Name: whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae at JoVE.com

Finanziamenti della sovvenzione NIH 8P20GM103436 14.

Le procedure per lavorare con gli adulti e gli embrioni di allevamento di pesci zebra descritti in questo protocollo sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Murray State University.
1. Raccolta e fissazione dell'embrione
<ol><li>Preparare i serbatoi di deposizione delle uova mettendo coppie di sesso misti di pesce zebra adulti o gruppi in serbatoi con una rete o fodera scanalata riempita con acqua di sistema durante la notte.</li>
	<li>All'acce...

<ol>
	<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+and+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+and+efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+the+CRISPR/Cas9+system.">Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).</li><li>van der Ploeg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+nucleic+acid+research+during+the+twentieth+century.">Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century.</a> European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).</li><li>Marrack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+Antibodies.">Nature of Antibodies.</a> Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Lopez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+in+situ+Hybridization/Immunohistochemistry+(ISH/IH)+on+Free-floating+Vibratome+Tissue+Sections.">Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections.</a> Bio-protocol. 4 (18), (2014).</li><li>Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glucocorticoid+receptor+immunoreactivity+and+mRNA+in+the+rat+brain:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).</li><li>Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+combined+immunohistochemistry+and+in-situ+hybridization+in+fresh-frozen,+cryocut+mouse+brain+sections.">A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections.</a> Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).</li><li>Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+and+duodenal+homeobox-1+nuclear+localization+is+regulated+by+glucose+in+dispersed+rat+islets+but+not+in+insulin-secreting+cell+lines.">Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines.</a> Islets. 6 (4), e982376 (2014).</li><li>Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glis3+is+associated+with+primary+cilia+and+Wwtr1/TAZ+and+implicated+in+polycystic+kidney+disease.">Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).</li><li>Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+expression+and+colocalization+of+somatostatin,+carboxypeptidase-E+and+prohormone+convertases+1+and+2+in+rat+brain.">Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain.</a> Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+preparation+for+observation+and+analysis+of+zebrafish+embryo+specimens+stained+by+whole+mount+in+situ+hybridization.">Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li><li>Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine+and+calcium+signalling+regulates+muscle+fibre+formation+in+the+zebrafish+embryo.">Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo.</a> Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).</li><li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+of+muscle+acetylcholine+receptors+requires+motoneurons+in+live+embryos,+but+not+in+cell+culture.">Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture.</a> The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).</li><li>Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotransmitter-receptor+matching+at+the+neuromuscular+junction.">Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).</li><li>Brunelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+reinnervation+through+peripheral+nerve+graft+dictates+assembly+of+glutamatergic+synapses+at+rat+skeletal+muscle.">Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).</li><li>Hans, F., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+phosphorylation+and+cell+division.">Histone H3 phosphorylation and cell division.</a> Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).</li><li>Yee, N. S., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+pancreatic+cancer+research.">Zebrafish as a model for pancreatic cancer research.</a> Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).</li><li>Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+use+of+zebrafish+to+model+metabolic+disease.">The emerging use of zebrafish to model metabolic disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).</li><li>Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+utility+of+zebrafish+models+of+neurological+and+neuropsychiatric+disorders:+A+critical+review.">The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review.</a> Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li><li>Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+as+a+weak+activator+of+aryl+hydrocarbon+receptor+inhibiting+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced+CYP1A1+transcription+in+zebrafish+embryo.">Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo.</a> Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS one. 6 (8), e22991 (2011).</li><li>Inoue, D., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+for+all--a+highly+efficient+and+versatile+method+for+fluorescent+immunostaining+in+fish+embryos.">One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos.</a> PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).</li></ol>

L'immunohistochimica è uno strumento versatile che può essere utilizzato per caratterizzare l'espressione spatio-temporale di praticamente qualsiasi proteina di interesse in un organismo. L'immunohistochimica è utilizzata su un'ampia varietà di tessuti e organismi modello. Questo protocollo è stato ottimizzato per l'uso nel pesce zebra. L'immunostochimica in specie diverse può richiedere diverse tecniche di fissazione e manipolazione, soluzioni di blocco a seconda delle specie e la presenza di perossie endogene e t...

Il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un potente modello per lo studio dei processi biologici per diversi motivi, tra cui tempi di breve generazione, rapido sviluppo e amenabilità alle tecniche genetiche. Di conseguenza, i pesci zebra sono comunemente utilizzati in schermi ad alta produttività di piccole molecole per la ricerca tossicologica e la scoperta di farmaci. Il pesce zebra è anche un modello interessante per lo studio dei processi di sviluppo, dato che una singola femmina può produrre regolarmente 50-300 uova alla volta e gli embrioni otticamente chiari si sviluppano esternamente consentendo una visualizzazione efficiente dei processi di sviluppo. Tuttavia, le prime ricerche si basavano principalmente su schermi genetici in avanti utilizzando N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) o altri mutageni a causa di sfide nello stabilire tecniche genetiche inverse. Circa due decenni fa, i morfolino sono stati utilizzati per la prima volta nei pesci zebra per abbattere i geni mirati1. I morfolino sono piccoli oligonucleotidi antisensi che inibiscono la traduzione dell'mRNA bersaglio dopo la microiniezione in un embrione in una fase di sviluppo precoce. Una delle principali debolezze dei morfemole è che vengono diluite poiché le cellule si dividono e generalmente perdono efficacia di 72 ore dopo la fecondazione (hpf). Mentre i morfolino rimangono un potente strumento per la perturbazione del gene dei pesci zebra, le nucleasi effettore (TALEN) di trascrizione attivatori, le nucleasi zinco-dita (FN) e le ripetizioni palindromiche brevi (CRISPR) raggruppate regolarmente interspaziate (CRISPR) vengono utilizzate più recentemente per colpire direttamente il genoma del pesce zebra2,3. Queste strategie genetiche inverse, in combinazione con la genetica avanzata e gli schermi ad alta velocità, hanno stabilito il pesce zebra come un potente modello per studiare l'espressione e la funzione genica.
La capacità di studiare la funzione genica richiede generalmente una valutazione della distribuzione spatio-temporale dell'espressione genica o del prodotto genico. Le due tecniche più comunemente utilizzate per visualizzare tali modelli di espressione durante lo sviluppo precoce sono l'ibridazione in situ (ISH) e l'immunohistochimica a monte intero (IHC). L'ibridazione in situ è stata sviluppata per la prima volta nel 1969 e si basa sull'uso di sonde di RNA antisenso etichettate per rilevare l'espressione di mRNA in un organismo4. Al contrario, gli anticorpi etichettati sono utilizzati nell'immunoistochimica per visualizzare l'espressione proteica. L'idea di etichettare le proteine per il rilevamento risale ai5 del 1930 e il primo esperimento IHC è stato pubblicato nel 1941 quando gli anticorpi etichettati FITC sono stati utilizzati per rilevare batteri patogeni nei tessuti infetti6. ISH e IHC si sono evoluti e migliorati in modo significativo nel corso dei decenni successivi e sono ora entrambi regolarmente utilizzati nel laboratorio di ricerca molecolare e diagnostica7,8,9,10,11. Sebbene entrambe le tecniche abbiano vantaggi e svantaggi, IHC offre diversi vantaggi rispetto a ISH. In pratica, IHC è molto meno dispendioso in termini di tempo di ISH ed è generalmente meno costoso a seconda del costo dell'anticorpo primario. Inoltre, l'espressione dell'mRNA non è sempre una metrica affidabile dell'espressione proteica, come è stato dimostrato nei topi e negli esseri umani, che solo circa un terzo della variazione dell'abbondanza proteica può essere spiegata dall'abbondanza di mRNA12. Per questo motivo, IHC è un importante integratore per confermare i dati ISH, quando possibile. Infine, IHC può fornire dati subcellulari e di co-localizzazione che non possono essere determinati da ISH13,14,15. Qui, descriviamo un metodo passo-passo per rilevare in modo affidabile le proteine mediante immunostachimica in embrioni e larve di pesci zebra di montaggio intero. L'obiettivo di questa tecnica è determinare l'espressione spaziale e temporale di una proteina di interesse per l'intero embrione. Questa tecnologia utilizza anticorpi primari specifici dell'antigene e anticorpi secondari fluorescenti. Il protocollo è facilmente adattabile all'uso su sezioni di tessuto montate su slittamenti e per l'uso con substrati cromogenici al posto della fluorescenza. Utilizzando questo protocollo, dimostriamo che lo sviluppo del muscolo scheletrico del pesce zebra esprime i recettori del glutammato ionotropico, oltre ai recettori dell'acetilcolina. Le sottounità del recettore del glutammato di tipo NMDA sono rilevabili sul muscolo longitudinale a 23 hpf.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil, heavy duty</td>
			<td>Kirkland</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NMDA antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>05-598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABN832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate [Ca(NO3)2]</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Sally Hanson</td>
			<td></td>
			<td>Any nail polish or hardener may be subsituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression (concavity) slide</td>
			<td>Electron Miscroscopy Sciences</td>
			<td>71878-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1855920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, Danieau, 30%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, E2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating tube holder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>59744015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence compound microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>M165-FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 18 x 18</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22 x 60</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-050-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humid chamber with lid</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M920-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunedge pap pen</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins, size 00</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>5213323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4 &#183; 7H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh strainer</td>
			<td>Oneida</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-tube cap lock</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>145062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Toastmaster</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S02L1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBTriton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1% TritonX-100 in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (glass)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3160100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (plastic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>207250250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 1x</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1x made from 10x stock diluted in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P250-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spawning tank with lid and insert</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperBlock PBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost + slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue gel</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, ultrapure/double distilled</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W2-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae

L'immunohistochimica è una tecnica ampiamente utilizzata per esplorare l'espressione e la localizzazione delle proteine sia durante i normali stati di sviluppo che di malattia. Sebbene molti protocolli di immunohistochimica siano stati ottimizzati per le sezioni dei tessuti e dei tessuti dei mammiferi, questi protocolli spesso richiedono modifiche e ottimizzazione per gli organismi modello non mammiferi. I pesci zebra sono sempre più utilizzati come sistema modello nella ricerca di base, biomedica e traslazionale per studiare i meccanismi biologici molecolari, genetici e cellulari dei processi di sviluppo. Il pesce zebra offre molti vantaggi come sistema modello, ma richiede anche tecniche modificate per un rilevamento ottimale delle proteine. Qui, forniamo il nostro protocollo per l'immunohistochimica a fluorescenza integrale in embrioni di pesce zebra e larve. Questo protocollo descrive inoltre diverse strategie di montaggio che possono essere impiegate e una panoramica dei vantaggi e degli svantaggi offerti da ciascuna strategia. Descriviamo anche modifiche a questo protocollo per consentire il rilevamento di substrati cromogenici nell'intero tessuto di montaggio e il rilevamento della fluorescenza nel tessuto larvale sezionato. Questo protocollo è ampiamente applicabile allo studio di molte fasi di sviluppo e strutture embrionali.

L'immunohistochimica integrale utilizza anticorpi per rilevare il modello spaziale dell'espressione proteica nell'animale intatto. Il flusso di lavoro di base dell'immunoistochimica (illustrata nella figura 1) prevede l'allevamento del pesce zebra, l'allevamento e la preparazione di embrioni, il blocco di antigeni non specifici, l'utilizzo di un antigene primario specifico dell'antigene per colpire la proteina di interesse, il rilevamento di tale anticorpo pr...

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Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Qui presentiamo un protocollo per il rilevamento fluorescente mediato da anticorpi di proteine in interi preparati di embrioni e larve di pesce zebra.

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

L'immunoistochimica a montaggio intero è una tecnica relativamente rapida e semplice che consente l'osservazione spaziale e temporale delle proteine direttamente in un tessuto o organismo utilizzando anticorpi etichettati. L'utilità di questa tecnica è che consente la colorazione di un tessuto intatto o di un organismo senza doverlo prima sezionamento e la microscopia confocale può essere utilizzata per generare una rappresentazione tridimensionale del modello di espressione proteica. L'immunoistochimica è ampiamente utilizzata nella ricerca biomedica per comprendere l'eziologia e i meccanismi molecolari che sono alla base della malattia.È anche un prezioso strumento diagnostico per identificare i tumori nei campioni patologici. Per iniziare, preparare i serbatoi di deposizione delle uova riempiti con acqua di sistema e con una rete o una fodera fessurata in posizione. Posizionare coppie di sesso misto zebrafish adulti in gruppi nei serbatoi durante la notte.Usa un ciclo chiaro/scuro di 14 ore e 10 ore con luci che si accese alle 9 del .m. La mattina seguente, con le luci accese, cambiare l'acqua del serbatoio di deposizione delle uova con acqua fresca del sistema per rimuovere le feci. Una volta deposte le uova, riportare gli adulti ai serbatoi di casa.Raccogliere le uova disegnandole utilizzando una pipetta di trasferimento. Trasferire 50 uova in ogni piastra di Petri riempita a metà strada con mezzo embrionale. Rimuovere eventuali uova opache e torbate che sono morte o non sono riuscite a dividersi.Incubare il piatto di uova a 28,5 gradi Celsius fino a 23 ore dopo la fecondazione. Se gli embrioni sono più vecchi di 24 ore dopo la fecondazione, con una pipetta trasferire gli embrioni a 200 PTU micromolare nel mezzo embrionale per prevenire la melanogenesi. Al microscopio stereo, dechorionare gli embrioni non odiati usando forcep a punta ultra fine.Utilizzando pipette Pasteur lucidate dal fuoco per ridurre al minimo i danni, trasferirle in piastre petri in vetro o plastica rivestite con 1-2% di agarosio sciolto in mezzo embrionale. Quindi trasferire gli embrioni in tubi di centrifuga da 1,5 millilitri utilizzando una pipetta in plastica o lucidata a fuoco. Rimuovere il mezzo embrionale con una micropipetta.Lasciare solo abbastanza liquido per coprire solo gli embrioni. Fissare gli embrioni in PFA al 4% per una o due ore con un dolce dondolo a temperatura ambiente. Quindi, lavare gli embrioni tre volte in 1X PBS e 1%PBTriton per cinque minuti.Utilizzare immediatamente gli embrioni o conservare a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Per la conservazione a lungo termine, disidratare e conservare gli embrioni in metanolo al 100% a meno 20 gradi Celsius. Per reidratare gli embrioni, eseguire incubazioni seriali cinque minuti ciascuna a temperatura ambiente con quantità decrescenti di metanolo e PBS e PBTriton per il lavaggio finale.Procedere con la preparazione dell'embrione secondo il manoscritto. Selezionare una soluzione di blocco corrispondente alla specie ospite dell'anticorpo secondario, ad esempio siero di capra al 10% in PBTriton con o senza due milligrammi per millilitro di BSA. Aggiungere 0,5 millilitri della soluzione di blocco nel tubo contenente l'embrione e posizionare il tubo su un rocker per una o tre ore a temperatura ambiente.Quindi incubare l'embrione in anticorpi primari diluiti in soluzione di blocco e PBTriton durante la notte a quattro gradi Celsius durante il dondolo. Al mattino, lavare l'embrione cinque volte in PBTriton per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente durante il dondolo. Quindi selezionare un anticorpo secondario in base alla specie ospite dell'anticorpo primario e alla lunghezza d'onda desiderata a 488 nanometri.Aggiungere l'anticorpo secondario diluito nella soluzione di blocco nel tubo contenente l'embrione. Coprire il tubo con un foglio di alluminio e incubare per due ore a temperatura ambiente durante il dondolo. Successivamente, lavare gli embrioni tre volte in PBTriton per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente mentre sono coperti con foglio di alluminio e dondolo.Con una pipetta, trasferire gli embrioni in una soluzione di glicerolo al 50% in PBS su un letto di 2%agarosio in mezzo embrionale. Per rimuovere il tuorlo, trasferire 200 microlitri di 1X PBS in uno scivolo di depressione o in un semplice scivolo di vetro. Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per spostare uno o più embrioni nella goccioline PBS.Utilizzare pin ultra fini e perni di insetti doppi zero per rompere il tuorlo e raschiare molto delicatamente i granuli di tuorlo dalla superficie ventrale dell'embrione. Rimuovere i granuli di tuorlo e reintegrare con PBS in base alle esigenze. Dopo il montaggio, posizionare il campione sullo stadio del microscopio.Individuare l'area di interesse selezionando un esempio relativamente luminoso. Regolare l'esposizione e il guadagno della telecamera in modo che il segnale sia sufficientemente luminoso senza saturarsi. Quando si confrontano tra gli embrioni sperimentali etichettati con anticorpi e gli embrioni anticorpali di controllo, utilizzare le stesse impostazioni di esposizione.Questo protocollo di immunoistochimica a montaggio intero è uno strumento prezioso per lo studio dell'espressione spaziale e temporale delle proteine utilizzando lo sviluppo del pesce zebra. La subunità GluN1 del recettore del glutammato di tipo NMDA ha rivelato l'espressione delle subunità del recettore del glutammato durante lo sviluppo dei muscoli zebrafish a 23 ore dopo la fecondazione. Sezioni congelate di embrioni post fecondazione di 72 ore sono state montate su scivoli e immunostained per fosfo-H3, un marcatore di cellule proliferato.Diverse cellule espresse fosfo-H3 e l'espressione era più notevole nelle zone ventricolari. L'anticorpo di controllo IgG del topo e l'esclusione degli anticorpi primari hanno rivelato un basso livello di espressione non specifica. È importante selezionare soluzioni di blocco appropriate e anticorpi secondari in base alle specie ospiti degli anticorpi primari per garantire il rilevamento e ridurre al minimo la colorazione non specifica.L'immunoistochimica deve essere verificata per garantire che il segnale osservato sia effettivamente la proteina di interesse. Gli esperimenti di follow-up di solito comportano l'uso di organismi geneticamente o modificati per l'ambiente. L'immunoistochimica garantisce ai ricercatori la possibilità di osservare le proteine in situ, accelerando notevolmente la nostra comprensione di numerosi sistemi sia nella biologia di base che applicata, in particolare durante lo sviluppo degli embrioni.Il metanolo e la formaldeide sono tossici e devono essere maneggiati con attenzione. I rifiuti devono essere raccolti e smaltiti secondo procedure istituzionali.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

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