Name: whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae at JoVE.com

NIH助成金8P20GM103436 14からの資金。

このプロトコルに記載されているゼブラフィッシュ繁殖成人および胚を扱うための手順は、マレー州立大学の機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された。
1. 胚の採取と固定
<ol><li>一晩システム水で満たされたメッシュまたはスロットライナーでタンクに大人のゼブラフィッシュ混合セックスペアまたはグループを配置することにより、産卵タンクを準備します...

<ol>
	<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+and+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+and+efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+the+CRISPR/Cas9+system.">Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).</li><li>van der Ploeg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+nucleic+acid+research+during+the+twentieth+century.">Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century.</a> European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).</li><li>Marrack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+Antibodies.">Nature of Antibodies.</a> Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Lopez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+in+situ+Hybridization/Immunohistochemistry+(ISH/IH)+on+Free-floating+Vibratome+Tissue+Sections.">Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections.</a> Bio-protocol. 4 (18), (2014).</li><li>Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glucocorticoid+receptor+immunoreactivity+and+mRNA+in+the+rat+brain:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).</li><li>Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+combined+immunohistochemistry+and+in-situ+hybridization+in+fresh-frozen,+cryocut+mouse+brain+sections.">A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections.</a> Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).</li><li>Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+and+duodenal+homeobox-1+nuclear+localization+is+regulated+by+glucose+in+dispersed+rat+islets+but+not+in+insulin-secreting+cell+lines.">Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines.</a> Islets. 6 (4), e982376 (2014).</li><li>Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glis3+is+associated+with+primary+cilia+and+Wwtr1/TAZ+and+implicated+in+polycystic+kidney+disease.">Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).</li><li>Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+expression+and+colocalization+of+somatostatin,+carboxypeptidase-E+and+prohormone+convertases+1+and+2+in+rat+brain.">Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain.</a> Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+preparation+for+observation+and+analysis+of+zebrafish+embryo+specimens+stained+by+whole+mount+in+situ+hybridization.">Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li><li>Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine+and+calcium+signalling+regulates+muscle+fibre+formation+in+the+zebrafish+embryo.">Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo.</a> Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).</li><li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+of+muscle+acetylcholine+receptors+requires+motoneurons+in+live+embryos,+but+not+in+cell+culture.">Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture.</a> The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).</li><li>Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotransmitter-receptor+matching+at+the+neuromuscular+junction.">Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).</li><li>Brunelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+reinnervation+through+peripheral+nerve+graft+dictates+assembly+of+glutamatergic+synapses+at+rat+skeletal+muscle.">Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).</li><li>Hans, F., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+phosphorylation+and+cell+division.">Histone H3 phosphorylation and cell division.</a> Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).</li><li>Yee, N. S., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+pancreatic+cancer+research.">Zebrafish as a model for pancreatic cancer research.</a> Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).</li><li>Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+use+of+zebrafish+to+model+metabolic+disease.">The emerging use of zebrafish to model metabolic disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).</li><li>Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+utility+of+zebrafish+models+of+neurological+and+neuropsychiatric+disorders:+A+critical+review.">The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review.</a> Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li><li>Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+as+a+weak+activator+of+aryl+hydrocarbon+receptor+inhibiting+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced+CYP1A1+transcription+in+zebrafish+embryo.">Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo.</a> Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS one. 6 (8), e22991 (2011).</li><li>Inoue, D., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+for+all--a+highly+efficient+and+versatile+method+for+fluorescent+immunostaining+in+fish+embryos.">One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos.</a> PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).</li></ol>

免疫組織化学は、生物に関心のあるほぼすべてのタンパク質の時空間的発現を特徴付けるために使用できる汎用性の高いツールです。免疫組織化学は、多種多様な組織およびモデル生物に使用される。このプロトコルはゼブラフィッシュでの使用のために最適化されています。異なる種の免疫組織化学は、異なる固定および取り扱い技術、種および内因性ペルオキシダーゼの存在に応じて溶?...

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、短期間、急速な発達、遺伝的手法の評価可能性など、いくつかの理由から、生物学的プロセスの研究のための強力なモデルとして登場しました。その結果、ゼブラフィッシュは、一般的に、毒性研究や創薬のためにハイスループットの低分子スクリーンで使用されています。ゼブラフィッシュはまた、単一の女性が日常的に一度に50〜300個の卵を生産することができ、光学的に透明な胚が外部的に発達し、発生過程を効率的に視覚化できることを考えると、発達プロセスの研究のための魅力的なモデルである。しかし、初期の研究は、逆遺伝的技術を確立する際の課題のために、N-エチルN-ニトロソーレ(ENU)または他の変異原体を使用して前方遺伝的スクリーンに主に依存していた。およそ20年前、ゼブラフィッシュで最初にモルフォリノが使用され、標的遺伝子1をノックダウンしました。モルフォリノスは、初期の発生段階で胚への微小注入後の標的mRNAの翻訳を阻害する小さなアンチセンスオリゴヌクレオチドである。モルフォリノの主な弱点は、細胞が分裂するにつれて希釈され、一般的に受精後72時間(hpf)によって有効性を失うことである。形態素はゼブラフィッシュ遺伝子破壊のための強力なツールであり続けるが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、およびクラスター化された定期的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート(CRISPR)は、ゼブラフィッシュゲノム2、3を直接標的にするために使用されている。これらの逆遺伝戦略は、前方遺伝学および高スループットスクリーンと組み合わせて、遺伝子発現および機能を研究するための強力なモデルとしてゼブラフィッシュを確立している。
遺伝子機能を研究する能力は、一般に、遺伝子または遺伝子産物発現の時空間的分布の評価を必要とする。初期の開発中にこのような発現パターンを視覚化するために最も一般的に使用される2つの技術は、その後のハイブリダイゼーション(ISH)と全実装免疫賦技化学(IHC)です。in in situハイブリダイゼーションは1969年に初めて開発され、生物4におけるmRNA発現を検出するために標識アンチセンスRNAプローブの使用に依存している。対照的に、標識抗体は、タンパク質発現を視覚化するために免疫組織化学に使用されます。検出用にタンパク質を標識するという考えは1930年代5年にさかのぼり、FITC標識抗体が感染組織6の病原細菌を検出するために使用された1941年に最初のIHC実験が発表されました。ISH と IHC は、その後の数十年にわたって大幅に進化し、改善し、現在では分子診断研究所7、8、9、10、11で日常的に使用されています。どちらの手法にも利点と欠点がありますが、IHC には ISH に対していくつかの利点があります。実際には、IHCはISHよりも時間がかかり、一般抗体のコストに応じて一般的に安価です。また、mRNA発現は、mRNAの豊富なmRNA量12によって約3分の1のタンパク質の存在量変動しか説明できないことがマウスおよびヒトで実証されているように、常に確実なタンパク質発現指標とは限らない。このため、IHC は可能な場合に ISH データを確認する重要な補足です。最後に、IHCは、イシュ13、14、15で決定できない細胞内および共局在データを提供することができる。ここでは、ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山中の免疫賦形化学によってタンパク質を確実に検出する段階的な方法を説明します。この技術の目的は、胚全体に目的のタンパク質の空間的および時間的発現を決定することです。この技術は、抗原特異的一次抗体と蛍光タグ付き二次抗体を利用する。このプロトコルは、スライド取り付けされた組織切片での使用や、蛍光の代わりに発泡性基質での使用に容易に適応可能です。このプロトコルを用いて、ゼブラフィッシュ骨格筋の開発は、アセチルコリン受容体に加えて、電夫グルタミン酸受容体を発現することを実証する。NMDA型グルタミン酸受容体サブユニットは、23hpfで縦筋上で検出可能である。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil, heavy duty</td>
			<td>Kirkland</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NMDA antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>05-598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABN832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate [Ca(NO3)2]</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Sally Hanson</td>
			<td></td>
			<td>Any nail polish or hardener may be subsituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression (concavity) slide</td>
			<td>Electron Miscroscopy Sciences</td>
			<td>71878-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1855920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, Danieau, 30%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, E2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating tube holder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>59744015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence compound microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>M165-FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 18 x 18</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22 x 60</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-050-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humid chamber with lid</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M920-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunedge pap pen</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins, size 00</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>5213323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4 &#183; 7H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh strainer</td>
			<td>Oneida</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-tube cap lock</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>145062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Toastmaster</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S02L1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBTriton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1% TritonX-100 in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (glass)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3160100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (plastic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>207250250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 1x</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1x made from 10x stock diluted in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P250-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spawning tank with lid and insert</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperBlock PBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost + slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue gel</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, ultrapure/double distilled</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W2-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae

免疫賦技化学は、正常な発達状態と疾患状態の両方でタンパク質の発現および局在を調べる広く使用されている技術です。多くの免疫組織化学プロトコルは哺乳類の組織および組織切片に最適化されているが、これらのプロトコルは、多くの場合、非哺乳類モデル生物の修飾および最適化を必要とする。ゼブラフィッシュは、発達過程の分子、遺伝、細胞の生物学的メカニズムを調べるための基礎的、生物医学的、および翻訳的研究のモデルシステムとしてますます使用されています。ゼブラフィッシュはモデルシステムとして多くの利点を提供しますが、最適なタンパク質検出のために修正技術も必要です。ここでは、ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全実装蛍光免疫化学に関するプロトコルを提供します。このプロトコルでは、さらに、使用できるいくつかの異なる取り付け戦略と、各戦略が提供する利点と欠点の概要について説明します。また、このプロトコルの改変により、全実装組織における発がん基質の検出と、切片された幼虫組織における蛍光検出を可能にする。このプロトコルは、多くの発達段階および胚構造の研究に広く適用可能である。

全実装免疫組織化学は、無傷の動物におけるタンパク質発現の空間パターンを検出するために抗体を使用する。免疫組織化学の基本的なワークフロー(図1に示す)は、ゼブラフィッシュの繁殖、胚の発生および調製、非特異的抗原のブロッキング、目的のタンパク質を標的とする抗原特異的一次抗体の使用、標識された二次抗体を有する一次抗体?...

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Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

ここでは、ゼブラフィッシュ胚および幼虫の全製剤におけるタンパク質の蛍光抗体媒介検出に関するプロトコルを提示する。

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

全体のマウント免疫組織化学は、標識された抗体を使用して組織または生物内のタンパク質を直接空間的および時間的に観察することを可能にする比較的迅速かつ簡単な技術です。この技術の有用性は、それを第1の切片にすることなく、無傷の組織または生物の染色を可能にし、共焦点顕微鏡を使用してタンパク質発現パターンの三次元表現を生成することができる。免疫体化学は、疾患の根源となる病因と分子メカニズムを理解するために、生物医学研究で広く使用されています。また、病理学的サンプルの腫瘍を同定するための貴重な診断ツールです。まず、システムの水で満たされた産卵タンクを準備し、メッシュまたはスロットライナーを所定の位置に置きます。一晩タンク内のグループに大人のゼブラフィッシュ混合セックスペアを配置します。14時間/10時間の明暗サイクルを使用し、9時.mにライトが点灯します。翌朝、ライトをつけた後、生卵水を新鮮なシステムの水で交換して、フェクを取り除きます。卵が産まれると、大人を自宅のタンクに戻します。転送ピペットを使用してそれらを描画することにより、卵を収集します。胚培地で半分に満たされた各ペトリ皿に50個の卵を移します。死んでいるか、分裂しなかった不透明で曇った卵を取り除きます。受精後23時間まで28.5°Cで卵の皿をインキュベートします。胚が受精後24時間より古い場合、ピペットを用いて胚培地中の200ミクロモルPTUに移してメラニン形成を防ぐ。ステレオ顕微鏡の下で、超微細な先端鉗子を使用して、孵化していない胚をデコールリアテットする。火で磨いたパスツールピペットを使用して損傷を最小限に抑え、胚培地に溶解した1〜2%のアガロースでコーティングされたガラスまたはプラスチックペトリ皿に移します。その後、プラスチックまたは火で研磨されたピペットを使用して胚を1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。マイクロピペットで胚培地を取り除きます。胚を覆うのに十分な液体だけを残してください。室温で穏やかな揺れで4%PFAで胚を1〜2時間固定します。次に、1X PBSで胚を3回、PBTritonを1%で5分間洗浄します。すぐに胚を使用するか、最大1週間摂氏4度で保存します。長期保存のために、脱水し、マイナス20°Cで100%メタノールで胚を保存します。胚を水分補給するには、最終洗浄のためにメタノールとPBSおよびPBTritonの量を減少させ、室温でそれぞれ5分間連続インキュベーションを行う。原稿に従って胚の準備を進める。BSAのミリリットル当たり2ミリグラムの有無にかかわらずPBTritonの10%ヤギ血清など、二次抗体宿主種に一致するブロッキング溶液を選択する。胚を含むチューブに0.5ミリリットルのブロッキング溶液を加え、室温で1〜3時間ロッカーにチューブを置きます。次に、ブロッキング溶液で希釈された一次抗体で胚をインキュベートし、揺れながら摂氏4度で一晩PBTritonを行います。朝、PBTritonで胚を揺らしながら室温でそれぞれ10分間5回洗浄します。次に、一次抗体の宿主種と所望の波長を488ナノメートルで基づいて二次抗体を選択する。ブロック溶液中で希釈した二次抗体を胚を含むチューブに加えます。チューブをアルミホイルで覆い、揺れながら室温で2時間インキュベートします。その後、胚をPBTritonでそれぞれ10分間洗浄し、アルミホイルで覆い、揺れ動かします。ピペットを用いて、胚培地中の2%アガロースのベッド上でPBS中の50%グリセロール溶液に胚を移す。黄身を取り除くために、1X PBSの200マイクロリットルをうつ病スライドまたはプレーンガラススライドに移します。プラスチック製の転写ピペットを使用して、1つ以上の胚をPBS液滴に移動します。超微細な鉗子と二重ゼロの昆虫ピンを使用して黄身を分解し、胚の腹側表面から黄身顆粒を非常に穏やかに削ります。黄身顆粒を取り出し、必要に応じてPBSで補充します。取り付け後、サンプルを顕微鏡のステージに置きます。比較的明るい例を選択して、対象地域を見つけます。信号が飽和することなく十分に明るくなり、カメラの露出とゲインを調整します。実験用抗体標識胚と対照抗体胚とを比較する場合は、同じ露光設定を使用する。このマウント免疫体化学全体のプロトコルは、ゼブラフィッシュの開発を用いた空間的および時間的タンパク質発現の研究に役立つツールです。NMDA型グルタミン酸受容体のGluN1サブユニットは、受精後23時間でゼブラフィッシュの筋肉を発達させるグルタミン酸受容体サブユニットの発現を明らかにした。72時間受精後の胚の凍結切片をスライドに取り付け、増殖細胞のマーカーであるホスホ-H3に対して免疫染色した。いくつかの細胞は、ホスホ-H3を発現し、その発現は心室帯で最も顕著であった。マウスIgG対照抗体および一次抗体を除くと、低レベルの非特異的発現が明らかになった。検出を確実にし、非特異的染色を最小限に抑えるためには、一次抗体宿主種に基づいて適切なブロッキング溶液および二次抗体を選択することが重要です。免疫体化学は、観察されたシグナルが実際に目的のタンパク質であることを確認する必要があります。フォローアップ実験は、通常、遺伝的または環境的に改変された生物を使用して含まれます。免疫組織化学は、研究者に、その際のタンパク質を観察する能力を与え、特に胚発生時に基礎生物学と応用生物学の両方で多くのシステムの理解を大幅に加速します。メタノールとホルムアルデヒドは有毒であり、慎重に取り扱う必要があります。廃棄物は、制度上の手続きに従って回収し、処分する必要があります。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

マルチターゲット発色ホールマウント<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションにおける遺伝子発現のドメインを比較します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

リンパ腺や血球中を調べるための方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡法の層状取り付け法

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

iPSC-ICにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

全実装免疫学化学と3D再構成を用いた咽頭弓動脈の可視化と解析

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...