे कोशिकाओं को विभाजित करते हैं और आम तौर पर निषेचन (एचपीएफ) के बाद 72 घंटे तक प्रभावशीलता खो देते हैं। जबकि मॉर्फोलिनो जेब्राफिश जीन व्यवधान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बने हुए हैं, प्रतिलेखन सक्रियकर्ता की तरह प्रभावक न्यूकलीज (TALENs), जिंक-फिंगर न्यूक्लोप्स (जेडएफएन), और क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (CRISPRs) का उपयोग हाल ही में जेब्राफिश जीनोम2,3को सीधे लक्षित करने के लिए किया जा रहा है। इन रिवर्स आनुवंशिक रणनीतियों, आगे आनुवंशिकी और उच्च थ्रूपुट स्क्रीन के साथ संयोजन में, जीन अभिव्यक्ति और समारोह का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल के रूप में जेब्राफिश की स्थापना की है ।
जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने की क्षमता को आम तौर पर जीन या जीन उत्पाद अभिव्यक्ति के स्थानिक-लौकिक वितरण के मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। प्रारंभिक विकास के दौरान इस तरह के अभिव्यक्ति पैटर्न की कल्पना करने के लिए दो सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली तकनीक सीटू संकरण (ISH) और पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) में हैं। सीटू संकरण में पहली बार 1969 में विकसित किया गया था और एक जीव4में एमआरएनए अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए लेबल एंटीसेंस आरएनए जांच के उपयोग पर निर्भर करता है । इसके विपरीत, लेबल एंटीबॉडी का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री में किया जाता है। पता लगाने के लिए प्रोटीन लेबलिंग का विचार 1930 के5 को वापस तिथियां और पहला आईएचसी प्रयोग १९४१ में प्रकाशित किया गया था जब FITC लेबल एंटीबॉडी संक्रमित ऊतकों6में रोगजनक बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया । ईश और आईएचसी बाद के दशकों में विकसित हुए हैं और इसमें काफी सुधार हुआ है और अब दोनों का उपयोग नियमित रूप से आणविक और नैदानिक अनुसंधान प्रयोगशाला7,8,9,10,11में किया जाता है । जबकि दोनों तकनीकों के फायदे और नुकसान हैं, आईएचसी ईश पर कई लाभ प्रदान करता है। व्यावहारिक रूप से, आईएचसी ईश की तुलना में बहुत कम समय लगता है और आम तौर पर प्राथमिक एंटीबॉडी की लागत के आधार पर कम महंगा होता है। इसके अलावा, एमआरएनए अभिव्यक्ति हमेशा प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक विश्वसनीय मीट्रिक नहीं होता है क्योंकि चूहों और मनुष्यों में यह प्रदर्शित किया गया है कि केवल एक तिहाई प्रोटीन बहुतायत भिन्नता को एमआरएनए बहुतायत12द्वारा समझाया जा सकता है। इस कारण से, आईएचसी ईश डेटा की पुष्टि करने के लिए एक महत्वपूर्ण पूरक है, जब संभव हो। अंत में, आईएचसी उपकोशिकीय और सह-स्थानीयकरण डेटा प्रदान कर सकता है जिसे ईश13,14,15द्वारा निर्धारित नहीं किया जा सकता है। यहां, हम पूरे माउंट जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा प्रोटीन का मज़बूती से पता लगाने के लिए एक कदम-दर-कदम विधि का वर्णन करते हैं। इस तकनीक का लक्ष्य पूरे भ्रूण में ब्याज के प्रोटीन की स्थानिक और लौकिक अभिव्यक्ति का निर्धारण करना है। यह तकनीक एंटीजन-विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंटी टैग माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करती है। प्रोटोकॉल आसानी से स्लाइड-घुड़सवार ऊतक वर्गों पर उपयोग करने के लिए और फ्लोरेसेंस के बदले गुणसूत्र सब्सट्रेट्स के साथ उपयोग के लिए अनुकूलनीय है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम प्रदर्शित करते हैं कि जेब्राफ़िश कंकाल मांसपेशी विकसित करना एसिटाइलकोलिन रिसेप्टर्स के अलावा आयोनोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स को व्यक्त करता है। एनएमडीए-प्रकार के ग्लूटामेट रिसेप्टर उपइकाइयों का 23 एचपीएफ पर देशीयकालीन मांसपेशी पर पता लगाया जा सकता है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil, heavy duty</td>
			<td>Kirkland</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NMDA antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>05-598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABN832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate [Ca(NO3)2]</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Sally Hanson</td>
			<td></td>
			<td>Any nail polish or hardener may be subsituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression (concavity) slide</td>
			<td>Electron Miscroscopy Sciences</td>
			<td>71878-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1855920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, Danieau, 30%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, E2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating tube holder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>59744015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence compound microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>M165-FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 18 x 18</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22 x 60</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-050-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humid chamber with lid</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M920-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunedge pap pen</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins, size 00</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>5213323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4 &#183; 7H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh strainer</td>
			<td>Oneida</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-tube cap lock</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>145062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Toastmaster</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S02L1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBTriton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1% TritonX-100 in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (glass)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3160100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (plastic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>207250250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 1x</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1x made from 10x stock diluted in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P250-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spawning tank with lid and insert</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperBlock PBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost + slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue gel</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, ultrapure/double distilled</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W2-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री सामान्य विकास और रोग दोनों राज्यों के दौरान प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है। हालांकि स्तनधारी ऊतक और ऊतक वर्गों के लिए कई इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है, इन प्रोटोकॉलों को अक्सर गैर-स्तनधारी मॉडल जीवों के लिए संशोधन और अनुकूलन की आवश्यकता होती है। जेब्राफिश का उपयोग विकास प्रक्रियाओं के आणविक, आनुवंशिक और सेल जैविक तंत्र की जांच करने के लिए बुनियादी, जैव चिकित्सा और ट्रांसलेशनल अनुसंधान में एक मॉडल प्रणाली के रूप में तेजी से किया जाता है। जेब्राफ़िश एक मॉडल प्रणाली के रूप में कई फायदे प्रदान करते हैं लेकिन इष्टतम प्रोटीन का पता लगाने के लिए संशोधित तकनीकों की भी आवश्यकता होती है। यहां, हम जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा में पूरे माउंट फ्लोरेसेंस इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए अपना प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल अतिरिक्त रूप से कई अलग-अलग बढ़ती रणनीतियों का वर्णन करता है जिन्हें नियोजित किया जा सकता है और प्रत्येक रणनीति प्रदान करने वाले लाभों और नुकसानों का अवलोकन करता है। हम इस प्रोटोकॉल में संशोधनों का भी वर्णन करते हैं ताकि पूरे माउंट ऊतक में गुणसूत्र सब्सट्रेट्स का पता लगाने और अनुभागित लार्वा ऊतकों में फ्लोरेसेंस डिटेक्शन की अनुमति दी जा सके। यह प्रोटोकॉल मोटे तौर पर कई विकासात्मक चरणों और भ्रूणीय संरचनाओं के अध्ययन पर लागू होता है।

पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अक्षुण्ण जानवर में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्थानिक पैटर्न का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करता है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के बुनियादी कार्यप?...

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Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

यहां, हम जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा की पूरी तैयारी में प्रोटीन का फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी-मध्यस्थता का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं।

जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा में पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री एक अपेक्षाकृत त्वरित और सरल तकनीक है जो लेबल किए गए एंटीबॉडी का उपयोग करके सीधे ऊतक या जीव में प्रोटीन के स्थानिक और लौकिक अवलोकन की अनुमति देती है। इस तकनीक की उपयोगिता यह है कि यह पहले अनुभाग के बिना एक अक्षुण्ण ऊतक या जीव के धुंधला होने की अनुमति देता है और प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न के त्रि-आयामी प्रतिनिधित्व उत्पन्न करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का व्यापक रूप से जैव चिकित्सा अनुसंधान में उपयोग किया जाता है ताकि रोग को कम करने वाले एटियोलॉजी और आणविक तंत्र को समझ सकें।पैथोलॉजिकल नमूनों में ट्यूमर की पहचान करने के लिए यह एक मूल्यवान नैदानिक उपकरण भी है। शुरू करने के लिए, सिस्टम पानी से भरे स्पॉन टैंक तैयार करें और जगह में एक जाल या स्लॉट लाइनर के साथ। रात भर टैंकों में समूहों में वयस्क जेब्राफिश मिश्रित सेक्स जोड़े रखें।9 ए.m पर आने वाली रोशनी के साथ 14 घंटे/10 घंटे की रोशनी/डार्क साइकिल का इस्तेमाल करें । अगली सुबह, रोशनी के साथ, मल को हटाने के लिए ताजा सिस्टम पानी के साथ स्पॉनिंग टैंक पानी बदलें। एक बार अंडे रखे जाने के बाद, वयस्कों को घर के टैंकों में वापस कर दें।एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करके उन्हें खींचकर अंडे ले लीजिए। भ्रूण माध्यम के साथ आधे रास्ते भरा प्रत्येक पेट्री पकवान के लिए ५० अंडे हस्तांतरण । किसी भी अपारदर्शी और बादल अंडे को हटा दें जो मर चुके हैं या विभाजित करने में विफल रहे हैं।निषेचन के बाद 23 घंटे तक अंडे की डिश को 28.5 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। यदि भ्रूण निषेचन के बाद 24 घंटे से पुराने हैं, एक पिपेट के साथ भ्रूण माध्यम में २०० माइक्रोमोलर पीटीयू के लिए भ्रूण हस्तांतरण मेलानोजेनेसिस को रोकने के लिए । एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, अल्ट्रा फाइन टिप संदंश का उपयोग करके अनहैच किए गए भ्रूण को डिकोरिओनेट करें।नुकसान को कम करने के लिए आग पॉलिश पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, उन्हें 1-2% के साथ लेपित ग्लास या प्लास्टिक पेट्री व्यंजनों में स्थानांतरित करना भ्रूण माध्यम में भंग हो गया। फिर प्लास्टिक या आग पॉलिश पिपेट का उपयोग करके भ्रूण को 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। एक माइक्रोपिपेट के साथ भ्रूण माध्यम निकालें।सिर्फ भ्रूण को कवर करने के लिए केवल पर्याप्त तरल छोड़ दें। कमरे के तापमान पर कोमल कमाल के साथ एक से दो घंटे के लिए 4% पीएफए में भ्रूण को ठीक करें । इसके बाद, भ्रूण को 1X पीबीएस में तीन बार और 1% PBTriton को पांच मिनट के लिए धोएं।भ्रूण का तुरंत उपयोग करें या एक सप्ताह तक चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। दीर्घकालिक भंडारण के लिए, निर्जलीकरण और शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर १००% मेथनॉल में भ्रूण स्टोर । भ्रूण को फिर से हाइड्रेट करने के लिए, अंतिम धोने के लिए मेथनॉल और पीबीएस और पीबीट्रिटन की मात्रा कम होने के साथ कमरे के तापमान पर पांच मिनट सीरियल इन्क्यूबेशन करें।पांडुलिपि के अनुसार भ्रूण की तैयारी के साथ आगे बढ़ें। माध्यमिक एंटीबॉडी होस्ट प्रजातियों से मेल खाते हुए एक अवरुद्ध समाधान का चयन करें, उदाहरण के लिए पीबट्रिटन में 10% बकरी सीरम के साथ या बीएसए के दो मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर के बिना। भ्रूण युक्त ट्यूब में अवरुद्ध समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर एक से तीन घंटे के लिए एक घुमाव पर ट्यूब जगह है।फिर प्राथमिक एंटीबॉडी में भ्रूण को अवरुद्ध समाधान और PBTriton में चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट जबकि कमाल । सुबह में, भ्रूण को पांच बार PBTriton में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रत्येक जबकि कमाल धोने । फिर प्राथमिक एंटीबॉडी की मेजबान प्रजातियों और 488 नैनोमीटर पर वांछित तरंगदैर्ध्य के आधार पर एक माध्यमिक एंटीबॉडी का चयन करें।भ्रूण युक्त ट्यूब में समाधान को अवरुद्ध करने में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब को कवर करें और कमाल करते समय कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। उसके बाद, भ्रूण को तीन बार PBTriton में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धोएं, जबकि एल्यूमीनियम पन्नी और कमाल से ढके हुए ।एक पिपेट के साथ, भ्रूण माध्यम में 2% एगर उठे के बिस्तर पर पीबीएस में 50% ग्लाइसरोल समाधान के लिए भ्रूण को स्थानांतरित करें। जर्दी को हटाने के लिए, 1X पीबीएस के 200 माइक्रोलीटर को अवसाद स्लाइड या सादे ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित करें। पीबीएस बूंद के लिए एक या एक से अधिक भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का प्रयोग करें।जर्दी को तोड़ने के लिए अल्ट्रा फाइन संदंश और डबल जीरो कीट पिन का उपयोग करें और भ्रूण की वेंट्रल सतह से जर्दी कणिकाओं को बहुत धीरे से कुरेदें। जर्दी कणिकाओं को निकालें और जरूरत के अनुसार पीबीएस के साथ भरपाई करें। बढ़ते के बाद, नमूना माइक्रोस्कोप चरण पर रखें।अपेक्षाकृत उज्ज्वल उदाहरण का चयन करके ब्याज के क्षेत्र का पता लगाएं। कैमरा एक्सपोजर को समायोजित करें और लाभ करें ताकि सिग्नल संतृप्त किए बिना पर्याप्त रूप से उज्ज्वल हो। प्रयोगात्मक एंटीबॉडी लेबल भ्रूण और नियंत्रण एंटीबॉडी भ्रूण के बीच तुलना करते समय, एक ही जोखिम सेटिंग्स का उपयोग करें ।पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का यह प्रोटोकॉल ज़ेब्राफ़िश विकास का उपयोग करके स्थानिक और लौकिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। एनएमडीए प्रकार के ग्लूटन 1 सबयूनिट ने निषेचन के बाद 23 घंटे में जेब्राफिश मांसपेशियों के विकास के दौरान ग्लूटामेट रिसेप्टर सबयूनिट की अभिव्यक्ति का खुलासा किया। ७२ घंटे के बाद निषेचन भ्रूण के जमे हुए वर्गों स्लाइड पर मुहिम शुरू की और फॉस्फो-H3, प्रसार कोशिकाओं के एक मार्कर के लिए इम्यूनोटांग थे ।कई कोशिकाओं ने फॉस्फो-एच 3 व्यक्त किया और अभिव्यक्ति वेंट्रिकुलर क्षेत्रों में सबसे उल्लेखनीय थी। माउस आईजीजी नियंत्रण एंटीबॉडी और प्राथमिक एंटीबॉडी को छोड़कर गैर-विशिष्ट अभिव्यक्ति के निम्न स्तर का पता चला। पता लगाने और गैर-विशिष्ट धुंधला को कम करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी मेजबान प्रजातियों के आधार पर उपयुक्त अवरुद्ध समाधान और माध्यमिक एंटीबॉडी का चयन करना महत्वपूर्ण है।इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को यह सुनिश्चित करने के लिए सत्यापित किया जाना चाहिए कि पाया गया संकेत वास्तव में ब्याज का प्रोटीन है। फॉलोअप प्रयोगों में आमतौर पर आनुवंशिक या पर्यावरण की दृष्टि से संशोधित जीवों का उपयोग करना शामिल होता है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री शोधकर्ताओं को सीटू में प्रोटीन का निरीक्षण करने की क्षमता प्रदान करता है, विशेष रूप से भ्रूण विकास के दौरान बुनियादी और लागू जीव विज्ञान दोनों में कई प्रणालियों की हमारी समझ को तेज करता है।मेथनॉल और फॉर्मेल्डिहाइड जहरीले होते हैं और इन्हें सावधानी से संभाला जाना चाहिए। कचरे को संस्थागत प्रक्रियाओं के अनुसार एकत्र और निपटान करने की आवश्यकता है ।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

इवांस नीले रंग की डाई के साथ zebrafish लार्वा कंकाल की मांसपेशी वफ़ादारी का विश्लेषण

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

मल्टी लक्ष्य वर्णजनीय साबुत माउंट<em&gt; बगल में</em&gt; संकरण में जीन एक्सप्रेशन डोमेन की तुलना के लिए<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; भ्रूण

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

तरीके लसीका ग्रंथि और hemocytes में जांच<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; लार्वा

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

जीवित जेबराफिश भ्रूण में बायोसेंसिंग मोटर न्यूरॉन झिल्ली संभावित

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Zebrafish में Multiciliated कोशिकाओं visualizing सीटू संकरण और इम्यूनोफ्लोरेसेंस में पूरे माउंट फ्लोरोसेंट के एक संयुक्त प्रोटोकॉल के माध्यम से

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

मात्रात्मक पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस माउस भ्रूण में कार्डियक जनक आबादी का विश्लेषण

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Gastrulating माउस में नोड और Notochordal प्लेट visualizing इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग कर भ्रूण

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

पूरे ज़ेब्राफिश भ्रूण की विस्तारित समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए एक स्तरित बढ़ते विधि

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

पूरे माउंट में सीटू संकरण में जेब्राफिश भ्रूण और ट्यूब गठन परख में iPSC-ECs में परख संवहनी विकास में एंडोग्लिन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और 3 डी पुनर्निर्माण का उपयोग करके Pharyngeal आर्क धमनियों का दृश्य और विश्लेषण

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...