Name: whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae at JoVE.com

NIH 보조금 8P20GM103436 14.

이 프로토콜에 설명된 제브라피쉬 사육 성인 및 배아와 함께 작업하는 절차는 머레이 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 배아 수집 및 고정
<ol><li>하룻밤 동안 시스템 물로 채워진 메쉬 또는 슬롯 라이너와 탱크에 성인 제브라피쉬 혼합 섹스 쌍 또는 그룹을 배치하여 산란 탱크를 준비합니다.</li>
	<li>불이 켜진 경우, 산란 탱크 물을 변경?...

<ol>
	<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+and+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+and+efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+the+CRISPR/Cas9+system.">Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).</li><li>van der Ploeg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+nucleic+acid+research+during+the+twentieth+century.">Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century.</a> European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).</li><li>Marrack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+Antibodies.">Nature of Antibodies.</a> Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Lopez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+in+situ+Hybridization/Immunohistochemistry+(ISH/IH)+on+Free-floating+Vibratome+Tissue+Sections.">Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections.</a> Bio-protocol. 4 (18), (2014).</li><li>Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glucocorticoid+receptor+immunoreactivity+and+mRNA+in+the+rat+brain:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).</li><li>Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+combined+immunohistochemistry+and+in-situ+hybridization+in+fresh-frozen,+cryocut+mouse+brain+sections.">A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections.</a> Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).</li><li>Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+and+duodenal+homeobox-1+nuclear+localization+is+regulated+by+glucose+in+dispersed+rat+islets+but+not+in+insulin-secreting+cell+lines.">Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines.</a> Islets. 6 (4), e982376 (2014).</li><li>Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glis3+is+associated+with+primary+cilia+and+Wwtr1/TAZ+and+implicated+in+polycystic+kidney+disease.">Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).</li><li>Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+expression+and+colocalization+of+somatostatin,+carboxypeptidase-E+and+prohormone+convertases+1+and+2+in+rat+brain.">Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain.</a> Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+preparation+for+observation+and+analysis+of+zebrafish+embryo+specimens+stained+by+whole+mount+in+situ+hybridization.">Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li><li>Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine+and+calcium+signalling+regulates+muscle+fibre+formation+in+the+zebrafish+embryo.">Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo.</a> Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).</li><li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+of+muscle+acetylcholine+receptors+requires+motoneurons+in+live+embryos,+but+not+in+cell+culture.">Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture.</a> The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).</li><li>Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotransmitter-receptor+matching+at+the+neuromuscular+junction.">Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).</li><li>Brunelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+reinnervation+through+peripheral+nerve+graft+dictates+assembly+of+glutamatergic+synapses+at+rat+skeletal+muscle.">Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).</li><li>Hans, F., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+phosphorylation+and+cell+division.">Histone H3 phosphorylation and cell division.</a> Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).</li><li>Yee, N. S., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+pancreatic+cancer+research.">Zebrafish as a model for pancreatic cancer research.</a> Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).</li><li>Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+use+of+zebrafish+to+model+metabolic+disease.">The emerging use of zebrafish to model metabolic disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).</li><li>Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+utility+of+zebrafish+models+of+neurological+and+neuropsychiatric+disorders:+A+critical+review.">The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review.</a> Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li><li>Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+as+a+weak+activator+of+aryl+hydrocarbon+receptor+inhibiting+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced+CYP1A1+transcription+in+zebrafish+embryo.">Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo.</a> Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS one. 6 (8), e22991 (2011).</li><li>Inoue, D., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+for+all--a+highly+efficient+and+versatile+method+for+fluorescent+immunostaining+in+fish+embryos.">One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos.</a> PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).</li></ol>

면역화학은 유기체에 관심 있는 거의 모든 단백질의 주공간적 발현을 특성화하는 데 사용할 수 있는 다목적 도구이다. 면역 조직 화학은 다양한 조직 및 모델 유기체에 사용됩니다. 이 프로토콜은 제브라피시에 사용하도록 최적화되었습니다. 상이한 종의 면역조직화학은 조직의 두께 및 조성으로 인한 종 및 내인성 과산화증의 존재에 따라 다른 고정 및 취급 기술, 차단 용액을 필요로 할 수 있습...

제브라피쉬(Daniorerio)는짧은 생성 시간, 급속한 발달 및 유전 기술의 어메니티를 포함한 여러 가지 이유로 생물학적 과정의 연구를 위한 강력한 모델로 부상했습니다. 그 결과, 제브라피쉬는 독성 연구 및 약물 발견을 위해 처리량이 높은 소분자 스크린에 일반적으로 사용됩니다. Zebrafish는 한 번에 50-300 개의 알을 일상적으로 생산할 수 있고 광학적으로 명확한 배아가 외부에서 개발되어 개발 과정의 효율적인 시각화를 허용하는 것을 감안할 때 개발 프로세스 연구를위한 매력적인 모델입니다. 그러나, 초기 연구는 역유전 기술을 확립하는 도전 때문에 N-ethyl-N-n-n-nitrosourea (ENU) 또는 그밖 돌연변이원을 사용하여 앞으로 유전 스크린에 주로 의존했습니다. 대략 2십년 전, morpholinos는 표적으로 한 유전자를 녹다운하기 위하여 zebrafish에서 처음으로 이용되었습니다1. 모르폴리노는 초기 발달 단계에서 배아로 미세 주입 다음 표적 mRNA의 번역을 억제하는 작은 안티센스 올리고뉴클레오티드입니다. morpholinos의 주요 약점은 세포가 분열하고 일반적으로 72 시간 후 수정 (hpf)에 의해 효과를 잃을 때 희석된다는 것입니다. 모르폴리노는 제브라피시 유전자 파괴를 위한 강력한 도구로 남아 있지만, 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴클레아제(TALENs), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFNs), 클러스터된 정기적으로 간격이 짧은 팔린드로믹 반복(CRISPRs)이 최근에는 제브라피시 게놈2,3을직접 표적으로 하는 데 사용되고 있다. 이러한 역유전적 전략은 전방 유전학 및 높은 처리량 스크린과 함께 유전자 발현 및 기능을 연구하는 강력한 모델로 zebrafish를 확립했습니다.
유전자 기능을 연구하는 능력은 일반적으로 유전자 또는 유전자 생성물 발현의 시간적 분포에 대한 평가를 필요로 한다. 초기 발달 도중 그 같은 발현 패턴을 구상하기 위하여 일반적으로 이용되는 2개의 기술은 기업 혼성화 (ISH) 및 전체 마운트 면역성 화학 (IHC)에서 입니다. situ 혼성화는 1969년에 처음 개발되었고 유기체4에서mRNA 발현을 검출하기 위해 표지된 안티센스 RNA 프로브의 사용에 의존한다. 대조적으로, 표지된 항체는 단백질 발현을 구상하기 위하여 면역성 화학에서 이용됩니다. 검출을 위한 단백질 표지의 아이디어는 1930년대5로 거슬러 올라가고 첫번째 IHC 실험은 FITC 표지된 항체가 감염한 조직에 있는 병원성 박테리아를 검출하기 위하여 이용될 때 1941년에 간행되었습니다6. ISH와 IHC는 이후 수십 년 동안 크게 진화하고 개선되었으며 현재 분자 및 진단 연구 실험실7,8,9,10,11에서일상적으로 사용됩니다. 두 기술 모두 장점과 단점이 있지만 IHC는 ISH에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 실질적으로, IHC는 ISH보다 훨씬 적은 시간이 소요되며 일반적으로 1차 항체의 비용에 따라 저렴하다. 또한, mRNA 발현은 항상 단백질 풍부도의 약 3분의 1만이 mRNA풍부도 12에의해 설명될 수 있다는 것을 마우스 및 인간에서 입증된 바와 같이 단백질 발현의 신뢰할 수 있는 메트릭이 아니다. 이러한 이유로 IHC는 가능한 경우 ISH 데이터를 확인하는 중요한 보충 자료입니다. 마지막으로, IHC는 ISH13,14및15로결정할 수 없는 세포내 및 공동 지역화 데이터를 제공할 수 있습니다. 여기서, 우리는 제브라피시 배아 및 유충 전체에서 면역조직화학에 의해 단백질을 안정적으로 검출하는 단계별 방법을 설명한다. 이 기술의 목적은 전체 배아에서 관심 있는 단백질의 공간적 및 시간적 발현을 결정하는 것이다. 이 기술은 항원 특이적 1 차 항체 및 형광 태그이 붙은 이차 항체를 이용합니다. 이 프로토콜은 슬라이드 장착 조직 섹션에 사용하고 형광 대신 발색 기질과 함께 사용하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 제브라피시 골격 근을 개발하는 것은 아세틸 콜린 수용체 이외에, ionotropic 글루타메이트 수용체를 표현한다는 것을 보여줍니다. NMDA 형 글루타메이트 수용체 소단위는 23 hpf에서 세로 근육에서 검출할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil, heavy duty</td>
			<td>Kirkland</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NMDA antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>05-598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABN832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate [Ca(NO3)2]</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Sally Hanson</td>
			<td></td>
			<td>Any nail polish or hardener may be subsituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression (concavity) slide</td>
			<td>Electron Miscroscopy Sciences</td>
			<td>71878-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1855920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, Danieau, 30%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, E2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating tube holder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>59744015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence compound microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>M165-FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 18 x 18</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22 x 60</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-050-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humid chamber with lid</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M920-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunedge pap pen</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins, size 00</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>5213323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4 &#183; 7H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh strainer</td>
			<td>Oneida</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-tube cap lock</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>145062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Toastmaster</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S02L1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBTriton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1% TritonX-100 in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (glass)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3160100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (plastic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>207250250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 1x</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1x made from 10x stock diluted in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P250-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spawning tank with lid and insert</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperBlock PBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost + slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue gel</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, ultrapure/double distilled</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W2-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae

면역 조직 화학은 일반적인 발달 및 질병 상태 둘 다 도중 단백질 발현 그리고 현지화를 탐구하기 위하여 널리 이용되는 기술입니다. 많은 면역 조직 화학 프로토콜이 포유류 조직 및 조직 섹션에 최적화되었지만, 이러한 프로토콜은 종종 비 포유류 모델 유기체에 대한 수정 및 최적화가 필요합니다. Zebrafish는 발달 과정의 분자, 유전 및 세포 생물학적 메커니즘을 조사하기 위해 기본, 생물 의학 및 번역 연구에서 모델 시스템으로 점점 더 많이 사용되고 있습니다. Zebrafish는 모델 시스템으로서 많은 이점을 제공하지만 최적의 단백질 검출을 위해 수정된 기술이 필요합니다. 여기에서, 우리는 zebrafish 배아 및 애벌레에 있는 전체 마운트 형광 면역성 화학을 위한 우리의 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 사용할 수 있는 여러 가지 장착 전략과 각 전략이 제공하는 장점과 단점에 대한 개요를 설명합니다. 우리는 또한 단면된 애벌레 조직에서 전체 마운트 조직 및 형광 검출에 있는 발색성 기단의 검출을 허용하기 위하여 이 프로토콜에 수정을 기술합니다. 이 프로토콜은 많은 발달 단계 및 배아 구조의 연구에 광범위하게 적용 가능하다.

전체 마운트 면역히스토화학은 항체를 사용하여 손상되지 않은 동물에서 단백질 발현의 공간 패턴을 검출합니다. 면역히스토화학의 기본 워크플로우(그림 1에묘사됨)는 제브라피시 사육, 배아 사육, 배아 사육 및 준비, 비특이적 항원 차단, 항원 특이적 1차 항체를 사용하여 관심 있는 단백질을 표적으로 하고, 표지된 이차 항체로 1차 항체를 검출하?...

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Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

여기에서, 우리는 zebrafish 배아 및 애벌레의 전체 준비에 있는 단백질의 형광 항체 중재한 검출을 위한 프로토콜을 제시합니다.

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

전체 마운트 면역 조직 화학은 표지된 항체를 사용하여 조직 또는 유기체에서 직접 단백질의 공간 및 측현관찰을 허용하는 비교적 빠르고 간단한 기술이다. 이 기술의 유용성은 제1단을 단면할 필요 없이 온전한 조직 또는 유기체의 염색을 허용하고 공초점 현미경 검사를 사용하여 단백질 발현 패턴의 3차원 표현을 생성하는 데 사용될 수 있다는 것이다. 면역히스토케는 질병의 근간이 되는 병인학 및 분자 메커니즘을 이해하기 위해 생의학 연구에서 널리 사용됩니다.그것은 또한 병리학 적인 견본에 있는 종양을 확인하는 귀중한 진단 공구입니다. 먼저 시스템 워터와 메쉬 또는 슬롯 라이너로 채워진 산란 탱크를 준비합니다. 하룻밤 탱크에 그룹으로 성인 제브라 피시 혼합 섹스 쌍을 배치합니다.14시간/10시간 빛/어두운 주기를 사용하여 9a.m 켜집니다. 다음 주 아침, 불이 켜진 후 산란 탱크 물을 신선한 시스템 물로 바꿔 대변을 제거합니다. 계란이 놓이면 성인을 홈 탱크로 돌려놓습니다.전송 파이펫을 사용하여 계란을 끌어서 수집합니다. 50개의 달걀을 배아 배지로 반쯤 채워진 각 페트리 요리에 옮긴다. 죽었거나 분열하지 못한 불투명하고 흐린 계란을 제거하십시오.수정 후 23 시간까지 28.5섭씨에서 계란 의 접시를 배양하십시오. 배아가 수정 후 24시간 이상 더 오래된 경우, 피펫이 배아 배지에서 200 마이크로몰라 PTU로 배아를 전달하여 멜라노발생을 예방한다. 스테레오 현미경으로 초미세 팁 집게를 사용하여 해치지 않은 배아를 비초합니다.불을 닦은 파스퇴르 파이펫을 사용하여 손상을 최소화하고, 배아 매체에 용해된 1-2%의 아가로즈로 코팅된 유리 또는 플라스틱 페트리 접시로 옮겨넣습니다. 그런 다음 플라스틱 또는 화재 광택 파이펫을 사용하여 배아를 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. 마이크로피펫으로 배아 배지를 제거합니다.배아를 덮기위해 충분한 액체만 둡니다. 실온에서 부드러운 흔들림으로 1~2시간 동안 4%의 PFA로 배아를 수정합니다. 다음으로, 배아를 1X PBS에서 3회, PBTriton은 5분간 세척합니다.배아를 즉시 사용하거나 최대 1주일 동안 섭씨 4도에 보관하십시오. 장기 보관을 위해, 탈수하고 영하 20도에서 100% 메탄올에 배아를 저장합니다. 배아를 재수화하려면 최종 세척을 위해 메탄올및 PBS 및 PBTriton의 양이 감소하여 실온에서 각각 5분 씩 직렬 배큐어를 수행하십시오.원고에 따라 배아 준비를 진행한다. 예를 들어 PBTriton의 10%염소 혈청과 BSA의 밀리리터당 2밀리그램 이내염소 혈청과 일치하는 차단 용액을 선택한다. 배아가 들어 있는 튜브에 블로킹 용액의 0.5 밀리리터를 추가하고 실온에서 1~3시간 동안 로커에 튜브를 놓습니다.그런 다음 1 차적인 항체에 있는 배아를 흔들면서 섭씨 4도에서 막는 용액및 PBTriton 에 희석된 배양합니다. 아침에는 PBTriton에서 배아를 5회 씩 흔들어 보며 실온에서 각각 10분 동안 세척합니다. 그런 다음 488 나노미터에서 1차 항체 및 원하는 파장의 숙주 종에 기초하여 이차 항체를 선택한다.배아를 포함하는 관에 차단 용액에 희석된 이차 항체를 추가합니다. 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 흔들면서 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오. 그 후, 알루미늄 호일과 흔들로 덮여있는 동안 실온에서 각각 10 분 동안 PBTriton에서 배아를 세 번 씻으라.파이펫을 사용하면 배아 배지에서 2%의 아가로즈를 침대 위로 PBS에서 50% 글리세롤 용액으로 배아를 전달합니다. 노른자를 제거하려면 1X PBS의 200 마이크로리터를 우울증 슬라이드 또는 일반 유리 슬라이드로 옮기십시오. 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 하나 이상의 배아를 PBS 액적으로 이동합니다.초미세 집게와 이중 제로 곤충 핀을 사용하여 노른자를 분해하고 배아의 복부 표면에서 노른자 과립을 매우 부드럽게 긁어냅니다. 노른자 과립을 제거하고 필요에 따라 PBS로 보충하십시오. 장착 후 현미경 단계에 샘플을 놓습니다.비교적 밝은 예제를 선택하여 관심 영역을 찾습니다. 카메라 노출을 조정하고 게인을 조정하여 신호가 포화 없이 충분히 밝을 수 있도록 합니다. 실험적인 항체 표지배아 사이를 비교할 때 항체 배아를 통제할 때, 동일 노출 설정을 사용합니다.전체 마운트 면역 히스토케의 이 프로토콜은 제브라피시 발달을 이용한 공간 및 측두단백질 발현연구를 위한 귀중한 도구이다. NMDA 형 글루타민산체의 GluN1 서브유닛은 수정 후 23시간 후 제브라피시 근육을 개발하는 동안 글루타민산 수용체 하위 단위의 발현을 드러냈다. 72시간 후 수정 배아의 냉동 섹션은 슬라이드에 장착되고 확산 되는 세포의 마커인 인-H3를 위해 면역 염색되었습니다.몇몇 세포는 인-H3를 발현하고 발현은 심실 영역에서 가장 주목할 만했습니다. 마우스 IgG 대조체 항체 및 1차 항체를 제외한 것은 비특이적 발현의 낮은 수준을 드러냈다. 검출을 보장하고 비특이적 얼룩을 최소화하기 위해 1차 항체 호스트 종을 기반으로 적절한 차단 용액과 이차 항체를 선택하는 것이 중요합니다.면역히스토케는 관찰된 신호가 실제로 관심 있는 단백질인지 확인하기 위해 검증되어야 한다. 후속 실험은 일반적으로 유전자 또는 환경적으로 변형된 유기체를 사용하는 것을 포함합니다. 면역 히스토케는 연구원에게 그 자리에서 단백질을 관찰할 수 있는 능력을 부여하며, 특히 배아 발달 중에 기본 및 적용 생물학 모두에서 수많은 시스템에 대한 이해를 크게 가속화합니다.메탄올과 포름알데히드는 독성이 있으며 신중하게 처리해야합니다. 폐기물은 제도적 절차에 따라 수거및 폐기해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

연구

발생학

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

멀티 타겟 원체 전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

방법은 림프 글 랜드와 혈구 세포에서를 검사합니다<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

전체 마운트 면역 조직 화학 및 3D 재건을 사용하여 인두 아치 동맥의 시각화 및 분석

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...